Tóm tắt Luận án Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt Diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm
CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
ADC
AIC
Acid diclofenac
The Akaike information criterion
The area under the curve (Diện tích dưới đường cong)
AUC
AUMC
Area under the first moment curve (Diện tích dưới đường
cong ở thời điểm đầu).
BCS
Biopharmaceutical Classification System (Bảng phân loại sinh
dược học)
CĐDH
CDH
Cmax
Chất đồng diện hoạt
Chất diện hoạt
Maximum concentration (Nồng độ thuốc tối đa)
CTBC
CTCL
CTTƯ
DC
Công thức bào chế
Chỉ tiêu chất lượng
Công thức tối ưu
Dược chất
DD
Dung dịch
ĐNH
FDA
Đồng nhất hóa
Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc – thực
phẩm)
GP
Giải phóng
GPDC
Giải phóng dược chất
HPLC
HQC
High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)
High quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ cao)
IPM
Isopropyl myristat
IVIVC
In vitro – in vivo correlation (tương quan in vitro – in vivo)
KTG
Kích thước giọt
LC-MS
Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối
phổ)
LLOQ
LQC
Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới)
Lower quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp)
MCT
Medium-chain triglycerides (triglycerid có acid béo mạch
trung bình)
MQC
Middle quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ
trung bình)
MRT
MT
Mean residence time (Thời gian lưu trung bình)
Môi trường
MTPT
NaDC
NNT
Môi trường phân tán
Natri diclofenac
Nano nhũ tương
PdI
Polydispersity index (chỉ số đa phân tán)
Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)
Standard deviation (Độ lệch chuẩn)
Sinh khả dụng
RSD
SD
SKD
TCCS
TEM
Tiêu chuẩn cơ sở
Transmission electron microscopy (Hiển vi điện tử truyền
qua)
Tmax
Maximum time (Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa)
MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Công nghệ nano đã và đang tạo ra một cuộc cách mạng lớn trong bào
chế thuốc hiện đại. Sử dụng công nghệ nano để thiết kế các hệ phân phối
thuốc mới đã tạo nên sự phát triển của ngành y học, hứa hẹn những tiến bộ
đột phá trong điều trị và chẩn đoán. Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp
dược phẩm Việt Nam, các chế phẩm được bào chế theo công nghệ nano vẫn
còn mới mẻ và chưa được ứng dụng vào sản xuất.
Diclofenac là một DC điển hình của nhóm NSAIDs, có khả năng
ngăn chặn sự co đồng tử xảy ra trong quá trình lấy tinh thể đục, làm giảm
viêm và đau trong tổn thương biểu mô giác mạc sau phẫu thuật. Diclofenac
là một dược chất có độ hòa tan kém, các chế phẩm thuốc nhỏ mắt
diclofenac hiện có trên thị trường chủ yếu ở dạng dung dịch có hiệu quả
điều trị không cao.
NNT là một trong số các hệ bào chế có cấu trúc nano đã và đang
nhận được sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều
nghiên cứu đã chứng minh, NNT làm tăng tỉ lệ hấp thu thuốc vào các mô
bên trong mắt, tăng thời gian lưu thuốc trước giác mạc, cải thiện SKD và
hiệu quả điều trị tại mắt. Các nghiên cứu cũng chỉ ra đây là hệ phân phối
thuốc tại mắt tiềm năng cho các DC thuộc nhóm II, III trong bảng phân loại
sinh dược học (BCS).
Chính vì vậy, nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt chứa
diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm là vấn đề cấp
thiết, có ý nghĩa khoa học, góp phần phát triển nghiên cứu, bào chế thuốc
theo công nghệ nano ở Việt Nam.
Mục tiêu của luận án
1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế nano nhũ tương nhỏ
mắt diclofenac 0,1% ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Nâng quy mô bào chế, dự thảo được tiêu chuẩn cơ sở, đánh giá độ
ổn định cho nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 0,1%.
1
3. Đánh giá được sinh khả dụng của chế phẩm trên thỏ thí nghiệm và
bước đầu thiết lập được tương quan in vitro – in vivo của chế phẩm.
Những đóng góp mới của luận án
Lần đầu tiên ở Việt Nam, nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac được
tiến hành nghiên cứu tương đối đầy đủ: từ lựa chọn công thức bào chế, xây
dựng quy trình bào chế, nâng quy mô, dự thảo tiêu chuẩn cơ sở, nghiên cứu
độ ổn định, đánh giá SKD in vivo trên súc vật đến thiết lập tương quan
in vitro – in vivo. Luận án đã có những đóng góp mới như sau:
- Xây dựng công thức và quy trình bào chế cơ bản nano nhũ tương
nhỏ mắt diclofenac bằng thiết bị siêu âm, thiết bị siêu âm kết hợp đồng nhất
hóa áp suất cao, thiết bị phân cắt tốc độ cao.
- Xây dựng mô hình đánh giá SKD của chế phẩm nano nhũ tương
nhỏ mắt chứa diclofenac trên mắt thỏ. Mô hình này cho thấy, chế phẩm có
khả năng kéo dài thời gian lưu thuốc trước giác mạc và làm tăng thấm dược
chất qua giác mạc nên cải thiện SKD của chế phẩm hơn so với dạng dung
dịch đối chiếu.
