Bước đầu xây dựng bộ chỉ thị SSR của DNA dưa leo và nhiệt độ bắt cặp tối ưu của các mồi SSR cho phản ứng PCR
112
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
Bước đầu xây dựng bộ chỉ thị SSR của DNA dưa leo và nhiệt độ
bắt cặp tối ưu của các mồi SSR cho phản ứng PCR
Initial SSR data set for cucumber breeding and optimal annealing
temperatures of SSR primers in PCR reactions
Lương Hiếu Ngân1, Hồ Thị Bích Phượng1, Nguyễn Như Thành2, Hoàng Thị Thuỳ2,
Cao Tiến Sang2, Vũ Quốc Trưởng2, Lê Thị Trúc Linh3*, Lê Thị Kính3
1Nghiên cứu tự do, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
2Công ty TNHH Hạt giống Tân Lộc Phát, Việt Nam
3Trường Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
THÔNG TIN
TÓM TẮT
DOI:10.46223/HCMCOUJS.
tech.vi.16.1.1872.2021
Bản đồ liên kết phân tử với mật độ chỉ thị cao cần được xác
định trước khi thực hiện chọn giống bằng DNA marker trong đó
các chỉ thị này có sự liên kết chặt với các tính trạng quan tâm.
SSR (Simple Sequence Repeat - Trình tự lặp lại đơn giản) là một
marker phân tử được dùng để xây dựng bản dồ liên kết phân tử và
có thể phân biệt được các dạng dị hợp và đồng hợp của gene.
Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng bộ chỉ thị SSR có liên kết
với các tính trạng quan trọng trong chọn giống dưa leo và xác
định được điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR khuyếch đại DNA
dưa leo từ những SSR này. Thực hiện khai thác in silico để xây
dựng bộ dữ liệu SSR. Tối ưu hoá phản ứng PCR bằng chạy
gradient nhiệt độ cho các mồi SSR. Chúng tôi đã xác định được
52 SSR có liên kết với các tính trạng quan trọng trong chọn giống
dưa leo. Điều kiện nhiệt độ bắt cặp tối ưu 46 SSR trong phản ứng
PCR khuếch đại DNA dưa leo đã được xác định. Đây là dữ liệu
quan trọng cho bước sàng lọc các cây phân ly trong quá trình
chọn giống dưa leo tiếp sau đó.
Ngày nhận: 06/05/2021
Ngày nhận lại: 20/05/2021
Duyệt đăng: 25/05/2021
Từ khóa:
chọn giống; chỉ dấu phân tử;
dưa leo; SSR
ABSTRACT
Genetic maps with a high density of molecular markers are
essential for plant breeding. SSR (Simple Sequence Repeat) is a
molecular marker for creating genetic maps and distinguishing
heterozygous and homozygous plants. The main aim of this study
was to construct SSRs associated with key traits in cucumber
breedings and to determine the optimum conditions for PCR
reactions to amplify cucumber DNA utilizing these SSRs. An in
silico survey was performed to mine the SSR data set.
Optimization of PCR reaction by running temperature gradients
for all the SSR primers. We identified 52 SSRs that are associated
with important traits in cucumber breeding. Also, the optimal
Keywords:
cucumber; plant breeding;
molecular marker; SSR
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
113
annealing temperatures for PCR of 46 SSRs were determined.
These are important data for the next screening steps for
segregating plants for further cucumber breeding.
1. Giới thiệu
Chọn giống bằng DNA marker đòi hỏi trước hết phải có bản đồ liên kết phân tử với mật
độ chỉ thị cao và bản đồ QTLs (Quantitative Trait locus). Các chỉ thị này có sự liên kết chặt với
các tính trạng quan tâm. SSR là vùng lặp lại đơn giản các đoạn DNA từ 02bp đến 08bp phân bố
trong hệ gene của động vật và thực vật. Số lượng chuỗi lặp lại thay đổi theo từng cá thể của mỗi
loài. Đồng thời đây là một marker có thể phân biệt được các dạng dị hợp và đồng hợp của gene.
Vì vậy có thể dùng để đánh giá sự đa dạng di truyền hoặc sự biến dị trong từng cá thể.
