Dự thảo tóm tắt Luận án Nghiên cứu sự thay đổi của gen AHR và AIP ở các nạn nhân nhiễm dioxin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI CỦA GEN AHR VÀ AIP

Ở CÁC NẠN NHÂN NHIỄM DIOXIN

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số:

62 42 01 21

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2017

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên - ĐHQGHN

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. PGS. TS Nông Văn Hải

2. PGS. TS Nguyễn Huy Hoàng

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Đại học

Quốc gia họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào

hồi…..ngày……tháng…...năm 20

Có thể tìm hiểu luận án tại:

-

Thư viện Quốc gia Việt Nam;

Trung tâm Thông tin Thư viện - ĐHQGHN

MỞ ĐẦU

Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) là thụ thể tiếp nhận dioxin

và nhiều chất ô nhiễm môi trường khác. Khi AhR được hoạt hóa bởi

phối tử, dẫn đến điều hòa biểu hiện các gen tham gia nhiều quá trình

sinh lý quan trọng của cơ thể. Các cá thể khác nhau, mặc dù phơi

nhiễm với các chất độc trong môi trường như nhau, nhưng lại chịu

ảnh hưởng cũng như có nguy cơ với ung thư là khác nhau. Điều này

có liên quan đến đa hình gen AhR và AIP (Aryl hydrocarbon receptor

Interacting Protein). Trên thế giới, các nghiên cứu về gen AhR và

AIP chủ yếu trên người không phơi nhiễm dioxin. Ở Việt Nam, đã có

những nghiên cứu về gen trên đối tượng phơi nhiễm dioxin.Tuy

nhiên, chưa có nghiên cứu nào về gen AIP cũng như đa hình/đột biến

trên toàn bộ exon gen AhR ở người phơi nhiễm có nồng độ dioxin

trong máu cao. Ảnh hưởng tác động của dioxin cũng như các chất ô

nhiễm môi trường qua con đường tín hiệu AhR vẫn được coi là phức

tạp, chưa được biết đầy đủ, có nhiều kết quả trái chiều nhau. Hiện

nay cũng chưa có dữ liệu đầy đủ về các gen chịu ảnh hưởng của tác

động dioxin. Xuất phát từ thực tễ trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu sự thay đổi của gen AhR và AIP ở các nạn nhân

nhiễm dioxin”nhằm mục tiêu sau: (1) Xác định đa hình/đột biến các

gen AhR và AIP ở người sống trong vùng phơi nhiễm dioxin và

người có nồng độ dioxin trong máu cao; (2) Tìm hiểu mối liên hệ

giữa những đa hình/đột biến các gen AhR và AIP với dioxin, trong đó

có các bệnh liên quan đến dioxin; (3) Bước đầu giải trình tự toàn bộ

hệ gen biểu hiện (whole exome sequencing, WES) ở người có nồng

độ dioxin trong máu cao, để phân tích các biến đổi gen có thể liên

quan đến chuyển hóa dioxin.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ DIOXIN

1.1.1. Khái niệm dioxin và các hợp chất tƣơng tự dioxin

Thuật ngữ “Dioxin” thường được sử dụng để nói đến 2 nhóm

chất là policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) và policlodibenzofuran

(PCDF). Trong các chất dioxin có 2,3,7, 8-tetrachlorodibenzo-p-

dioxin (TCDD) là chất độc nhất.

1.1.2. Đặc tính của dioxin

Dioxin có độ bền vững cao. Thời gian bán hủy trong cơ thể

người là từ 5-12 năm. Khoảng 90% dioxin hấp thụ vào cơ thể qua

con đường ăn uống.

1.1.3. Ảnh hƣởng của dioxin đối với sức khỏe con ngƣời

Dioxin gây tổn thương đa dạng và phức tạp, làm phát sinh

nhiều bệnh lý ở các cơ quan khác nhau. Dioxin không chỉ gây tổn hại

tới sức khỏe của người bị phơi nhiễm mà còn gây ảnh hưởng tới con

cái họ ở những thế hệ kế tiếp trong tương lai.