- Xây dựng mô hình và thiết lập tương quan in vitro – in vivo. Tương
quan sau khi thiết lập được ứng dụng trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho
chế phẩm và có thể sử dụng để nghiên cứu phát triển sản phẩm, kiểm soát
chất lượng sản phẩm.
Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 149 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục, 58
bảng, 37 hình, 165 tài liệu tham khảo. Bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 trang),
tổng quan (32 trang), nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp
nghiên cứu (21 trang), Kết quả nghiên cứu (73 trang), Bàn luận (20 trang),
Kết luận, đề xuất (2 trang), Danh mục các công trình đã công bố liên quan
đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (14 trang).
2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. THÔNG TIN VỀ DƢỢC CHẤT ACID DICLOFENAC
1.1.1. Công thức hóa học
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid diclofenac
1.1.2. Đặc tính lý hóa
Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng hoắc gần trắng, hơi hút ẩm, rất
ít tan trong nước, độ tan phụ thuộc pH. Tan tốt trong dầu thực vật.
Tính chất hóa học:
- Tính acid yếu, pKa = 4,0.
1.1.3. Tác dụng, chỉ định
Diclofenac thuộc nhóm chống viêm không steroid - NSAIDs, có tác
dụng ức chế tổng hợp prostagladin rõ rệt, tạo ra tác dụng chống viêm, giảm
đau mạnh.
Hiện nay trên thị trường mới chỉ có DD thuốc nhỏ mắt chứa NaDC.
Chỉ định: DD nhỏ mắt 0,1% NaDC giảm đau các tổn thương biểu mô do
chấn thương, phẫu thuật, điều trị viêm sau phẫu thuật, các bệnh viêm mạn
tính không lây nhiễm, ngăn ngừa thu hẹp đồng tử trong phẫu thuật đục thủy
tinh thể, giảm các triệu chứng do viêm màng kết mạc.
1.2. NANO NHŨ TƢƠNG .
1.2.1. Khái niệm
NNT là hệ phân tán siêu vi dị thể, có phân bố KTG nằm trong
khoảng từ 20 - 500 nm, được hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan,
trong đó một chất lỏng là pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) được
phân tán vào chất lỏng thứ hai là MTPT (pha ngoại, pha liên tục), được ổn
định bằng CDH và CĐDH.
3
1.2.2. Thành phần
NNT được hình thành bởi sự hòa trộn của pha dầu, pha nước, CDH,
CĐDH và một số thành phần khác.
1.2.3. Kỹ thuật bào chế nano nhũ tƣơng
1.2.3.1. Kỹ thuật phân tán hay nhũ hóa sử dụng năng lượng cao
Kỹ thuật này có thể được thực hiện trên các thiết bị như: thiết bị
ĐNH phân cắt tốc độ cao, thiết bị ĐNH áp suất cao, thiết bị siêu âm.
1.2.3.2. Kỹ thuật tự nhũ hóa hay nhũ hóa sử dụng năng lượng thấp
Bao gồm các phương pháp: phương pháp điểm đảo pha, phương pháp
nhiệt độ đảo pha, phương pháp tự nhũ hóa
1.2.4. Đặc tính của nano nhũ tƣơng
Các đặc tính quan trọng của NNT bao gồm phân bố KTG và chỉ số
đa phân tán, đặc tính động học, hiệu điện thế bề mặt (thế zeta), độ nhớt.
1.2.5. Ƣu nhƣợc điểm của nano nhũ tƣơng
Ƣu điểm: Tăng độ tan của dược chất, tăng sự ổn định của dược chất, bảo
vệ dược chất khỏi sự thủy phân và oxy hóa, tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng, tác
dụng tại đích, tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng được trên nhiều đường
dùng. Tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng được trên nhiều đường dùng.
Nhƣợc điểm: Sử dụng nồng độ cao chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt. Độ
ổn định bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH, khó khăn trong quá trình bảo quản.
1.3. NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT
1.3.1. Đặc điểm cấu tạo của mắt liên quan đến hấp thu dƣợc chất.
Mắt cấu tạo bởi 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong. Các yếu tố
trước giác mạc cộng với thời gian tiếp xúc với màng hấp thu ngắn là lý do
chính làm cho lượng thuốc được hấp thu vào các mô bên trong thấp hơn 5%
tổng lượng thuốc được đưa vào.
1.3.2. Một số nghiên cứu về nano nhũ tƣơng nhỏ mắt
NNT dùng cho nhãn khoa được nghiên cứu với nhiều các hợp chất
khác nhau như: dorzolamid, ganciclovir, flurbiprofen axetil, acetazolamid,
azithromycin, timolol maleat. Các kết quả nghiên cứu đều chứng minh sự
cải thiện SKD của dạng thuốc NNT so với các dạng thuốc thông thường.
