Bài tiểu luận Quy trình sản xuất amylase từ vi sinh vật
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN HỌC: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH
HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BÀI TIỂU LUẬN: QUY TRÌNH SẢN XUẤT
AMYLASE TỪ VI SINH VẬT
GVDH: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
Nhóm: 09
Lớp: 02DHLTP2
SVTH gồm có:
01 - Trần Thị Chiến - 2205115008
02 - Đỗ Tuấn Hưng - 2205115221
03 - Nguyễn Thị Huyện - 2205115020
04 - Nguyễn Thị Diễm Kim - 2205115131
05 - Trần Thị Hoài Thông - 2205115059
06 - Nguyễn Thị Thơ – 2205115122
Tháng 12- 2012
LỜI MỞ ĐẦU
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ
thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh
bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai
mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Quá trình thủy phân tinh bột gồm hai công đoạn
chủ yếu là giai đoạn hồ hóa và giai đoạn đường hóa. Để thực hiện hai công
đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: thủy
phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme. Để thủy phân tinh bột từ lâu người ta
đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thủy phân
bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn
và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy việc thay thế và ứng
dụng enzyme để thủy phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển.
Enzyme amylase đã được tìm ra đã được góp phần quan trọng cho nhiều
ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở
nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase
càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở quy mô công nghiệp. Hiện
nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà
không mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được chiết xuất từ VSV, cụ thể là các
chuẩn vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài ra,
amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thủy phân tinh bột:
năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí
cho quá trình tinh sạch dịch đường.
Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch (malt), hạt bắp nảy
mầm, hay từ nấm mốc, ... Nguyên liệu sản xuất là gạo, bắp, khoai mì, … Đây là
những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền và có thể thấy dễ dàng ở nước ta. Do
đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành
khác phát triển.
2
PHẦN 1
TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE
1.1Giới thiệu về enzyme Amylase
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, định nghĩa
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá
trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước
chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đường ở nhiệt
độ thường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã
chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được
ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết
của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình thành
này có khả năng chuyển hoá tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng
chuyển hoá. Danh từ diastase là do Payen và Persor dung để gọi enzyme lúc
bấy giờ.
Enzyme Amylase đã được tìm ra góp phần quan trọng cho nhiều ngành
công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều
nguồn khác nhau như từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Enzyme amylase
được sử dụng nhiều trong sản xuất là do khả năng chịu nhiệt cao, năng lượng
xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình
tinh sạch dịch đường.
Các enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải
liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
R.R` + H-OH → RH + R`OH
1.1.2 Phân loại, đặc tính, cơ chế tác dụng
1.1.2.1 Phân loại
Có 6 loại enzyme được xếp vào hai nhóm lớn: Endoamylase và
Exoamylase.
Enzyme amylase được phân loại theo sơ đồ sau
3
Enzyme amylase
Endoamylase
Exoamylase
β- amylase (α- 1,4 –
glucanmaltohydrolase)
γ- amylase
(glucose amylase)
Enzyme khử
nhánh
α-amylase
Khử gián
Khử trực
tiếp
tiếp
Pullulanase
(α-dextrin 6 –
glucosidase)
Transglucosylase
(oligo-1,6
Maylo-1,6-
glucosidase
glucosidase)
Endoamylase:
α– amylase
Amylase có khả năng
phân cắt các liên kết 1,4-
glucoside của cơ chất một cách
ngẫu nhiên và là enzyme nội
bào. α-amylase không chỉ có khả
năng phân hủy hồ tinh bột mà
còn có khả năng phân hủy các
hạt tinh bột nguyên vẹn.
4
Enzyme khử nhánh
-Khử trực tiếp (Pullulanase)
Pullulanase là một trong các
enzyme quan trọng nhất trong chế
biến tinh bột. Enzyme này được sử
dụng trên một quy mô lớn trong
glucose và các ngành công nghiệp
sirô maltose. Pullulanase là một loại
enzyme rất mạnh cho sự thoái hóa
tinh bột thành glucose hoặc maltose.
Pullulanase thủy phân α-1, 6-
glycosidic liên kết của chuỗi phân
nhánh và α-1, 4-glycosidic.