1.1.4. Một số phƣơng pháp định lƣợng dioxin

1.1.3.1. Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ độ phân giải cao,

1.1.3.2. Phương pháp DR CALUX

1.2. CƠ CHẾ PHÂN TỬ TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN

1.2.1. Thụ thể Aryl hydrocarbon receptor (AhR)

1.2.1.1. Cấu trúc của thụ thể AhR

Thụ thể AhR - thụ thể của dioxin được hoạt hóa bởi các phối

tử (ligand). Phối tử điển hình của AhR là TCDD. AhR là một thành

viên của họ protein thuộc nhân tố điều hòa phiên mã (transcription

factor), có cấu trúc basic helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim

1

(bHLH/PAS). AhR có các vùng cấu trúc đảm nhiệm các chức năng:

liên kết với phối tử, liên kết với DNA của gen đích, liên kết các

protein thành phần và chức năng hoạt hóa phiên mã.

1.2.1.2. Vai trò của protein AhR trong cơ thể

AhR là yếu tố điều hòa biểu hiện các gen tham gia đảm

nhiệm các chức năng sinh lý quan trọng của cơ thể. AhR tham gia

biệt hóa nhiều loại tế bào trong giai đoạn sớm của quá trình phát

triển cá thể (Li Y, 2011; Gargaro, 2016). AhR đóng vai trò thiết yếu

trong việc duy trì cân bằng nội môi trong tế bào. Khi cơ thể tích tụ

dioxin có thể chứa protein AhR được hoạt hóa lâu dài, thường xuyên,

dẫn đến trạng thái ức chế miễn dịch thường xuyên và liên tục (Ridolfi,

2010).

1.2.1.3. Vai trò protein AhR đối với bệnh ung thư

Thông qua thụ thể AhR, dioxin ảnh hưởng lên các giai đoạn

của ung thư. Mức độ biểu hiện cao của AhR có liên quan lớn với sự

tiến triển ung thư cũng như với tỷ lệ mắc ung thư (Dietrich, 2010;

Safe, 2013). Ngoài ra, AhR đóng vai trò quan trọng trong giảm kết

dính tế bào dẫn đến gia tăng sự xâm lần mô và di căn của tế bào ung

thư. Mặt khác, AhR có thể hoạt động như một gen ức chế khối u

(tumor suppressor gene) và gen trở nên không hoạt động trong quá

trình hình thành khối u ở một số điều kiện nhất định (Fan Y, 2010).

1.2.2. Cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR

1.2.2.1. Con đường tín hiệu cổ điển (canocial signaling pathway)

Trong điều kiện không có phối tử, AhR trong tế bào chất, liên

kết với các protein thành phần như: AIP (aryl hydrocarbon receptor

interacting protein), p23 và 2 phân tử HSP90 (90-kDa heat shock

2

protein). Khi dioxin khuếch tán qua màng tế bào vào liên kết với AhR,

phức hệ AhR được hoạt hóa, thay đổi cấu hình và vận chuyển vào

trong nhân tế bào. Trong nhân, AhR được giải phóng khỏi hệ thống

phức hợp các protein thành phần và tương tác với nhân tố dẫn truyền

nhân ARNT (AHR nuclear translocator-ARNT). Phức hệ AHR/ARNT

sau đó liên kết với vị trí DNA đặc biệt trên gen đích, gọi là yếu tố đáp

ứng với các chất lạ (xenobiotic respone element, XRE) hay yếu tố đáp

ứng dioxin (dioxin response element, DRE), qua đó điều hòa biểu hiện

các gen đích (Quintuna, 2013; Wright, 2017).

1.2.2.2. Con đường tín hiệu phi cổ điển (non-canocial signaling

pathway)

AhR còn điều hòa phiên mã gen đích thông qua con đường

khác không liên quan đến trình tự đáp dioxin (DRE) trên gen đích,

mà qua vị trí DRE (non-consensus DRE, NC - DRE) trên vùng

promoter của gen đích. Để liên kết được với trình tự này, AHR cần

kết hợp một protein Kruppel-like Factor 6 (KLF6) và có sự đồng tham

gia của protein carbamoyl phosphate synthase 1 (CPS1) (Wright, 2017).

1.2.3. Dioxin gây biến đổi vật chất di truyền

Dioxin là tác nhân môi trường gây tổn thương vật chất di truyền

và phát sinh đột biến gen thông qua hình thành các gốc tự do chứa oxy

hoạt động (reactive oxygen species, ROS) (Mates, 2010; Franken, 2017).

1.3. TỔNG QUAN VỀ GEN AHR

1.3.1. Đặc điểm gen AhR ở ngƣời

Gen AHR ở người có kích thước khoảng 50 kb, nằm trên vai

ngắn của nhiễm sắc thể số 7 (7p21.1), gồm 11 exon và 10 intron, mã

hóa protein AhR có 848 acid amin.