Một số bản đồ liên kết gene được xây dựng bằng SSR marker (và một số loại DNA
marker khác) đã được xây dựng dựa trên các quần thể phân ly được tạo ra từ các dòng dưa leo bố
mẹ thuần chủng như sau: Fazio, Staub, và Stevens (2003) xây dựng một bộ bản đồ liên kết gồm
171 dòng tái tổ hợp cận giao được tạo ra từ lai giữa dòng G421 (determinate, toàn hoa cái (F), lá
có kích thước tiêu chuẩn) và dòng H-19 (indeterminate, monoecious, little-leaf (ll) line. Bản đồ
di truyền (131 điểm) được xây dựng dựa trên các cá thể cận giao tái tổ hợp này và 216 cá thể F2
chứa 14 SSRs, 24 SCARs, 27 AFLPs, 62 RAPDs, 01 SNP và 03 markers hình thái quan trọng về
kinh tế [F (gynoecy), de (determinate habit), ll (little leaf)]. Bảy nhóm liên kết trải rộng 706cM
với khoảng cách trung bình giữa 02 marker là 5.6cM (Fazio et al., 2003). Ren và cộng sự (2009)
đã sử dụng Sanger shotgun sequencing để phát triển dữ liệu SSR cho dưa leo (Ren et al., 2009).
Thực hiện giải trình tự với độ phủ ba lần bộ gene và phân tích để tìm các vùng SSR tiềm năng.
1,940 SSR marker được tìm ra và sau đó được thực hiện PCR để xác định marker đa hình giữa
dòng Gy14 và PI 183967. Từ đó 966 SSR marker được sử dụng để xây dựng bản đồ liên kết
gene được chia thành 07 nhóm (Ren et al., 2009). Weng, Johnson, Staub, và Huang (2010) sử
dụng 821 SSR xây dựng bản đồ liên kết cho quần thể cận giao tái tổ hợp xuất phát từ 02 dòng
dưa leo, Gy7 (synonym G421) và H-19. 140 (17.0%) SSR marker được xác định là đa hình giữa
bố mẹ. Kết hợp với 42 marker SCAR và SSR đã xác định trước đó, các marker này được sử dụng
để xây dựng bản đồ liên kết bằng sử dụng 46 RILs và 176 mapped loci bao phủ khoảng 400cM
khắp bảy nhóm liên kết. Số lượng của các loci được xây dựng trên các nhóm liên kết từ 01 tới 07
tương ứng là 11, 6, 35, 18, 46, 45, và 15 (Weng et al., 2010). Bản đồ di truyền dựa trên quần thể
cận giao từ hai dòng Gy7 × H-19 có 94 marker chung với bản đồ liên kết xây dựng từ quần thể
tái
tổ
hợp
cận
giao
xuất
phát
từ
C.
sativus
var.
sativus
lineGy14andC.sativusvar.hardwickiiAlef.R.PI183967 (Weng et al., 2010).
Đến năm 2011, bản đồ liên kết xây dựng dựa trên các dòng tái tổ hợp cận giao được tạo
ra từ dòng toàn hoa cái 9119Gt và dòng hoa đực nhiều hơn hoa cái 9930Gt được xây dựng (Miao
et al., 2011). Công trình nghiên cứu này sử dụng trình tự gene được xây dựng từ trình tự bộ gene
của Huang và cộng sự (2009) và dữ liệu SSR của Ren và cộng sự (2009). Bản đồ di truyền của
dưa leo gồm 07 nhóm liên kết tương ứng với 07 NST với 248 SSR markers và 07 loci tính trạng
bao phủ vùng gene có kích thước 711.9cM (centimorgan) với khoảng cách trung bình là 2.8cM.
Như vậy, bản đồ liên kết giữa bộ marker SSR và cụ thể là 07 nhóm liên kết ở dưa leo đã
được xác định. Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng về trình tự, vị trí, khoảng cách di truyền giữa các
marker, và đặc biệt quan trọng là mối liên kết giữa marker với tính trạng quan tâm.
Với mục tiêu chuyển một số đặc tính ưu thế lai từ dòng bố sang dòng con lai trong kế
hoạch nghiên cứu lâu dài hơi cho dưa leo, chúng tôi cần một bộ marker phân tử có liên kết với
một số tính trạng quan trọng trong chọn giống dưa leo và trải đều trên bộ NST của dưa leo. Do
114
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện khảo sát cơ sở dữ liệu để xây dựng bộ SSR liên
kết với một số tính trạng nông học quan trọng và bước đầu xây dựng quy trình PCR để khuếch
đại DNA dưa leo cho các SSR này.