-Khử gián tiếp
Transglucosylase
(oligo-1,6-
glucosidase) và Maylo-1,6-glucoside:
Enzyme này thủy phân liên kết β-1,6-
glucoside trong isomaltose, panose và
các dextrin tới hạn có thể chuyển hóa đường có thể lên men được.
Exoamylase
β–amylase
(β-1,4-glucan-maltohydrolase)
β–amylase xúc tác từ sự thủy phân các liên
kết 1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và
polysaccharide, phân cắt từng nhóm
maltose từ đầu không khử của mạch.
Maltose được hình thành do sự xúc tác của
β-amylase có cấu hình β.
γ–amylase (glucose amylase)
Glucose amylase có khả năng
thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6-
glucoside, ngoài ra còn có khả năng
thủy phân liên kết -1,2 và -1,3-
glucoside.
Glucose amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen,
amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các
loại enzyme amylase khác
1.1.2.2 Đặc tính
Đặc tính chung:
Khả năng dextrin hóa: Thủy phân tinh bột --> dextrin + một ít maltoza.
Dextrin có khả năng họat hóa cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme này.
Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành
ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme.
Tính tan: Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu
loãng.
Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+.
Cơ chất tác dụng: của enzyme amylase là tinh bột và glycogen.
Đặc tính riêng
α – amylase có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động, chuyển
hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt:
Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu: với nấm mốc có pH từ 4.5 – 4.9,
nấm sợi có pH từ 4.0 – 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4. 5 – 5.8), vi
khuẩn có pH từ 5.9 – 6. 1 (pH<3 thì enzyme α – amylase bị vô hoạt trừ enzyme
của Asp.Niger có pH 2.5 – 2.8).
α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lượng lớn
glucose và maltose.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của Asp.oryzae
bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn khác
nhau cũng không đồng nhất. α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác
động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C (Kozmina,
1991).
α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham
gia vào sự hình thành, ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme và duy trì hoạt động
của enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác
động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải
protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết
khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác.
Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, CO2+, Sn2+, Cr3+ thì không có
ảnh hưởng mấy đến α-amylase.
6
1.1.2.3 Cơ chế tác dụng
α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên
trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên. Nó không
chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nhưng với tốc độ rất
chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase là quá trình đa giai
đoạn.
Giai đoạn 1 (dextrin hóa): Tinh bột α-amylase dextrin phân tử lượng
thấp.
Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân
tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và
amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa):
Dextrin phân tử thấp bị thủy phân --> tetra và trimaltose (không
cho màu với iod) thủy phân rất chậm--> disaccharide và monosaccharide.
-Amylose phân giải nhanh--> oligosacharide --> poliglucose (gồm 6-7 gốc
glucose) bị phân cách--> mạch polyglucose colagen ngắn -->Maltose -->
maltotriose --> maltotetrose.
Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự
nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong
phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài
các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp
và isomaltose 8%.
7
PHẦN 2
TỔNG QUAN VỀ NGUỒN GIỐNG VI SINH VẬT
2.1
Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là
hoạt tính enzyme).
Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm.
2.2
Vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme Amylase
2.2.1 Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme Amylase
Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu
enzyme amylase chủ đạo. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường
được phân lập từ các nguồn tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều
hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus.
Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,
Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase.
Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa,
Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng
sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị
nhiễm vi sinh vật khác.
Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên
cũng có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vugaris 42 có khả
năng tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các
enzyme khác.
8
2.2.2 Giới thiệu Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae
Đặc điểm cấu trúc hình thái của Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae
Condium of Aspergillus Oryzae
Aspergillus Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp
Ascomyctes (năng khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm
những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7m, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn,
chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này
hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan
sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài 1-2mm
nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên
gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là
những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử
đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus Oryzae có
màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…. Bào tử cùng thành phần môi trường
9
được sấy khô ở nhiệt độ < 50oC cho đến khi độ ẩm <8oC, đưa vào bao, hàn kín
và bảo quản ở nhiệt độ thường.
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu cả enzyme thủy phân nội bào và
ngoại bào (amylase, protease, pectinasae,….), ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo….đã hết nhưng không được
rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, bã sắn….chúng mọc và phát triển có
khi thành lớp mốc, có màu đen, vàng… màu do các bào tử già có màu sắc. các
bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ
mọc thành mới.
