Khóa luận Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA NÔNG HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
“Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam
virus ”
Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường
Họ và tên
Lớp
: Hà Văn Dũng
: BVTVB-K55
: Bảo vệ thực vật
Chuyên ngành
Hà Nội-2014
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài những nỗ lực của bản
thân, tôi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và quý báu từ nhiều tập thể
và cá nhân.
Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy
TS. Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới –
Trường Học viện nông nghiệp Việt Nam, Phó khoa Nông học và Ths. Trần Thị
Như Hoa - Phó giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp
hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành báo cáo.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc
Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp Việt
Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cô giáo trong bộ
môn bệnh cây cũng như các Thầy cô trong khoa Nông học, Trường Học viện
nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian
tôi học tập tại trường.
Cuối cùng tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè
đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng như hoàn thành báo
cáo này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014
Sinh viên
Hà Văn Dũng
MỤC LỤC
1 ĐẶT VẤN ĐỀ ..............................................................................................................................11
1.1 Giới thiệu...............................................................................................................................11
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ........................................................................................12
1.2.1 Mục tiêu.........................................................................................................................12
1.2.2 Yêu cầu..........................................................................................................................12
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................................................13
2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua..................................................................................13
2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus.................................................................................13
2.2.1 Đặc điểm hình thái......................................................................................................14
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus........................................................................14
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A ..................................................................................15
2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B...................................................................................16
2.2.5 Đặc điểm của vùng IR ...............................................................................................16
2.2.6 Phân loại các Begomovirus ......................................................................................17
2.2.7 Tái sinh của Begomovirus ........................................................................................17
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus........................................................................18
2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền...................................................................19
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra..............................................................20
2.2.11 Phòng chống.................................................................................................................21
2.3 Một số begomovirus hại cà chua.....................................................................................22
2.4 Một số begomovirus hại ớt...............................................................................................23
2.5 Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR.........................................................................................23
2.5.1 Giới thiệu và nguyên lý .............................................................................................23
2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication) .................................................................24
2.7 Kĩ thuật Agroinoculation ..................................................................................................25
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................28
3.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................................28
3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện................................................................28
3.2.1 Địa điểm nghiên cứu ..................................................................................................28
3.3 Thời gian thực hiện.............................................................................................................28
3.4 Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................................28
PepYLCVNV...............................................................................................................................30
3.4.4 Chất kháng sinh..........................................................................................................32
3.4.5 Hóa chất, dung dịch đệm...........................................................................................32
3.4.6 Kit thương mại.............................................................................................................33
3.4.7 Môi trường....................................................................................................................33
3.4.8 Các thiết bị chủ yếu....................................................................................................33
3.4.9 Dụng cụ nghiên cứu....................................................................................................34
3.5 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................34
3.5.1 Phương pháp điều tra đồng ruộng...........................................................................34
3.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới........................................................................................35
3.5.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR .................................................................35
3.5.6 Tinh chiết sản phẩm điện di .....................................................................................40
3.5.7 Xây dựng cấu trúc xâm nhiễm.................................................................................40
3.5.8 Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến..............................................................41
phương pháp sốc nhiệt...............................................................................................................41
3.5.11 Tinh chiết plasmid.......................................................................................................42
3.5.17 Đánh giá tính gây bệnh..............................................................................................47
3.5.18 Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn..........................................................................48
3.5.19 Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA.............................................................49
đoạn 2012-2013 bằng phương pháp ELISA ........................................................................53
đoạn 2012-2013 bằng phản ứng PCR....................................................................................55
thuật agroinoculation......................................................................................................................58
PepYLCVNV...............................................................................................................................58
Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV
.................................................................................................................................................................59
Agroinoculation...........................................................................................................................61
phấn ..................................................................................................................................................69
4.4.1 Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV....................................................72
4.4.2 Chuẩn bị vector pCAMBIA2300............................................................................74
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................................................82
5.1 Kết luận..................................................................................................................................82
5.2 Kiến nghị...............................................................................................................................82
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................0
6.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT.....................................................................................................0
6.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH .....................................................................................................0
6.3 CÁC TRANG WEB.............................................................................................................4
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Từ viết tắt
A. tumefaciens
AS
Agrobacterium tumefaciens
Acetosyringone
ATP
Adenosine triphosphate
Base pair
Bb
CP
Capsid protein
CTAB
ddNTP
DNA
Dntp
dsDNA
E.coli
EDTA
ICTV
IR
Cetryl Ammonium Bromide
Dideoxynucleoside triphosphate
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleoside triphosphate
Double strand DNA
Escherichia coli
Ethylene diamine tetra acetic acid
International Committee on Taxonomy of Viruses
Itergenic region
Kb
Kilo base
LB
Luria and Bertani
ORF
PCR
Open reading frame
Polymerase Chain Reaction
Rolling circle amplification
Restriction enzyme
RCA
RE
Rep
Replication protein
RNA
Rnase
SDS
Ribonucleic acid
Ribonuclease
Sodium Dodecyl Sulphate
Singe strand DNA
SsDNA
TAE
Taq
Tris – acetate – EDTA
Thermus aquatic
Vir
Virulence region
β- ME
Beta- Mercaptoethanol
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.4. Cây thí nghiệm.........................................................................................43
Bảng 3.3. Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013) .........................................................44
Bảng 3.1. Thang phân cấp bệnh...............................................................................50
Hồng Lan (T20) .......................................................................................................79
thị. ............................................................................................................................80
trên giống cà chua Hồng Lan (T20).........................................................................82
trên giống ớt Hiểm Lai F1-207 ................................................................................82
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình thái của begomovirus ......................................................................11
Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci ...........................................................................18
Hình 3.1. Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A..................................................................28
BegoA – Rev1..........................................................................................................54
Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của
PepYLCVNV...........................................................................................................56
nuôi trong LB – lỏng................................................................................................58
dụng kỹ thuật RCA ..................................................................................................70
Hình 4.4. Sơ đồ vector pCAMBIA2300 ..................................................................71
TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về
begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây
bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.
Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông qua
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thời chúng tôi tiến hành lây
nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn..
Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện
trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm phát
hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của
begomovirrus trên ớt tại miền Bắc.
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV.
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ
Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra với cây trồng.
Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các
virus thuộc chi Begomovirus có phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình
chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên
đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn.
Begomovirus có thể có bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ
gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử
DNA-A đã gây triệu chứng điển hình, còn ở một số loại cấy khác thì cần có cả
phân tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh.
Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều có các triệu chứng đặc trưng,
điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá
nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ có
thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử
Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của
begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt
Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có
Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá
cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có
mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu
chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà
Nội) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu
tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một loài
begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam
virus (PepYLCVNV).
Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng
nhiễm tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát
hiện được một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quan
trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các
cây trồng quan trọng của Việt Nam.
Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh
học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu.
Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt
Nam virus”
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục tiêu
Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại
miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus.
1.2.2 Yêu cầu
- Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội,
Hưng Yên.
- Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình
- Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và
cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước.
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
vector bọ phấn.
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tầm quan trọng của ớt và cà chua
Cây ớt là một loại quả của cây cây thuộc chi Capsicum của họ Cà
(Solanaceae). Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nó được trồng khắp nơi trên
thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Độ là nước sản
xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng
Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) có 1 triệu bao ớt. Ở Việt Nam, ớt là một gia vị
thường xuyên có mặt trong các bữa ăn, ngoài ra ớt còn có rất nhiều công dụng
như: cải thiện hệ tiêu hóa, giảm cân, chữa bệnh ung thư, ngừa tai biến mạch, tăng
sức đề kháng.
Cà chua (S.lycopersicum) có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nó được người Tây
Ban Nha lan truyền tới Pilippine, Đông Nam Á và toàn bộ Châu Á, cuối cùng là
Châu Âu. Cà chua là loài trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150
triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc
là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng toàn cầu,
tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90%
Cũng như ớt, ở nước ta cà chua là một gia vị hay có trong mỗi bữa ăn, bởi cà chua
là một thực rất giàu : Nước (chiếm 93 đến 95 % ), giàu nguyên tố khoáng,và
vitamine A, C, và E. Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhóm của
caroténoïdes, như β-carotène cho một hoạt chất tiền vitamine A rất có lợi cho sức
khỏe.
2.2 Đặc điểm chung của Begomovirus
Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ
Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng loài (198 loài
vào năm 2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng.
Tất cả các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều không
truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia
2.2.1 Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử
(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1
tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo
ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này
không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein
vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein
(pentameric capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị
Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh:
www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus
Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước
khoảng 2,6- 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi
là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A
Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus (Nguồn
ảnh: www.expasy.ch)
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A
Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame)
được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có
hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo
vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus
vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen
AV2 mã hóa Protein có chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và
tích lũy DNA của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng
virus) gồm có 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đó, gen AC1 mã hóa protein
tái sinh (Rep protein) có chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình
tái sinh và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2
(TrAP- Transcriptional Activator Protein) mã hóa Protein hoạt hóa phiên mã có
chức năng ức chế phản ứng phòng thủ của cây. Gen AC3 mã hóa protein tăng
cường tái sinh (REn- Replication Enhancer) có chức năng tương tác với prote ký
chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hóa protein có chức năng liên quan tới
phổ ký chủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ
Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus
(http://wcrc.confex.com)
2.2.4 Cấu trúc của phân tử DNA-B.
DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp
theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều
ngược kim đồng hồ chứa gen BC1.
BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) có chức năng
chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nó không liên
quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được
kiểm soát bởi CP.
BC1 là một protein vận chuyển : (MP- Movement protein) có chức năng
vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ.
DNA-B
BV1 (NSP)
~2.7kb
BC1 (MPB)
2.2.5 Đặc điểm của vùng IR
Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2
vùng gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNA-A và DNA-B. Vùng này có
chứa nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron)
cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thòng lọng
(stem-loop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus.
Vị trí T7 – C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus
trong quá trình tái sinh.
Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng
150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng
CR có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn
gốc tái sinh nằm trên vùng này. Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNA-B
không thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có sự nhận biết và cắt- nối của
2.2.6 Phân loại các Begomovirus
Begomovirus được chia làm hai nhóm chính là nhóm Tân thế giới (New
world) bao gồm Châu Mỹ và nhóm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đông
Các begomovirus của hai nhóm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt
nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều có bộ
gen kép, trong khi đó các begomovirus ở cụm Cựu thế giới có cả bộ gen đơn và
kép, thêm vào đó tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới có thêm một gen
AV2 trên DNA-A, gen này không tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới
(Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus ở cụm Tân thế giới có
chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hóa bởi gen AV1, chuỗi này
Rybicki (1994) dự đoán rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ
có thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày
nay. Các virus này sau đó tiến hóa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu
thế giới.
2.2.7 Tái sinh của Begomovirus
Begomovirus tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism).
Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào
hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gen có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng
kép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một
sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ. (2) Pha tái
sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại
chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase
của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep
lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới
được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng.
Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn
mạch vòng hoàn chỉnh.
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus
Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên
ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào
già cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại
cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ
dinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của
bệnh do các begomovirus. Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2-4
tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một
chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có
thể đã được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp
khoảng một phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì
những lý do trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây
thoái hoá. Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợi
cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở
nước ta những năm 1960. (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012)
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá
không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá
cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và
nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ,
hè.
Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua
(httpwww.avrdc.org)
2.2.9 Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền
Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci)
theo kiểu bền vững tuần hoàn (persistant- circulant). Bọ phấn Bemisa tabaci
Gennadius (1989) thuộc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bộ cánh đều (Homotera).
Cho đến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn được công nhận đó là:
Bemisia tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii được tìm thấy
nhiều ở Hoa kỳ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quốc, … Sự khác
nhau giữa hai loài bọ phấn này là B. argentifolii ăn tạp, mắn đẻ hơn, gây rối loạn
độc tố cho cây trồng.
Theo Navot và cộng sự (1991), bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành một
vòng đời khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiện thích hợp. Trung bình có khoảng 11 –
15 lứa/năm. Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiện khô và nóng, mưa nhiều làm
giảm mật độ bọ phấn, chúng thường chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiều
mát. Để tránh ánh sáng mặt trời bọ phấn núp vào mặt dưới của lá, điều này phù
hợp với phân bố chủ yếu ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ
phấn. Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem.
Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới
tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Chúng hút dịch cây trong khoảng
15 – 30 phút và tiềm ẩn trong cơ thể chúng là 8-24 giờ (thời gian để virus nâng
cao nồng độ trong bọ phấn) là chúng có khả năng truyền bệnh, khoảng thời gian
để chúng truyền ngắn nhất là 15 phút (EPPO/CABI, 1996). Thời gian chích hút
của bọ phấn dài hơn thời gian truyền dịch virus sang cây khỏe và thời gian tiềm
ẩn là 21 giờ. Bọ phấn hút dịch cây ở giai đoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởng
thành chúng có thể truyền nhiễm bệnh virus theo hệ thống và không truyền lại
cho đời sau. Có thể phát hiện thấy virus ở bất kì giai đoạn phát triển nàocủa bọ
cây con khi bị xâm nhiễm từ 2 – 5 tuần. Virus không truyền qua chứng bọ phấn.
Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do
begomovirus gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được
lá ngọn cà chua.
Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng.
Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc
2.2.11 Phòng chống
Cho đến nay vẫn chưa có loài thuốc hóa học nào phòng trừ được trực tiếp
bệnh do virus gây ra. Phòng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lược chính
là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh.
giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh năm
trên đồng ruộng. Đây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp
bọ phấn theo dõi mặt độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Coimbatace (Ấn Độ)
cho thấy: từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt độ cao, cường
độ ánh sáng lớn với ẩm độ trung bình tạo điều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy
nở nhanh chóng nên mật độ bọ phấn cao, từ tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiều
nên mật độ bọ phấn thấp, đỉnh cao của mật độ bọ phấn khoảng tháng 11 đến
tháng 1 năm sau. Từ đặc điểm đó, nhiều kỹ thuật phòng trừ bọ phấn được áp
dụng tùy điều kiện:
+ Dùng giống kháng bọ phấn.
+ Dùng thuốc hóa học.
+ Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính.
+ Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có
hiệu quả trong điều kiện nhà lưới) .
- Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus có thể được tạo ra nhờ 2
cơ chế: Tính kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD).
Những năm gần đây, cùng với tiến bộ khoa học kĩ thuật các nhà khoa học
đã tạo ra các giống ớt có khả năng chống lại sự xâm nhiễm, tái tổ hợp của
virus trong tế bào cây. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á
(AVRDC) đã lai tạo ra những dòng ớt có tính kháng rất cao với bọ phấn
Bemisia tabaci cũng như kháng bệnh do begomovirus gây ra. Ở nước ta
đang có dự án thí nghiệm nghiên cứu tính kháng bệnh virus (begomovirus)
củ 34 giống ớt có nguồn gốc từ AVRDC (trung tâm rau màu thế giới) tại
Tải về để xem bản đầy đủ
95 trang
04/04/2022
8760
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- khoa_luan_phat_hien_va_danh_gia_tinh_gay_benh_cua_pepper_yel.docx