4
1.3.3. Đánh giá sinh khả dụng của nano nhũ tƣơng trên mắt
1.3.3.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro
- Màng GP: màng thẩm tích hoặc túi thẩm tích có giới hạn KLPT
thường 12 - 14 kDa; đôi khi sử dụng màng lọc cellulose acetat với kích
thước lỗ lọc thường là 0,2 µm.
- Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4 hoặc DD
nước mắt nhân tạo. Môi trường khuếch tán được điều nhiệt, duy trì ở một
khoảng nhiệt độ thích hợp và được khuấy trộn với tốc độ nhất định.
- Nhiệt độ: 34 ± 0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) hoặc 37 ± 0,5ºC.
- Thiết bị đánh giá GP thuốc: bình Franz, thiết bị thẩm tách micro
hoặc thiết bị thử hòa tan khác.
1.3.2.2. Đánh giá sinh khả dụng in vivo
Với những thuốc mà đích tác dụng là trong nhãn cầu thì định lượng
DC trong dịch tiền phòng là phù hợp nhất bởi đây là khu vực trung gian vận
chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt. Đây cũng là phương
pháp được chọn để đánh giá SKD NNT nhỏ mắt diclofenac.
1.3.3.3. Tương quan in vitro – in vivo
Mối tương quan in vitro – in vivo là một mô hình toán học mô tả mối
quan hệ giữa đặc tính in vitro của một dạng bào chế và đáp ứng in vivo
tương ứng. Thông thường, đặc tính in vitro chính là tốc độ và/hoặc mức độ
GPDC và đáp ứng in vivo là nồng độ thuốc trong máu hay lượng thuốc
được hấp thu. Sau khi tương quan được thiết lập, những thông số thu được
từ kết quả nghiên cứu in vitro sẽ dùng để thay thế cho những thông số thu
được từ kết quả nghiên cứu in vivo vốn tiêu tốn rất nhiều tiền của, thời gian,
nhân lực và làm tăng giá thành sản phẩm của thuốc. Kết quả này cũng là cơ
sở xét miễn nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học; cơ sở dùng
để đánh giá ứng dụng của các đặc điểm và phương pháp thử hòa tan; cơ sở
cho kiểm tra chất lượng sản xuất và lựa chọn công thức thuốc thích hợp.
5
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu, hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn DĐVN IV, tiêu chuẩn nhà sản xuất, tinh khiết phân tích và dùng cho
HPLC.
2.1.2. Thiết bị
Sử dụng các thiết bị bào chế và đánh giá tin cậy: máy siêu âm cầm
tay Labsonic®M – Sartorius, máy ĐNH phân cắt Unidriver X1000, máy
ĐNH dưới áp suất cao EmulsiFlex – C5, hệ thống đánh giá GP thuốc qua
màng Hanson Research, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260
Infinite, kính hiển vi điện tử truyền qua EMLab – NIHE, máy đo phân bố
kích thước tiểu phân và thế zeta Zetasizer Nano ZS90.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu xây dựng công thức, quy trình bào chế NNT diclofenac
và đánh giá một số đặc tính của chế phẩm.
- Nâng quy mô bào chế, và dự thảo tiêu chuẩn chất lượng của NNT
nhỏ mắt diclofenac.
- Bước đầu đánh giá SKD của NNT nhỏ mắt diclofenac trên mắt thỏ
thí nghiệm.
- Thiết lập tương quan in vitro – in vivo và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
của chế phẩm NNT nhỏ mắt diclofenac.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp bào chế nano nhũ tƣơng diclofenac
Bước 1: Hòa tan hoàn toàn DC vào pha dầu (dung môi pha dầu, CDH
thân dầu, CĐDH) ở nhiệt độ 60 – 65oC. Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha
nước (dung môi – nước cất pha tiêm, CDH thân nước, CĐDH thân nước, hệ
đệm, chất bảo quản) lên 65 – 70oC. Bước 3: Tiến hành nhũ hóa pha dầu vào
pha nước bằng thiết bị siêu âm hoặc thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất
cao hoặc thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao. Bước 4: Điều chỉnh pH và thể
tích. Bước 5: Lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm để tiệt khuẩn. Bước 6:
Đóng lọ thuốc nhỏ mắt đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm.
6
Với những mẫu cần đánh giá độ vô khuẩn thì pha dầu cần được tiệt
khuẩn bằng nhiệt khô, pha nước được lọc tiệt khuẩn và quy trình 6 bước
được thực hiện trong buồng pha chế vô khuẩn Bioair Topsafe 1.2
2.3.2. Phƣơng pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh
DD đối chiếu là dung dịch thuốc nhỏ mắt NaDC được pha theo CT
tham khảo trong tài liệu Thực tập bào chế.
2.3.3. Phƣơng pháp đánh giá một số đặc tính của hệ nano nhũ tƣơng
2.3.3.1. Các đặc tính vật lý của hệ nano nhũ tương
a. Phân bố kích thước giọt: Sử dụng máy quang phổ photon ánh sáng
Zetasizer Nano ZS90.
b. Hình thái giọt nhũ tương: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
EMLab – NIHE.
c. Thế zeta: Sử dụng thiết bị đo thế zeta: Zetasizer Nano ZS90.
d. Độ nhớt: Sử dụng nhớt kế Brookfield với đầu đo S1, tốc độ quay là 400
vòng/phút, nhiệt độ đo 25 ± 2oC.
e. Độ bền của hệ: Trong điều kiện thường và điều kiện khắc nghiệt.