3

1.3.2. Vai trò của đa hình gen AhR trong chuyển hóa dioxin và

các chất ô nhiễm môi trƣờng

Đa hình gen AHR thúc đẩy hoặc kìm hãm hoạt động của thụ

thể AhR. Đa hình gen AHR có thể điều chỉnh đáp ứng của cơ thể đối

với các nhân tố gây tổn hại gen có trong môi trường sống (Ridolf,

2014). Mặc dù ô nhiễm môi trường và dioxin làm gia tăng nghiêm

trọng tỷ lệ ung thư, vẫn có nhiều cư dân sống trong vùng ô nhiễm lại

không mắc ung thư hay các bệnh liên quan đến dioxin. Điều này

được giải thích dựa trên cơ sở ái lực liên kết giữa dioxin với receptor

AHR. Các cá thể khác nhau trong nhạy cảm với dioxin có thể là do

các đa hình gen AHR mã hóa các receptor có ái lực khác nhau với

TCDD (Ridolf, 2014; Kovalova 2016).

1.4. TỔNG QUAN VỀ GEN AIP

1.4.1. Đặc điểm gen AIP

Gen AIP nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (11q13.2) có 6 exon mã

hóa protein AIP có 330 amino acid, trọng lượng phân tử là 37 kDa.

1.4.2. Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ở ngƣời

Các thể đột biến protein AIP mất khả năng ức chế phân bào và

không có khả năng liên kết với các protein thành phần, bao gồm cả

các protein trong con đường thụ thể AhR (Igreja, 2010). AIP hoạt

động như là nhân tố áp chế khối u ở hầu hết các mô. Đột biến gen

AIP liên quan tới bệnh u tuyến yên (Hernandez, 2017).

1.5. VAI TRÒ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƢỜNG TÍN HIỆU

THÔNG QUA THỤ THỂ AHR

AIP có vai trò ổn định phức hợp của AhR gắn kết với phối tử,

duy trì AhR trong bào tương, ngăn chặn sự phân giải AhR bởi

proteasome. AIP có thể ảnh hưởng đến tính nguyên vẹn của AhR

4

hoặc sự truyền tín hiệu của thụ thể AhR (Jaffrain, 2009). AIP còn

điều hòa hoạt động phiên mã của gen AhR. Sự nhạy cảm của tế bào

với dioxin có liên quan tới protein AIP. Đột biến mất chức năng AIP

dẫn đến bất thường trong điều hòa biểu hiện các gen đích của con

đường tín hiệu AhR (Nukaya, 2010; Rowland, 2011).

1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM

DIOXIN Ở VIỆT NAM

Tại Việt Nam, đã có các nghiên cứu đánh giá sự thay đổi nội

tiết, miễn dịch, sinh hoá, huyết học và tồn lưu dioxin trong máu,

trong sữa mẹ ở những người dân sống trong vùng ô nhiễm chất da

cam/dioxin. Các nghiên cứu điều tra thực trạng, cơ cấu bệnh tật trên

đối tượng nạn nhân dioxin. Các nghiên cứu phân tử đã chỉ ra những

thay đổi trong biểu hiện/đột biến ở một số gen trên đối tượng phơi

nhiễm dioxin như: p53, CypP1A1, AhR, CypP1B1, hOGG1... Đối

với các gen AhR, chưa có nhiều nghiên cứu tập trung xác định đa

hình/đột biến trên toàn bộ vùng biểu hiện gen AhR. Với gen AIP, cho

đến nay chưa có nghiên cứu về biến đổi gen AIP ở người nhiễm

dioxin nói riêng và quần thể người Việt Nam nói chung.

1.7. NGHIÊN CỨU HỆ GEN (GENOME) VÀ HỆ GEN BIỂU HIỆN

(EXOME) TRÊN ĐỐI TƢỢNG NHIỄM DIOXIN

Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) trên các đối tượng nạn

nhân dioxin đã được tiến hành ở tài cấp Nhà nước 33 (KHCN-33/11-

15), theo mô hình trio (bố - con – mẹ) đã giải mã hệ gen một số gia

đình nạn nhân chất độc da cam. Giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES)

được thực hiện trên đối tượng con/cháu của các nạn nhân chất độc da

cam bị thiểu năng trí tuệ trong đề tài NAFOSTED (106-YS.01-2014.34).