2. Cơ sở lý thuyết và mô hình nghiên cứu
2.1. Khảo sát in silico để xác định các SSR liên kết với các nhóm liên kết trên dưa leo
Tiến hành khai thác dữ liệu để xây dựng bộ chỉ thị phân tử liên kết với các gene/ QTLs
với các tính trạng nông học quan trọng và khả năng kháng bệnh của các dòng dưa leo; và chỉ thị
phân tử trải đều trên 07 nhóm liên kết của dưa leo. Trong đó dữ liệu là các kết quả nghiên cứu
được công bố trên các tạp chí khoa học uy tín trên thế giới về: trình tự của bộ gene đưa leo; đặc
điểm di truyền của các tính trạng quan trọng trong chọn giống dưa leo. Tiến hành xác định các
QTLs/gene qui định cho tính trạng mong muốn và các chỉ thị phân tử đi kèm.
2.2. Tách chiết DNA từ lá dưa leo
Vật liệu ban đầu là 02 dòng dưa leo Cucumis sativus L. có kiểu gene quy định cho cây
dưa leo toàn hoa cái và toàn hoa đực đã kiểm tra trước đó. Lúc cây được 05 lá thật thì tiến hành
thu mẫu lá bằng cách cắt một phần của lá thật thứ tư bỏ vào ống nghiệm 180ml. Vật liệu ban đầu
được cung cấp bởi công ty hạt giống Tân Lộc Phát. DNA được tách chiết bằng
DNAzol®Reagent (Thermal Fisher). Quy trình tách chiết như sau: Nghiền mô thực vật trong
nitơ lỏng cùng với 0.3ml Plant DNAzol Reagent cho 0.1g mẫu mô thực vật. Trộn dung dịch kỹ
lưỡng bằng cách đảo nhẹ và ủ ở 25oC trong 05phút. Cho 0.3ml chlorofrom, trộn đều và ủ ở 25oC
trong 05 phút. Ly tâm 12,000 vòng/phút trong 10 phút và chuyển dịch nổi sang epppendorf mới.
Cho vào epppendorf mới với 0.225ml Ethanol 100%, trộn mẫu bằng cách đảo ngược 06-08 lần
và để bảo nhiệt độ phòng trong 05 phút. Ly tâm 5,000 vòng/phút trong 04 phút, bỏ dịch nổi. Cho
vào eppendoft 0.3mL DNAzol + Ethanol 100% wash (tỷ lệ 1:0.75), vortex, giữ mẫu trong 05
phút và ly tâm 5,000 vòng/phút trong 04 phút. Loại bỏ DNAzol + Ethanol 100% wash và thêm
0.3mL Ethanol 75% trộn đều, ly tâm 5,000 vòng/phút trong 04 phút. Loại bỏ Ethanol, phơi khô
nhiệt độ phòng, hòa tan DNA trong 70µL TE (pH 8.0).
Fisher).
Nồng độ DNA sau khi tách chiết được xác định bằng máy Nanodrop (Thermal
Chất lượng DNA được đánh giá bằng tỉ số A
quản ở -20oC.
và A . Các mẫu DNA được
260/230 bảo
260/280
2.3. PCR
Phản ứng PCR thực hiện cho 50 mồi SSR được thực hiện với thành phần phản ứng thực
hiện trong thể tích 20µL sử dụng phire tag polymerase (Thermal Fisher) theo hướng dẫn của nhà
sản xuất với thành phần phản ứng như sau 35ng DNA, 1µL mồi F 10µM, 1µL mồi R 10µM, 1,
1µL dNTPs 10mM, 5u phire tag polymerase. Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt bao
gồm biến tính 98oC 30s, tiếp theo 35 chu kỳ với biến tính ở 98oC 5s, nhiệt độ bắt cặp của mồi 5s
(Bảng 1), và kéo dài phản ứng ở 72oC 5s. Cuối cùng, hoàn thành phản ứng ở 72oC 30s.