2.3.3.2. pH: Thử theo dược điển Việt Nam IV (phụ lục 6.2).
2.3.3.3. Định lượng dược chất trong nano nhũ tương
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các điều kiện
như sau: Pha tĩnh: Cột InertSustain®C8 (GL Science – Nhật Bản), kích
thước 150 mm × 4,6 mm (octyl silica gel; 5 µm).
. Dung dịch đệm phosphat pH 2,5: pha dung dịch gồm acid phosphoric
0,01 M và natri dihydrophosphat 0,01 M rồi điều chỉnh pH tới 2,5 bằng hai
thành phần này (nếu cần).
. Pha động: hỗn hợp methanol và dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ
lệ 75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, rồi siêu âm 15 phút. Tốc
độ dòng pha động: 1 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. Detector UV
bước sóng: 276 nm.
. Tiến hành: Chuẩn bị DD chuẩn (NaDC/methanol, 40g/ml), DD thử
(NNT/methanol). Lọc DD chuẩn và thử qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành
sắc ký lần lượt với DD chuẩn và DD thử. Tính nồng độ ADC trong một chế
phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của DD chuẩn, DD thử và
hàm lượng C14H10Cl2NNaO2 trong NaDC chuẩn.
7
2.3.3.4. Phương pháp xác định tỉ lệ dược chất được nhũ tương hóa
Thêm natri clorid đến bão hòa vào 40 ml NNT, rồi tiến hành li tâm
với tốc độ 12000 vòng/phút ở nhiệt độ 40 2oC, trong 30 phút để tách riêng
2 pha dầu và nước. Định lượng dược chất trong pha nước bằng HPLC
tương tự mục 2.3.3.3.
2.3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro
Sử dụng thiết bị đánh giá sự GP thuốc: bình Franz. Ngăn nhận chứa 7
ml môi trường, ngăn cho là 1 ống trụ tròn, đường kính trong 1 cm, chứa
được 1 ml mẫu.
Điều kiện thử: Màng GP: màng cellulose acetat 0,2 µm hoặc màng
Spectra/Por® 2 Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 12 - 14
kD. Diện tích bề mặt màng khuếch tán: 0,785 cm2 Môi trường khuếch tán:
.
DD đệm phosphat pH 7,4 (trong nghiên cứu tương quan in vitro – in vivo:
có thay đổi môi trường, bổ sung CDH, dung môi). Thể tích môi trường
khuếch tán: 7 ml. Nhiệt độ môi trường khuếch tán: 34,0 ± 0,5ºC. Tốc độ
khuấy: 400 vòng/phút. Lượng mẫu NNT đem thử: 1 ml.
Lấy mẫu:
- Lấy mẫu tại thời điểm nhất định, mỗi thời điểm lấy mẫu 1 lần, mỗi
lần 1 ml và đồng thời bổ sung 1 ml môi trường khuếch tán mới.
- Lượng DC GP tại từng thời điểm được xác định bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao. Mẫu lấy xong được tiêm thẳng vào hệ thống sắc
ký.
2.3.3.6. Thử vô khuẩn
Thử theo dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 13.7, Phương pháp màng
lọc).
2.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu độ ổn định
Việc khảo sát độ ổn định của thuốc được thực hiện dựa theo Hướng
dẫn của ASEAN với một số điều chỉnh. Cụ thể như sau:
- Đối tượng thử: Mẫu nano nhũ tương diclofenac được đóng trong lọ
thuốc nhỏ mắt bằng HDPE đậy kín.
Điều kiện bảo quản và chu kỳ lấy mẫu kiểm tra: ngăn mát tủ lạnh (5
o
± 3 C); điều kiện thực trong phòng thí nghiệm (15 – 35oC; 60 - 90%); lão
hóa cấp tốc (trong tủ vi khí hậu) (40 ± 2oC; 75 ± 5%). Định kỳ (0, 1, 3, 6)
tháng lấy mẫu kiểm tra. Định kỳ khảo sát các chỉ tiêu: tính chất, giới hạn
8
cho phép về thể tích, định tính, định lượng, phần trăm dược chất giải phóng
in vitro theo thời gian, kích thước giọt nhũ tương và PdI, thế zeta, độ nhớt,
pH, độ vô khuẩn, tỷ lệ dược chất được nhũ tương hoá.
2.3.5. Phƣơng pháp thử kích ứng mắt
Thử nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 10993-10: 2002 (E); B.3 “Ocular
Irritation test”.
2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu sinh khả dụng
2.3.6.1.Phương pháp định lượng dược chất trong dịch tiền phòng
DC có trong dịch tiền phòng của mắt thỏ sau khi nhỏ DD hoặc NNT
nhỏ mắt diclofenac được định lượng bằng phương pháp HPLC với detector
mảng diod (DAD).