5

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu phơi nhiễm dioxin là 93 người đã được

xét nghiệm dioxin trong huyết thanh máu (thuộc đề tài Nhà nước

KHCN-33.04/11-15). Đối tượng không phơi nhiễm dioxin là 20

người dân sống ở khu vực quận Hà đông, Hà Nội. Đối tượng nghiên

cứu giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là 1 cựu chiến binh bị

nhiễm dioxin (thuộc đề tài NAFOSTED 106-YS.01-2014.34).

2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ

Hóa chất của các hãng: Sigma, Quiagen, Fermentas…Trang

thiết bị của Viện nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

6

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số

2.3.2. Đo quang phổ DNA

2.3.3. Điện di DNA trên gel Agarose

2.3.4. Nhân gen bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.3.5. Giải trình tự gen tự động

2.3.6. Phương pháp giải trình tự toàn bộ exon (WES)

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Chúng tôi phân tích chỉ số sinh học của 114 mẫu (94 mẫu phơi

nhiễm và 20 mẫu không phơi nhiễm dioxin). Các mẫu phơi nhiễm

dioxin được phân thành 3 nhóm:

Bảng 3.1. Phân nhóm đối tƣợng nghiên cứu

Nhóm đối tƣợng

n

Tổng

Không phơi nhiễm dioxin

20

Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10

27

34

ppt và bị bệnh liên quan dioxin

Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt

và không bị bệnh liên quan dioxin

Phơi nhiễm

94

dioxin

Nhóm 3: dioxin trong máu <10

ppt và không bị bệnh liên quan

dioxin

33

Tổng

114

Trong các bệnh liên quan đến dioxin mà đối tượng trong

nghiên cứu mắc phải, bệnh ung thư và đái tháo đường type II chiếm

tỷ lệ cao nhất, trong đó các đối tượng đa phần bị mắc đồng thời cả

7

bệnh ung thư và đái tháo đường type II (9/27 mẫu; 33,33%). Độ tuổi

trung bình của đối tượng phơi nhiễm và không phơi nhiễm tương

đương nhau. Độ tuổi trung bình của 3 nhóm trong vùng phơi nhiễm

có sự chênh lệch, tuy nhiên khác biệt không có ý nghĩa thống kê

(p>0,05). Nữ giới chiếm tỷ lệ cao hơn nam giới trong cả 2 nhóm phơi

nhiễm và không phơi nhiễm dioxin. Tuy nhiên, ở nhóm có dioxin

≥10 ppt, bị bệnh liên quan dioxin thì nam chiếm tỷ lệ cao hơn nữ

khoảng 1,5 lần. Trong khi ở 2 nhóm còn lại, nữ giới nhiều gấp 1,6

đến 1,7 lần so với nam giới. Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index,

BMI) liên quan đến nồng độ dioxin trong cơ thể cũng như khả năng

đào thải dioxin. Chỉ số BMI ở 3 nhóm đối tượng trong vùng phơi

nhiễm dioxin không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0,05.

Tỷ lệ người thừa cân, béo phì tương đương nhau giữa nhóm 1 và

nhóm 2. Trong nhóm 3 tỷ lệ người béo phì thấp hơn, tuy nhiên khác

biệt này không có ý nghĩa thống kê .

3.2. ĐA HÌNH CÁC GEN AHR VÀ AIP

3.2.1. Tách chiết DNA tổng số

3.2.2. Nhân bản gen các gen AHR và AIP

Sản phẩm PCR khuếch đại 11 exon gen AhR và 6 exon gen

AIP là đặc hiệu, có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết.

3.2.3. Phân tích đa hình gen AHR

Xác định được 4 đa hình trên exon và exon 10; 1 đa hình

intron 5 gen AhR. Các đa hình đều xuất hiện riêng lẻ ở các cá thể

khác nhau.

8

Bảng 3.6. Các đa hình gen AhR phát hiện trong nghiên cứu

Nhóm đối tƣợng

Thay

đổi

protein

Số hiệu

Thay đổi

nucleotide

Số mẫu

(n)

Vị trí

PN

Không PN

% (n)

đa hình

% (n)

22

rs17779352 Exon 2

c.132T>C

N44N

-

8,3% (1)

0

rs3802082

rs2066853

Intron 5

c.575-199A>T

c.1661G>A

75,0% (9)

60% (6)

Exon 10

R554K

N487D

I514T

114

63,8% (60) 65% (13)

rs75519181 Exon 10 c.1459A>G

rs779531731 Exon 10 c.1541T>C

2,10% (2)

1,10% (1)

