›
›

Bài thuyết trình đề tài Phương pháp PCR - Nguyễn Thị Huỳnh Nga

Download
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO  
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  
KHOA THỦY SẢN  
Đề tài:  
PHƯƠNG PHÁP PCR  
GVHD : LÊ THỊ PHƯƠNG HỒNG  
1
Thành viên nhóm  
◼ Nguyễn Thị Huỳnh Nga  
08141029  
08141063  
08141123  
08141105  
◼ Phan Thị Bích Tuyền  
◼ Nguyễn Minh Quân  
◼ Mai Thị Nga  
2
Mục lục  
I. Giới thiệu  
II. Nguyên tắc PCR  
III. Điều kiện phản ứng PCR  
IV. Quy trình phản ứng PCR  
1.Giai đoạn biến tính  
2.Giai đoạn bắt mồi  
3.Giai đoạn kéo dài  
V. Ý nghĩa và các ứng dụng PCR  
VII. Các hạn chế  
Tài liệu tham khảo  
3
I. GIỚI THIỆU  
PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là phản ứng chuỗi  
trùng hợp hay còn gọi là "phản ứng khuếch đại gen“.  
Trong ngành thủy sản việc áp dụng kỹ thuật PCR để phát  
hiện ra các mầm bệnh do virus gây ra như bệnh đốm trắng,bệnh  
đầu vàng, hội chứng Taura… trên tôm.  
4
II. Nguyên tắc PCR  
◼
◼
PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA  
đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn  
DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase.  
Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của  
DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.  
5
II. Nguyên tắc PCR  
▪
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp  
nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:  
1 chu kỳ  
GĐ  
GĐ  
GĐ  
Biến tính  
Bắt mồi  
Kéo dài  
6
III. Điều kiện phản ứng  
PCR  
Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ  
các thành phần sau :  
Hình : Thực nghiệm PCR  
7
1. Nước  
Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh  
khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase,  
enzyme cắt giới hạn ….  
8
2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR:  
Thành phần dung dịch đệm thường phụ thuộc vào loại  
enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR, dung dịch đệm  
thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM và  
MgCl2 1.5 mM  
Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ion  
Mg2+ gắn kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám  
nối của mồi.  
9
3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs):  
Deoxyadenosine 5’ triphosphate  
10  
3. Deoxynucleotide triphosphat  
(dNTPs):  
Nồng độ khoảng chừng 100 mM cho mỗi nucleotide: dATP,  
dCTP, dGTP, dTTP .  
Nồng độ thấp khoảng 10 – 100 mM thì Taq polymerase có  
độ chính xác cao hơn.  
11  
4. Mồi (primer)  
Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc  
xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA.  
Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm:  
o Mồi xuôi (forward primer)  
o Mồi ngược (reverse primer).  
12  
5.Enzyme DNA polymerase (Taq)  
Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A,  
T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp .  
Enzyme sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA  
polymerase I về sau sử dụng Taq polymerase vì nó không bị phá  
hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá  
trình phản ứng,có thể chịu nhiệt độ 90 oC lặp lại nhiều lần mà  
không mất khả năng tổng hợp DNA  
13  
6. DNA mẫu (DNA template)  
Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các  
đối tượng nghiên cứu. DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh  
lẫn tạp chất.  
Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm  
(từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase  
cho hiệu quả cao .  
14  
III. Quy trình phản ứng  
PCR.  
◼ Trong phản ứng PCR nhiệt độ là vô cùng quan trọng  
và kèm theo là yếu tố thời gian.  
◼ Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong  
một chu kỳ:  
15  
1. Giai đoạn biến tính:  
◼ Sợi DNA mạch khuôn bị biến tính tách thành 2 sợi  
đơn ở nhiệt độ 940C trong vòng 30 giây đến 1 phút .  
◼ Sự biến tính DNA diễn ra với sự có mặt của hai đoạn  
mồi và các dNTP.  
16  
2.Giai đoạn bắt cặp:  
◼ Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 50 – 650C tốt nhất là  
55oC trong khoảng thời gian 1 – 2 phút .  
◼ Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA  
polymerase và chiều dài sản phẩm.  
17  
3. Giai đoạn kéo dài:  
◼ Nhiệt độ lúc này được nâng lên 720C trong vòng 30 giây  
đến 1 phút .  
◼ Nhờ tác dụng của men Taq polymerase các Nu có sẵn  
trong ống nghiệm gắn vào các mồi theo nguyên tắc bổ  
sung  
=> Một bản sao DNA mới đã được hình thành .  
18  
3. Giai đoạn kéo dài:  
19  
Sơ đồ phản ứng PCR qua nhiều chu kỳ  
20  
Tải về để xem bản đầy đủ
ppt 29 trang yennguyen 28/03/2022 7840
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài thuyết trình đề tài Phương pháp PCR - Nguyễn Thị Huỳnh Nga", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên

File đính kèm:

  • pptbai_thuyet_trinh_de_tai_phuong_phap_pcr_nguyen_thi_huynh_nga.ppt