2.3.6.2.Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền
phòng
Quy trình thẩm định phương pháp định lượng được tiến hành theo
hướng dẫn của FDA về tính chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính,
giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và
khác ngày), độ ổn định của mẫu định lượng.
2.3.6.3.Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học
+ Quy trình xử lý mẫu và phân tích
Do nồng độ acid diclofenac (ADC) trong dịch tiền phòng khá thấp nên
phải thêm chuẩn để ADC trong mẫu đạt nồng độ trong khoảng tuyến tính đã
khảo sát (500 – 8000 ng/ml). Dịch tiền phòng sau đó được ly tâm ở tốc độ
12000 vòng/phút, tách lấy dịch trong rồi định lượng bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao trong các điều kiện sau như mục 2.3.3.3 với thể tích
tiêm mẫu: 50 µL.
+ Quy trình đánh giá sinh khả dụng:
Chuẩn bị 6 lô thỏ, mỗi lô gồm 12 con thỏ có trọng lượng từ 2,5 – 3 kg.
Lần lượt nhỏ vào mắt trái 0,05 ml NNT, nhỏ vào mắt phải 0,05 ml DD. Ghi
lại thời điểm nhỏ thuốc.
Lấy mẫu: Mỗi con thỏ chỉ được lấy mẫu 1 lần tại một thời điểm nhất định.
Lấy mẫu tại 12 thời điểm lựa chọn tương ứng với 12 con thỏ lần lượt là 10,
20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 và 180 phút. Sử dụng kim tiêm
đường kính 30 gauge. Thể tích dịch tiền phòng lấy ra là 100 μL. Xử lý mẫu
sau đó phân tích bằng phương pháp HPLC.
9
Tính toán và xử lý số liệu: Các thông số dược động học (AUC, AUMC, λz)
được tính toán bằng phương pháp không dựa trên mô hình ngăn với sự trợ
giúp của phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3.
2.3.7. Phƣơng pháp xây dựng tƣơng quan in vitro – in vivo
2.3.7.1. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường giải phóng tới sự giải
phóng dược chất in vitro
Điều kiện: tương tự mục 2.3.3.2
Mẫu thử: 1 ml nano nhũ tương diclofenac 0,093% pha chế ở quy mô
100 ml theo quy trình được lựa chọn. Màng giải phóng: màng Spectra/Por®
2 Dialysis Membrane. Môi trường khuếch tán: DD đệm phosphat với các
pH khác nhau 4,0; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4 và có thêm CDH Tween 80, ethanol
làm tăng độ tan của DC, tăng khả năng giải phóng DC.
Lấy mẫu: Lấy mẫu tại thời điểm 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50
phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút, 105 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút, lấy
mẫu một lần, mỗi lần lấy 1mL rồi bổ sung 1mL môi trường khuếch tán mới.
Lượng DC giải phóng từ NNT được xác định bằng phương pháp HPLC.
2.3.7.2. Mô hình hóa đồ thị giải phóng dược chất in vitro
Sử dụng phần mềm Phoenix WinNolin 6.3, khớp các số liệu của từng
môi trường giải phóng và lựa chọn mô hình phù hợp nhất (Hill, Weibull,
Double Weibull, Makoid-Banakar ) trên tiêu chuẩn thông tin Akaike (AIC).
Mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình phù hợp nhất.
2.3.7.3. Thiết lập mô hình tương quan phù hợp
Sử dụng phần mềm Phoenix IVIVC Toolkit 2.2, mối quan hệ giữa
tỷ lệ hấp thu in vivo và tỷ lệ giải phóng in vitro được thiết lập trên các mô
hình sau: Mô hình 1 (PT1): Fabs=AbsScale*Fdiss(Tscale*Tvivo
)
Mô hình 2 (PT2): Fabs=AbsScale*Fdiss(Tscale*Tvivo-Tshift
)
Mô hình 3 (PT3): Fabs=AbsScale*[Fdiss(Tscale*Tvivo-Tshift)-AbsBase]
Trong đó: Fabs: là (tỷ lệ) giải phóng in vivo dạng NNT so lượng giải
phóng in vivo tối đa của dạng dung dịch; AbsScale: là tỷ lệ quy đổi hấp thu
in vivo với giải phóng in vitro; Fdiss: là tỷ lệ giải phóng in vitro; Tscale: là tỷ
lệ quy đổi thời gian hấp thu in vivo với thời gian giải phóng in vitro; Tvivo
:
thời điểm hấp thu in vivo; Tshift: thời gian tiềm tàng; AbsBase: tỷ lệ hấp thu
cơ sở.
10
2.3.8. Phƣơng pháp ghi và xử lý số liệu
Sử dụng các phần mềm Microsoft Excel 2013, SPSS, MODDE 8.0,
INFORM 3.2, FormRules 2.0 và INForm 3.2, Phoenix WinNonlin 6.3,
Phoenix IVIVC Toolkit 2.2.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất trong mẫu nano
nhũ tƣơng và môi trƣờng giải phóng
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu đối với
diclofenac. Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính
giữa giữa diện tích pic và nồng độ acid diclofenac. Kết quả khảo sát cho
thấy phương pháp có độ đúng cao với khả năng thu hồi trung bình 100,68%
và độ lệch chuẩn tương đối 1,59% (< 2%). Với điều kiện sắc ký đã chọn,
phương pháp định lượng acid diclofenac có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn
tương đối ở 3 nồng độ đều nhỏ hơn 2%.