0

Chú thích: PN - phơi nhiễm. Không PN - không phơi nhiễm. Dấu - biểu thị đa hình

không làm thay đổi protein

Phân tích so sánh tần số các đa hình gen AR trong nghiên cứu

này và một số quần thể người trên thế giới theo Human Genetic

Varition Database (HGVD), vói n=100 cho mỗi quần thể. Người

Việt Nam trên HGVD là người Kinh sống ở thành phố Hồ Chí Minh

Bảng 3.7. Tần suất các đa hình gen AhR trong nghiên cứu, so sánh với

đa hình ở các quần thể ngƣời (theo HGVD )

Tần số đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể

Số hiệu

Nghiên cứu

Việt

Nhật

Trung Nam Châu Châu Châu

đa hình

n (%)

Nam bản

quốc

5,6

Á

Phi

4,1

24

70,7 31,7 20,9

Mỹ

6,3

30,9 30,3

Âu

rs17779352

rs3802082

rs2066853

rs75519181

rs779351731

1/22 (4,5)

15/22 (68,2)

73/114 (64)

2/114 (1,8)

1/114 (0,9)

8,1

57,4

56,6

0.0

5,8

18,8

14,1

70,2

71,2

2,9

70,4

67,6

2,9

73,8

27,4

0

---

Ký hiệu ---là không có thông tin tần số đa hình trên Human Genetic Varition Database

9

3.2.3.1. Đa hình trên exon 2 gen AhR

Đa hình trên exon 2 được phát hiện là c.132T>C, p.N44=, số

hiệu rs17779352, có ở một mẫu vùng phơi nhiễm, đối tượng có nồng

độ TCDD trong máu cao (53,57ppt), chẩn đoán mắc bệnh ung thư

khí quản và tiểu đường type II.

3.2.3.2. Đa hình trên intron 5 gen AhR

Đa hình được phát hiện là rs3802082 (c.575-199A>T), tần số

68,2%. Tần số đa hình ở quần thể người Việt Nam là 57,4 % . Ở các

quần thể người đa hình đều xuất hiện với 3 kiểu gen AA, AT và TT.

Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, đa hình chỉ thấy có 2 kiểu gen TA

và TT, không có kiểu (AA) ở tất cả các mẫu nghiên cứu.

3.2.3.3. Đa hình trên exon 10 gen AhR

Phát hiện thấy có 3 điểm đa hình exon 10 đều dẫn đến thay đổi

amino acid (Bảng 3.8). Tần số kiểu gen của cả 3 đa hình đều đạt

trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg.

Bảng 3.8. Tần suất allele, kiểu gen các đa hình exon 10 gen AhR

Kiểu gen

n, (%)

Allele

%

Đa hình

HWpval

Kiểu gen

GG

allele

36% (41)

51,8% (59)

rs2066853

G

A

61,8%

38,2%

GA

0.4317

Đa hình (1)

AA

GA

AA

TT

12,3% (14)

1,8% (2)

G

A

T

99,1%

0,9%

rs75519181

1

Đa hình (2)

98,2% (112)

99,1% (113)

99,6%

0,4%

rs779351731

CT

C

Đa hình (3)

0,9% (1)

HWpval (Hardy-Weinberg p value): giá trị cân bằng Hardy-Weinberg, tần

số các kiểu gen đạt trạng thái cân bằng khi p>0.001.

10

Đa hình (1) exon 10 gen AhR: rs2066853

Đa hình rs2066853 (c.1661G>A, p.R554K) chiếm tỷ lệ cao

(64%), xuất hiện ở cả 3 kiểu gen là GG, GA và AA.

Phơi nhiễm

Tỷ lệ %

55

60

40

20

0

51

Không phơi nhiễm

36

35

13

10

Kiểu gen

GG

GA

AA

Hình 3.10. Phân bố các kiểu gen của đa hình rs2066853 gen AhR

ở nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin

Trục tung: Tỷ lệ % đối tượng nghiên cứu. Trục hoành: Các kiểu gen (GG, GA và

AA) của đa hình rs206853 gen AhR. Cột màu đỏ biểu thị nhóm đối tượng phơi

nhiễm dioxin. Cột màu xanh biểu thị nhóm đối tượng không phơi nhiễm dioxin.

Kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao hơn kiểu gen GG ở cả vùng phơi

nhiễm và không phơi nhiễm dioxin (Hình 3.10).