2.2.3 Các phương pháp phân lập và bảo quản
2.2.3.1 Các phương pháp phân lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình
thường đên nơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt vsv. ở những nơi giàu
chất hữu cơ, hay nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong
cơ thể người, động vật, nơi có nhệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhệt độ
cao. VSV có khả năng thích nghi trong trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính
nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn
cảnh khắc nghiệt nhất.
Thông thường để phâp lập một giống chủng vsv để thu nhận enzyme thì
có 3 cách phân lập.
Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách
phân lập cho phù hợp. mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm
riêng biệt. Sau đây là một số ưu điểm.
Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh
được thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển
hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào.
Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme (ở quy mô sản
xuất công nghiệp) với một loại enzyme thật sự mạnh.
Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó
thường tập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa vào
đặc điểm này chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV
sinh tổng hợp enzyme mà ta cần.
Ví dụ: nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease
cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân
10
lập vsv có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứa nhiều
tinh bột trong tự nhiên.
Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi
với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua
giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những
giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc
điểm sinh hóa hơn các giống vi sinh vật hoang dại.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men,
dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả
năng thu nhận của những chủng có khả năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.
Phân lập giống trong môi trường giống đã hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có
thể rất nhiều tế bào vi sinh vật giống bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế bào
không bị thoái hóa. Việc phân lập lại từ nguồn gốc này nhiều khi lại đạt được
những kết quả tốt.
Phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay
có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là
giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được bảo đảm
chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả
đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí
nghiệm.
Quá trình lấy mẫu : có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây
cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai
tây ra, rửa sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao
nylon và mang về phòng thí nghiệm.
Tiền hành thí nghiệm phân lập
Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây
Lấy 10g mẫu đất hay mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước
cất vô trùng sau đó đảo mẫu.
Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyền sang 1 ống
nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng.
11
Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.
Hút 0.1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc
cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar )
Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở
nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày.
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ
xuất hiện những quầng sánh xung quanh khuẩn lạc.
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường nước khi cấy.
Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.
Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch
nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự
trữ trong máy làm đông.
Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (quy mô nhỏ ).
Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch
huyền phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có
chứa môi trường sinh trưởng của nấm.
KH2PO4
NH4NO3
KCl
1,4
10
MgSO4.7H2O
FeSO4 . 7H2O
Hồ tinh bột
0,1
0,01 pH=6,5
20
0,5
Phân phối khoảng 30 – 40 ml môi trường vào erlen 50ml đem
khử trùng bởi Autoclave ở 73 - 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt
độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng /
phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo
quản và dự trữ. Để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những
phương pháp bảo quản thích hợp.
2.2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Mục đích của bảo quản giống vi sinh vật dùng trong sản xuất enzyme là
đảm bảo tính ổn định trong quá trình tổng hợp enzyme và tính ổn định của hoạt
tính enzyme. Có các phương pháp để thực hiện quá trình này như sau:
Cấy truyền và bảo quản lạnh
Phương pháp dựa trên nguyên tắc là vi sinh vật sẽ hạn chế quá trình trao
đổi chất trong điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian
này vi sinh vật có khả năng bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Cách thực hiện : Ống giống vi sinh vật được cấy truyền vào 3-5 ống
nghiệm có môi trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống
12
dùng cho sản xuất hoặc nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản. Có thể làm
thêm hai ống để tránh sai sót do thao tác đối với những người mới bắt đầu làm
công tác bảo quản giống.
Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điểu kiện nhiệt độ
lạnh từ 4-70C. Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này
được thực hiện liên tục.
Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát
Phương pháp dựa trên nguyên tắc : Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm
thấp, vi sinh vật có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong
thời gian dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc
Asp.oryzae.
Trước khi sử dụng, đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%.
Asp.oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc
cát đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao hàn kín và
bảo quản ở nhiệt độ thường.
Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc
Phương pháp dựa trên nguyên tắc bào tử nấm được giữ trong hạt ngũ
cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzyme
trong thời gian dài.
Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống
ống nấm mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều
.
2.3
Yêu cầu đối với giống vi sinh vật
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và
được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong
công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định.
Đó là:
Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải
có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình
trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng
nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV
cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính
vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này
phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.
Giống phải cho năng suất sinh học cao.
Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong
điều kiện sản xuất công nghiệp.
13
Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ
kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn, dễ dàng
tách sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.
Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên
men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết.
Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến
hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh,
đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường
tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp
Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà
còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu
tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình
nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme
Amylase.Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase
trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường, tính chất cơ lý của môi
trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi
trường… Là những yếu tố cơ bản quan trọng nhất.
14
PHẦN 3
QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME
Α- AMYLASE TỪ ASPERGYLLUS ORYZAE
3.1
Bảo quản giống Aspergyllus oryzae:
-Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave 130oC trong 30
phút.
-Trộn bào tử vào cát.
-Sấy chân không < 40oC (độ ẩm 5%).
-Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút bông.
-Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc hơn.
3.2
Nguyên liệu:
-Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất béo,
10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ 37-59%.
-Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có vị
chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất
độc không quá 0,05%.
-Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi
cấy: trấu, mạt cưa…
15
3.3
Sơ đồ công nghệ:
NGUYÊN LIỆU
XỬ LÝ
THANH TRÙNG
LÀM NGUỘI
PHỐI TRỘN
GIỐNG VSV
NUÔI CẤY
THU NHẬN ENZYME THÔ
SẤY
NGHIỀN MỊN
TRÍCH LY
THÀNH
PHẨM
LỌC
BAO GÓI
SẤY
KẾT TỦA ENZYME
THU NHẬN ENZYME THÔ
SẮC KÝ
16
3.4
Thuyết minh quy trình:
-Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ các
tạp chất. Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo.
-Thanh trùng: Nhiệt độ thanh trùng là 95oC trong 60 phút. Đồng thời
phải thanh trùng khay lên men.
-Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm, dùng
3kg môi trường/khay.
-Sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống với nồng độ 5-10% so với
khối lượng của môi trường ở mỗi khay.
-Đưa khay lên các giá đỡ
-Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30oC, độ ẩm 60-65%, đồng thời
phải thoáng khí.
-Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô. Cần
thu nhận enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh
bào tử là lúc quá trình tổng hợp enzyme đa yếu đi. Do đó cần một bước nuôi
cấy thử nghiệm để xác định thời điểm thu nhận enzyme thô. Chế phẩm enzyme
thô thu được chứa tế bào nấm, cơ chất, nước và enzyme
-Để giữ hoạt tính của enzyme, sấy chế phẩm thô này ở nhiệt độ 30-40oC,
độ ẩm sau sấy là 10%.
-Nghiền mịn: chế phẩm enzyme thô được nghiền với cát và bột thạch
anh. Cát và bột thạch anh được rửa sạch, sấy khô trước.
-Trích ly: sau khi nghiền, dùng nước để trích ly. Cứ 1lít enzym thô, cho
4-5lít nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch.
-Lọc: dịch sau trích ly lọc bằng lọc tiếp tuyến.
-Kết tủa enzyme: kết tủa được thực hiện bằng ethanol phải làm lạnh cả
dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính
enzym.Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ
từ để tránh hiện tượng biến tính. Nhiệt độ từ 3-10oC và dùng 2lít ethanol cho
1lít enzyme.
-Enzyme thu được là 1 hỗn hợp nhiều enzyme khác nhau như: amylase,
proteinase, cellulase… Do đó, phải tiến hành sắc ký lọc gel để thu được
enzyme amylase. Gel sử dụng là Sephadex G200.
-Sấy: sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40oC để bảo đảm hoạt
tính cho enzyme, độ ẩm sản phẩm là 5%.
3.5
a.
Ưu và nhược điểm của phương pháp này:
Ưu điểm:
17
Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo
thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối
VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc
vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý. Môi trường đặc là
môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại
bỏ khu
vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy.
b.
Nhược điểm:
Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương
pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích.
3.6
Các ảnh hưởng đến chất lượng enzyme:
a.
Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng:
Nguồn dinh dưỡng Nito hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường
dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta
dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm
sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường dùng là 0.91% Natri Nitrat và Amoni
Nitrat có hiệu quả hơn so với các muối khác( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni
Sunfat…)
Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp
amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác
Bảng ảnh hưởng của nguồn Nito tới sinh tổng hợp các enzyme
amylase
Nguồn
Liều lượng
muối, % theo N
Hoạt động enzyme sau 6 ngày
nuôi đối với 100ml
Nito
α-amylase
Glucomyla
se
NaNO3
0.3
145
26
-
8000
3300
-
NaNO3
0.15
0.15
0.15
(NH4)2SO2
NH4NO3
98
4100
18
NH4NO3
0.3
0.3
45
4900
8000
NH4H2PO4
5.5
b.
- Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nito vừa là
nguồn năng lượng.
Ảnh hưởng của amino acid:
- Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid...) đóng vai trò
vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp nhiều
amino acid khác trong quá trình chuyển amine hóa.
- Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong
nước như: pantotenic acid, biotin, folic acid,…các vitamin này có ý nghĩa sinh
học rất lớn. Ngoài ra sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ
thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi.
- Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng
hợp enzyme. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp
các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược và một số khác thì
không có ảnh hưởng gì cả.
c.
Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng:
- Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme. Thiếu MgSO4 sẽ có
ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. khi đó sự tổng hợp
α-amylase bị ức chế hoàn toàn. Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α-
amylase là 0.05%.
- Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất
(nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzyme, đồng thời đề phosphoryl hóa
glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh
sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzyme. Các muối phospho
thường được dùng với nồng độ cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng cao
khi có 0.1% KH2PO4.
- Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt độ vì nó là cấu tử không
thể thiếu của enzyme này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác dụng
của protease. Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca trong môi trường
là 0.01-0.05%.
- Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml
môi trường là sự thích hợp nhất.
Ngoài các yếu tố đa lượng cần chú ý tới các yếu tố vi lượng. Chẳng hạn: coban,
kẽm…và các yếu tố gây ức chế sự tổng hợp enzyme amylase như: đồng, thủy
ngân,…
3.7
Các yếu tối ảnh hưởng đến quá trình lên men:
a.
Độ ẩm môi trường:
19
Tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm
môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho
độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng của
việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp.oryzae
nuôi bằng phương pháp bề mặt:
Bảng: ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-
amylase của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt
20 giờ
34 giờ
42 giờ
Phương
án
nghiệm
Hoạt
độ
Hoạt
độ
Hoạt
độ
Độ
ẩm
%
Độ
ẩm
%
Độ
ẩm
%
thí
amylase với
canh trường
khô
amylase với
canh trường
khô
amylase với
canh trường
khô
Khay để
hở
27.8 15.0
46.4 20.4
23.8 18.0
42.4 32.9
22.0 20.5
42.4 36.7
Khay đậy
nắp
Điều này cần sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối
thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì sinh trưởng của nấm mốc và còn
phụ thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi.
b.
Độ ẩm tương đối của không khí:
Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hòa tức là 100% W đều thích hợp
cho nấm mốc phát triển. trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão
hòa để tránh cho môi trường khỏi bị khô.
c.
Ảnh hưởng của không khí: Asp.oryzea phát triển bình thường khi
nồng độ CO2 trong không khí đạt 8%
d. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh
trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase. Nhiệt đọ
thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme là 28-32oC. Nhiệt độ do nấm
mốc tỏa ra môi trường có thể nóng lên 40oC hoặc hơn. Do vậy cần gữi cho
nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27oC và không cao hơn 36oC.
e.
Ảnh hưởng thời gian nuôi nấm mốc:
Hầu hết các chủng nấm mốc Asp.oryzea có hoạt động cực đại của amylase ở
khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42.
f.
Ảnh hưởng của pH: thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường acid
yếu khoảng 5,5-6,5.
20
Tải về để xem bản đầy đủ
39 trang
30/03/2022
9340
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài tiểu luận Quy trình sản xuất amylase từ vi sinh vật", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- bai_tieu_luan_quy_trinh_san_xuat_amylase_tu_vi_sinh_vat.pdf