3.2. Xây dựng công thức và quy trình bào chế nano nhũ tƣơng
Nano nhũ tương được tiến hành bào chế theo quy trình mục 2.3.1
bằng các kỹ thuật bào chế khác nhau: kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật siêu âm kết
hợp đồng nhất hóa áp suất cao và kỹ thuật phân cắt tốc độ cao.
3.2.1. Bào chế nano nhũ tương bằng phương pháp siêu âm
3.2.1.1. Xác định công thức bào chế cơ bản của nano nhũ tương
a. Lựa chọn thành phần: Dược chất, tá dược tạo pha dầu, pha nước, CDH,
CĐDH và một số thành phần khác.
b. Xác định khoảng tỉ lệ các thành phần: Dược chất ADC (0,093%, dung
môi pha dầu (2 – 4%), CDH thân nước (2 – 4%), CDH thân dầu (0,5 –
1%), Chất đồng diện hoạt (0,5 – 1,5%), đệm (0,1 – 0,2 mol/l), pH 6,5 –
7,5, glycerin 5%, nước cất pha tiêm vừa đủ 100%.
c. Thiết kế thí nghiệm và kết quả: Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết
kế thí nghiệm theo nguyên tắc hợp tử tại tâm: thu được bảng thiết kế thí
nghiệm gồm 23 công thức.
11
3.2.1.2. Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm
Qua khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm 15 phút để bào chế nano nhũ
tương với quy mô mẻ 100 ml.
3.2.1.3. Xác định quy trình bào chế cơ bản bằng phương pháp siêu âm
Với mỗi công thức, 100 ml NNT được bào chế bằng kỹ thuật siêu âm
với các bước 1, 2, 4, 5, 6 theo quy trình mục 2.3.1, trong đó:
- Bước 3: Tiến hành ĐNH nhũ tương sử dụng máy siêu âm với tần số
30000 Hz, biên độ 100 µm, siêu âm liên tục trong thời gian 15 phút.
3.2.1.4. Đánh giá ảnh hưởng của các thành phần trong công thức đến đặc
tính vật lý và khả năng giải phóng dược chất in vitro của nano nhũ tương
Phân tích mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập và các biến
phụ thuộc, xử lý số liệu bằng phần mềm FormRules 2.0. Các yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng GPDC của NNT: Lượng Span 80 tăng và lượng
Transcutol HP giảm, hỗn hợp Tw 80/Cre EL làm tăng phần trăm giải phóng
của dược chất. Các yếu tố ảnh hưởng tới độ bền của NNT: Khi hệ đệm là
borat thì NNT ADC ổn định nhất. Khoảng pH càng thấp thì độ bền hệ càng
cao, ở pH lớn hơn thì độ bền hệ giảm. Loại dung môi pha dầu là Miglyol,
Labrafac hay IPM ít ảnh hưởng tới độ bền của hệ; tuy nhiên với pha dầu là
Miglyol cho thấy hệ độ bền hệ cao nhất. Các yếu tố ảnh hưởng tới KTG của
NNT: thành phần dầu là IPM ít làm ảnh hưởng tới sự thay đổi KTG, với
thành phần dầu là Miglyol và Labrafac đều làm tăng kích thước giọt tuy
nhiên lượng dầu thay đổi không ảnh hưởng tới KTG. Tỉ lệ chất diện hoạt
thân nước Tw/Cre tăng sẽ làm tăng kích thước giọt. Các yếu tố làm ảnh
hưởng tới thế zeta: thành phần đệm borat với lượng đệm nhỏ cũng làm tăng
thế zeta của hệ nano nhũ tương và làm tăng sự ổn định của hệ. Lượng
Transcutol HP tăng làm tăng nhẹ thế zeta của hệ nhưng không đáng kể.
3.2.1.5. Tối ưu hóa công thức bào chế nano nhũ tương
Lựa chọn được 3 công thức tối ưu khi thay đổi thành phần dầu:
12
Bảng 3.22: Thành phần công thức NNT đƣợc lựa chọn
X2
X4 X5 X6
X8
Stt
DC
X1
X3
X7
X9
(%)
(%) (%) (%)
(mol/l)
CT1 ADC Tw/Cr : 1/1
CT2 ADC Tw/Cr : 1/1
2
2
Miglyol
IPM
2
2
0,5 0,5 Borat 0,14 7,5
0,5 0,5 Borat 0,14 7,5
Labrafac
PG
CT3 ADC Tw/Cr : 1/1
2
2
0,5 0,5 Borat 0,14 7,5
Tiến hành bào chế 100 ml mẫu NNT theo công thức tối ưu 1, 2, 3 có
thành phần như ở bảng 3.22 và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng. Kết quả
cho thấy các CTTƯ đều mang đặc tính của chế phẩm NNT. CTTƯ 1 và 2
được tiến hành lựa chọn để tiến hành thử nghiệm tiếp theo với kỹ thuật bào
chế siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao.