Bảng 3.10. Tần suất các kiểu gen (GG, GA, AA) của đa hình rs2066853

gen AhR ở 3 nhóm vùng phơi nhiễm dioxin

Kiểu gen: %, (n)

Nhóm nghiên cứu

P

GG

GA

AA

Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt,

bị bệnh liên quan dioxin

55,6 %

(15

29,6%

(8)

14,8%

(4)

Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt,

không bị bệnh liên quan dioxin

23,5%

(8)

64,7%

(22)

11,8%

(4)

P=0.083

Nhóm 3: dioxin trong máu <10 ppt,

không bị bệnh liên quan dioxin

12,1

(4)

33,3%

( 11)

54,6%

(18)

11

Tần số các kiểu gen GG, GA và AA giữa 3 nhóm trong vùng

phơi nhiễm không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0.05,

(bảng 3.10). Tuy nhiên, ở nhóm 1 tần số kiểu gen GG cao hơn 1,88

lần kiểu gen GA. Ngược lại, ở nhóm 2, tần số kiểu gen GA lại cao

hơn 2.75 lần so với kiểu gen GG. Để đánh giá sự khác biệt này có ý

nghĩa thống kê hay không, chúng tôi phân tích riêng tần số kiểu gen

GG và GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 (bảng 3.11)

Bảng 3.11. Tần suất kiểu gen GG và GA của đa hình rs2066853

gen AhR ở nhóm 1 và nhóm 2 vùng phơi nhiễm dioxin

Kiểu gen: %, (n)

Nhóm nghiên cứu

p, OR, 95%CI

GG

GA

65,2 %

(15)

34,8%

(8)

Nhóm 1: dioxin trong máu ≥10 ppt, bị

bệnh liên quan dioxin

p = 0.005

OR = 5.156

26,7%

(8)

73,3%

(22)

Nhóm 2: dioxin trong máu ≥10 ppt,

không bị bệnh liên quan dioxin

95%CI:

(1.585 - 16.1771)

Chú thích: p thu được từ kiểm định χ², OR (Odd ratio): tỷ số chênh. 95%CI

(95% confidnece interval): khoảng tin cậy 95%.

Sự khác biệt kiểu gen GG và GA giữa nhóm 1 và nhóm 2 có ý

nghĩa thống kê (OR = 5.156; 95%CI: 1.585 - 16.1771; p<0.01). Các

đối tượng ở nhóm 1 và nhóm 2 đều có nồng độ dioxin trong máu cao,

ở nhóm 1 các cá thể bị bệnh liên quan dioxin, có tần suất kiểu GA

chiếm tỷ lệ thấp, trong khi ở nhóm 2, các cá thể không bị bệnh liên

quan dioxin, kiểu gen GA chiếm tỷ lệ cao. Điều đó cho thấy, đa hình

rs2066853 kiểu gen GA có thể có vai trò làm giảm ảnh hưởng gây

hại của dioxin ở những người bị nhiễm dioxin, so với những người

nhiễm dioxin không có kiểu gen GA. Ngoài ra, đa hình gen AhR

được cho là có ảnh hưởng làm giảm sự nhạy cảm và ái lực của thụ

12

thể AhR với các phối tử (Frericks, 2008; Chen, 2009). Trong nghiên

cứu này, nhóm có dioxin trong máu <10 ppt (nhóm 3) tần suất kiểu

gen GA (54,6%) cao hơn kiểu gen GG (33,3%) (Bảng 3.10). Điều

này cũng có thể là do kiểu gen GA liên quan đến giảm nhạy cảm và

ái lực của thụ thể AhR với dioxin ở những người bị phơi nhiễm. Để

đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen GG và GA của đa hình

rs2066853 với ung thư trong nhóm có dioxin trong máu cao, chúng

tôi phân tích tần suất kiểu gen GG và GA các đối tượng dioxin trong

máu ≥10 ppt bị ung thư và dioxin trong máu ≥10 ppt không bị ung

thư (Hình 3.11).

Tỷ lệ %

GA

GG

120

100

80

60

40

20

0

GA

23.1%

GA

67.5%

GG

76.9 %

GG

32.5%

Ung thư

Không ung thư

Hình 3.11. Phân bố kiểu gen GG và GA đa hình rs2066853 gen AhRở

các đối tƣợng có dioxin trong máu cao (ung thƣ và không ung thƣ)

Trục tung: Tỷ lệ % các kiểu gen (GG, GA) của đa hình rs2066853.. Trục hoành:

biểu thị 2 nhóm ung thư và không ung thư ở đối tượng có nồng độ dioxin trong máu

cao ≥10 ppt. Cột màu đỏ biểu thị kiểu gen GA. Cột màu xanh biểu thị kiểu gen GG.

Trong nhóm đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao và bị

ung thư, tỷ lệ kiểu gen GA (23,1%; 3/13 mẫu) thấp hơn GG (76,9%;

10/13 mẫu). Ngược lại, ở đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao

và không bị ung thư, kiểu gen GA tỷ lệ 67,5% (27/49 mẫu), cao hơn

GG (32,5%; 13/40 mẫu), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (OR =

13

6.923; 95%CI: 1.624 - 29.513; p<0.01). Điều này cho thấy, đa hình

R554K (GA) có thể liên quan đến giảm nguy cơ ung thư ở những

người có nồng độ dioxin trong máu cao. Khi xảy ra thay thế Arg554

thành Lys554 dẫn đến mất đi một liên kết hydro trong phân tử

protein. Sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như

tương tác của thụ thể AhR với các protein thành phần trong con đường

tín hiệu AhR.

Đa hình (2) exon 10 gen AhR: rs75519181

Đa hình rs75519181 (c.1459A>G, p.N487D) trong nghiên cứu

của chúng tôi xuất hiện với 2 kiểu gen là AA và GA.

Bảng 3.12. Phân bố tần suất allele và kiểu gen đa hình rs75519181 gen

AhR trong nghiên cứu, so sánh với các quần thể ngƣời (theo HGVD)

Allele

Tần số đa hình theo HGVD, n=100 cho mỗi quần thể

Việt Nhật Trung Nam Châu Châu Châu

Nam bản

Trong

nghiên cứu

Kiểu gen

n=114

99,1

0,9

quốc

98,6

1,4

Á

Phi

100

Mỹ

100

Âu

100

A

G

100

0

98,6

100

Allele

1,4

97,1

2,9

0

100

0

100

0

100

0

100

0

Kiểu AA

98,2

1,8

100

0

97,1

2,9

gen

GA

Hầu hết các quần thể người trên thế giới, đều không có đa hình

rs75519181 (Bảng 3.12). Tuy nhiên, trong nghiên cứu này phát hiện

thấy đa hình rs75519181 ở 2 mẫu trong vùng phơi nhiễm, nhóm 2

(1,8%). Không phát hiện thấy đa hình này ở các mẫu không phơi

nhiễm dioxin. Phân tích đánh giá ảnh hưởng của đa hình rs75519181

cho thấy, khi Asp thay thế Asn tại vị trí 487 dẫn đến mất đi một cầu

nối hydro trong phân tử. Ngoải ra, Asn là amino acid trung tính,

14

không tích điện, được thay bằng một amino acid mang tính acid và

tích điện âm (Asp). Điều này có thể làm thay đổi ái lực liên kết ion

trong phân tử protein.

Đa hình (3) exon 10 gen AhR: rs779351731

Đa hình rs779351731 (c.1541T>C, p.I514T) có 2 kiểu gen TT

và CT. Cho đến nay chưa có dữ liệu về tần số đa hình cũng như tần

số các allele và kiểu gen của đa hình trên các chủng tộc người trên

thế giới. Trong nghiên cứu này, đa hình rs779351731 (kiểu gen CT)

có ở 1 /114 mẫu (tỷ lệ 0,88%), đối tượng có nồng độ dioxin trong

máu cao, được xác nhận là không mắc bệnh liên quan đến dioxin.

Phân tích cấu trúc protein cho thấy, khi thay thế I (Isoleucine) dẫn

đến mất một liên kết hydro tai vị trí Gl516, hình thành mới liên kết

hydro tại His511. Ngoài ra, Isoleucine có đặc tính không phân cực,

kị nước được thay bằng Threonine có tính phân cực.

3.2.4. Phân tích đa hình gen AIP

Phiện thấy 5 đa hình/đột biến ở các exon 2, exon 4 và exon 5.