3.2.2. Bào chế nano nhũ tƣơng bằng kỹ thuật siêu âm kết hợp đồng
nhất hóa áp suất cao
5 CT được lựa chọn để khảo sát cụ thể như sau: CT1, CT 16 và CT
20 (Bảng 3.17), CTTƯ1 và CTTƯ 2 (Bảng 3.22) để tiến hành khảo sát bào
chế bằng thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao. Mỗi CT bào chế 100 ml
bằng kỹ thuật siêu âm theo mục 3.2.1.3, sau đó tiến hành ĐNH liên tục 50
ml mẫu NNT trong 12 phút ở áp suất 500 bar.
Tiến hành đánh giá một số CTCL của NNT bào chế bằng thiết bị siêu
âm và siêu âm + ĐNH sau thời gian 12 phút. Kết quả cho thấy quá trình
đồng nhất hóa sau siêu âm là không cần thiết. Vì thế quy trình này không
được lựa chọn để bào chế NNT cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Bào chế nano nhũ tƣơng bằng thiết bị phân cắt tốc độ cao
3.2.3.1. Xác định công thức bào chế cơ bản
Các thành phần công thức được lựa chọn tương tự như phương
pháp siêu âm, tuy nhiên trong quá trình tham khảo tài liệu có điều chỉnh lại
tỷ lệ một số thành phần (dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt) thấp hơn
so với thành phần công thức bào chế bằng thiết bị siêu âm với mong muốn
đạt được chế phẩm nano nhũ tương cho phân bố KTTP đồng nhất, đạt tỷ lệ
nhũ hóa cao, nhũ tương ổn định, đạt phần trăm giải phóng dược chất cao và
không gây kích ứng mắt.
13
3.2.3.2. Xác định quy trình bào chế cơ bản bằng máy phân cắt tốc độ
cao
Bước 1, 2, 4, 5, 6: Tương tự phương pháp siêu âm. Bước 3: Tiến hành
đồng nhất hóa nhũ tương sử dụng máy phân cắt tốc độ cao với tốc độ phân
cắt được khảo sát từ 10000 vòng/phút đến 16000 vòng/phút. Thời gian phân
cắt từ 5 - 10 phút.
3.2.3.3. Thiết kế thí nghiệm
Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo nguyên
tắc hợp tử tại tâm. Thiết kế thí nghiệm được 30 công thức.
3.2.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của các thành phần công thức đến một số
đặc tính vật lý của nano nhũ tƣơng
a. Các đặc tính vật lý của hệ
Phân tích mối quan hệ nhân quả giữa các biến độc lập và các biến
phụ thuộc, xử lý số liệu bằng phần mềm FormRules 2.0. Các yếu tố ảnh
hưởng đến KTG của NNT: Tỉ lệ Transcutol HP càng tăng thì KTG tại pic
của NNT càng tăng. Tỉ lệ CDH càng tăng thì KTG tại pic càng tăng. Nếu tỉ
lệ CDH nằm trong khoảng 1 - 1,5 % thì KTG nhỏ và hầu như không có sự
thay đổi. Khi CDH tăng đến 2%, KTG tại pic tăng mạnh. KTG cũng giảm
khi thời gian phân cắt tăng. Tốc độ phân cắt tăng từ 10000 đến 13000 vòng/
phút cho thấy làm giảm KTG. Tốc độ phân cắt khoảng 13000 vòng/phút sẽ
cho KTG thu được từ các mẫu NNT là nhỏ nhất. Nếu tăng tốc độ phân cắt
từ 13000 đến 16000 vòng/phút sẽ làm KTG tăng dần.
Các yếu tố ảnh hưởng đến thế điện tích bề mặt của NNT: Tỉ lệ CDH
thân nước càng giảm, Transcutol HP càng tăng, tỉ lệ Span 80 càng tăng thì
thế zeta càng giảm làm tăng độ ổn định của hệ. Tỉ lệ CDH thân nước có ảnh
hưởng lớn nhất, tuy nhiên khi tỉ lệ nằm trong khoảng 1 - 1,5% thì thế zeta ở
mức thấp nhất, và không thay đổi nhiều.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra NNT được bào chế bằng thiết bị phân cắt
tốc độ cao cho thấy các mẫu NNT được bào chế ở quy mô nhỏ dễ bị mắc
kẹt lại trong thiết bị do đó cho tỉ lệ nhũ hóa không cao, hệ NNT kém ổn
định (thế zeta < 30 mV). Thiết bị có cấu tạo phức tạp khó đảm bảo được
tiêu chí vô khuẩn trong bào chế thuốc nhỏ mắt. Vì vậy thiết bị này cũng
không được lựa chọn cho quy trình bào chế NNT trong các nghiên cứu tiếp
theo.