Bảng 3.13. Các đa hình gen AIP phát hiện trong nghiên cứu

Nhóm đối tƣợng

Số hiệu

đa hình

Thay đổi

nucleotide

Thay đổi

protein

Số mẫu

(n)

Vị trí

PN

Không PN

% (n)

8,5% (8)

10% (2)

rs747233720 Exon2 c.120 G>A

Độtbiến mới Exon2 c.124C>A

rs138902236 Exon 4 c.517G>A

-

114

H42N

3,2% (3)

0

E173K

p.D172D

p.Q228K

114

10,6 (10)

15% (3)

rs2276020

rs641081

Exon 4 c.516C>T

Exon 5 c.682C>A

23,4% (22)

94 (100%)

20% (4)

20 (100%)

Trong 4 đa hình gen AIP, đa hình rs641081 xuất hiện ở 100% ở

đối tượng nghiên cứu. Tần số kiểu gen của cả 3 đa hình còn lại

15

(rs747233720, rs138902236, rs2276020) đều đạt trạng thái cân bằng

Hardy-Weinberg, với giá trị Hwpval =1 (>0.001) (bảng 3.14).

Bảng 3.14. Tần suất allele, kiểu gen 3 đa hình gen AIP trong nghiên cứu

Kiểu gen

Allele

Đa hình

HWpval

kiểu gen

n (%)

104 (91,2)

10 (8,8)

allele

G

%

GG

GA

95,6

4,4

1

rs747233720

rs138902236

A

GG

GA

CC

101 (88,6)

13 (11,4)

88 (77,2)

G

A

94,6

5,4

C

T

87,7

12,3

1

CT

TT

24 (21,1)

2 (1,7)

rs2276020

3.2.4.1. Đa hình trên exon 2 gen AIP

Đa hình rs747233720 có ở 10/114 mẫu (8,8%). Chưa có dữ

liệu công bố về tần số đa hình cũng như tần số allele và kiểu gen của

đa hình này ở các quần thể người trên thế giới. Một biến đổi khác

được phát hiện trên exon 2 là c.124C>A, p.H42N, biến đổi có thể coi

là đột biến mới (chưa có trên dbSNP). Đột biến xuất hiện ở ba mẫu

(DN30, DN34, DN52), nhóm có nồng độ dioxin cao và bị bệnh liên

quan dioxin. Đột biến H42N dẫn đến mất 1 liên kết hydro trong phân

tử protein, đồng thời thay thế một một amino acid vòng, tích điện

dương (Histidine) thành một amino acid trung tính, không tích điện

(Asparagine). Đa hình H42N nằm ở đầu cuối N của protein. Đầu N

của AIP đóng vai trò quan trọng trong tương tác của AIP với các

protein khác cũng như duy trì cấu trúc và sự ổn định của AIP trong tế

bào (Linnert, 2013).

16

3.2.4.2. Đa hình trên exon 4 gen AIP

Đa hình rs138902236 (c.517G>A, p.E173K) xuất hiện ở 2

kiểu gen GG và GA. Hầu hết các quần thể người trên thế giới đều

không có đa hình này. Trong nghiên cứu này, đa hình rs138902236

(GA) xuất hiện với tỷ lệ khá cao (13/114 mẫu, 11,4%). Đa hình dẫn

đến thay thế amino acid có tính acid, tích điện âm (Glutamic acid)

thành amino acid có tính kiềm, tích điện dương (Lysine).

3.2.4.3. Đa hình trên exon 5 gen AIP

Đối với exon 5 phát hiện thấy đa hình rs641081 (c.682C>A,

p.Q228K) ở 100% mẫu nghiên cứu. Kết quả này phù hợp với tần số

đa hình rs641081 quần thể người Việt Nam trên cơ sở dữ liệu HGVD.

Ở nhóm đối tượng dioxin ≥ 10 ppt và mắc các bệnh liên quan

đến dioxin, có 2 trường hợp mang đồng thời đa hình H42N gen AIP

và đa hình R554K gen AhR (mẫu DN34, DN52). Cả 2 trường hợp

đều mắc bệnh tiểu đường type II, trong đó 1 trường hợp mắc đồng

thời ung thư khí quản (DN52). Ngoài ra, 2 trường hợp khác có đa

hình E173K gen AIP, trong đó 1 người có đa hình R554K gen AhR

kiểu gen GA (mẫu DN53) mắc bệnh thần kinh ngoại biên và 1 người có

đa hình R554K gen AhR kiểu gen AA (DN56) mắc ung thư khí quản.

3. GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN BIỂU HIỆN (WES) NGƢỜI

CÓ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU CAO

Từ kết quả WES mẫu có nồng độ dioxin trong máu cao (mẫu

ThN). Chúng tôi đã sàng lọc được 40 biến thể di truyền ở 8 gen (AhR,

AIP, AhRR, CYP1A1, ARNT, CYP1B1, HEMGN, CENPE) liên quan

đến con đường chuyển hóa dioxin thông qua thụ thể AhR (Bảng 3.18)

17