14
3.3. NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ
Kỹ thuật siêu âm là một trong 3 kỹ thuật được sử dụng trong quá
trình nhũ hóa bào chế nano nhũ tương diclofenac, đây là kỹ thuật cho thấy
nhiều ưu điểm khi sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Do đó kỹ thuật này
được lựa chọn trong nghiên cứu nâng quy mô.
Mẫu nano nhũ tương bào chế theo thành phần CTTƯ 2 có phân bố
KTG dưới 200 nm, GTTĐ của thế zeta < 30 mV, PdI < 0,3 khi được bào
chế bằng các kỹ thuật khác nhau, chính vì thế mẫu NNT bào chế theo thành
phần CTTƯ 2 được lựa chọn để tiến hành khảo sát thời gian siêu âm phù
hợp khi nâng quy mô lên 1000 ml.
3.3.1. Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm khi nâng quy mô
Kết quả chỉ ra rằng lựa chọn thời gian siêu âm là 45 phút cho quy
trình nâng quy mô bào chế lên 1000 ml là hợp lý và có ý nghĩa thống kê.
3.3.2. Đánh giá tính lặp lại của quy trình khi nâng quy mô bào chế
Bào chế mẫu nano nhũ tương theo thành phần CTTƯ 2 với 3 mẻ (mẻ:
001, 002, 003) ở quy mô 1000 ml theo quy trình mục 3.2.1.3 và mục 3.3.1.
Tiến hành đánh giá các CTCL theo phương pháp nêu ở mục 2.3.3.
Nhận thấy các chỉ tiêu này đều nằm trong giới hạn cho phép. Kết quả cho
thấy không có sự khác nhau về các chỉ tiêu chất lượng giữa 3 mẻ bào chế ở
quy mô 1000 ml ở cùng điều kiện nghiên cứu (P > 0,05).
3.4. DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG CỦA NANO NHŨ
TƢƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC
Căn cứ vào các nghiên cứu đã trình bày ở mục 3.2, 3.3 và tham
khảo “PL 1.14: Thuốc nhỏ mắt” trong DĐVN IV, dự thảo tiêu chuẩn chất
lượng của NNT nhỏ mắt diclofenac được xây dựng như sau: tính chất (NNT
màu trắng đục hoặc trong mờ, không mùi); giới hạn cho phép về thể tích
(nằm trong giới hạn 100% đến 110% thể tích ghi trên nhãn); định tính
(dương tính với diclofenac); định lượng (phải đạt từ 90,0 đến 110,0% so với
hàm lượng ghi trên nhãn); phần trăm DC GP in vitro theo thời gian qua
màng Spectra/Por® 2 Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 12-
14 kD. Môi trường đệm phosphat pH 7,4 (1 giờ: < 10%, 2 giờ: 10 – 15%, 3
giờ: 15 – 25%); KTG nhũ tương (phải nhỏ hơn 200 nm); chỉ số đa phân tán
(PdI) (phải nhỏ hơn 0,4); thế zeta (phải không dưới 30 mV); độ nhớt (độ
15
nhớt của chế phẩm phải từ 4,0 đến 6,0 cP); pH (6,0 – 8,0); độ vô khuẩn
(đạt vô khuẩn); tỉ lệ DC được nhũ tương hoá (không dưới 90%).
3.5. Đánh giá độ ổn định của nano nhũ tƣơng nhỏ mắt
Kết quả đánh giá tuy có thay đổi, nhưng các chỉ tiêu chất lượng vẫn
nằm trong giới hạn cho phép trong TCCS sau 6 tháng bảo quản ở cả 3 điều
kiện. Tính toán dự đoán thọ bằng phần mềm Minitab 17.2.1, tuổi thọ chế
phẩm bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC dài hơn trên 24 tháng. Như vậy, nano
nhũ tương nhỏ mắt nên được bảo quản ở 2 – 8oC và hạn dùng thực tế cần
được xác định dựa trên số liệu nghiên cứu dài hạn đầy đủ (dự kiến là 24
tháng).
3.6. Khảo sát đặc tính của mẫu nano nhũ tƣơng đƣợc lựa chọn để đánh
giá sinh khả dụng
Mẫu nano nhũ tương theo CTTƯ 2 (bảng 3.22) được tiến hành bào
chế với quy mô 100 ml theo mục 3.2.1.3. Mẫu nano nhũ tương sau bào chế
được đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng theo các phương pháp đã nêu mục
2.3.3. Sau đây là một số kết quả thu được:
a. Hình thức: NNT có màu trắng đục, đồng nhất, để lâu không bị phân lớp.
b. Hình thái hệ
Hình 3.31: Ảnh TEM của nano nhũ tƣơng diclofenac
Nhận xét: Ảnh TEM của NNT cho thấy: các tiểu phân đều có hình
tròn, tách rời nhau, và có lớp CDH và CĐDH (màu nhạt hơn) bao xung
quanh các tiểu phân.
16
Tải về để xem bản đầy đủ
29 trang
05/04/2022
6360
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Tóm tắt Luận án Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt Diclofenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- tom_tat_luan_an_nghien_cuu_bao_che_nano_nhu_tuong_nho_mat_di.pdf