Tiến hành lập bảng nhiệt độ bắt cặp cho 50 mồi đã đặt trước và thực hiện xác định 04
nhiệt độ gradient dựa trên nguyên tắc như sau: Nếu nhiệt độ nóng chảy giữa hai mồi F và R bằng
nhau thì sẽ tăng và giảm nhiệt độ đi 02 độ; Nếu nhiệt độ. nóng chảy giữa hai mồi F và R cách
nhau 1 độ thì lấy nhiệt độ lớn làm nhiệt độ trung tâm và sẽ tăng giảm nhiệt độ đi 02 độ; Nếu
nhiệt độ nóng chảy giữa hai mồi F và R cách nhau 02 độ thì lấy nhiệt độ ở giữa làm nhiệt độ
trung tâm và sẽ tăng giảm nhiệt độ đi 02 độ; Nếu nhiệt độ nóng chảy giữa hai mồi F và R cách
nhau 03 độ thì lấy nhiệt độ độ lớn làm nhiệt độ trung tâm và tăng 03 độ; Nếu nhiệt độ nóng chảy
giữa hai mồi F và R cách nhau 06-07 độ thì lấy nhiệt độ trung bình làm trung tâm và nhiệt độ
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
115
nhỏ của 02 mồi sẽ giữ nguyên. Bảng nhiệt độ bắt cặp cho các mồi được tóm tắt trong Bảng 1.
Những mồi có dãy gradient nhiệt độ gần nhau được nhóm lại để cùng chạy cùng gradient nhiệt
độ.
Bảng 1
Gradient nhiệt độ cho từng SSR
Mồi
Nhiệt độ
54-56-58
Nhiệt độ thực tế chọn
54.1- 55.6-58.1
55-57.2-59
3,4,6,26
2,18,20,24,27,29
55-57-59
19
56-58-60
56.1-57.6-60.1
5,7,17,21,22,23,25
56-57-59-61-62
58-59-61-63-64
60-62-64
56-57.1-58.6-60.9-62
58-59.1-61.4-62.9-64
60-62.2-64
9,10,12,13,14,15,16
1,8,11
28
60-63-66
60-62.6-66
34
52-54-56
52; 54.2; 56
30,36,47
51-53-55-57-58
54-56-58
51; 53.2; 54.9; 57.4; 58
54; 56.2; 58
32,40,44,48,49
35,37,38,42,43,50,52
55-57-59
55.1; 56.6; 59.1
54; 56.2; 57.9; 59.7; 61
57.1; 59.4; 60.9
58.9; 61.4; 63
31,46
51
54-56-58-60-61
58-60-62
33
59-61-63
Nguồn: Kết quả xử lý dữ liệu của nhóm tác giả
2.4. Điện di polyacrylamide
Thực hiện đổ gel polyacrylamide 20% bằng dung dịch TBE 1X với 1M DTT và
Amonium persulphate 10%. Sau khi gel đông hoàn toàn, chuyển gel vào bồn diện di vào cho
dung dịch TBE vào ngập giếng. Cho hỗn hợp gồm 10µL sản phẩm PCR và 2µL loading dye vào
mỗi giếng. Tiến hành điện di với hiệu điện thế 90V. Ngay sau khi điện di, bảnggel được soi dưới
đèn UV để ghi nhận kết quả.
3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Khai thác dữ liệu để xác định 50 SSR liên kết với những tính trạng quan trong và
liên kết chặt với các nhóm liên kết của dưa leo
Dữ liệu được khai thác là những công trình nghiên cứu đã được công bố trên các tạp chí
uy tín có thực hiện khảo sát mối liên kết giữa các SSR và các giống dưa leo khác nhau trên thế
giới. Chúng tôi tiến hành xác định trình tự của các primer, số lần trình tự lặp lại của nucleotide
(motif), khả năng liên kết của các SSR này với một số đặc điểm quan trọng trong chọn giống của
dưa leo như khả năng kháng bệnh, hình dạng quả, số lượng quả, hình dạng lá, thân. Bên cạnh đó,
những SSR đã được chứng minh có khả năng được sử dụng để xác định đa dạng di truyền của
116
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
các giống dưa leo cũng được thu nhận. Kết quả khai thác dữ liệu được tóm tắt trong Bảng 2.
Bảng 2
Bảng tổng hợp 52 SSR khai thác từ những công trình công bố về các SSR có liên kết với dưa leo
Fragment
size
Forward
primer
Reverse
primer
SSR
Bệnh
Kháng
TLTK
Chr.
cM
Loci
Motif
CAAAC
CTTCT
ACATG
ATCTT
AATCT
TT
GAAGGCC
ATCAAGG
TATTACA
TCT
1
1
19.0
SSR31116
(TA)35
220
ACCCA
TTTGA
ATCAG
CTTCG
CCTTTCCT
TACCCAT
CCCAT
2
3
4
1
5
5
6.1
SSR20705
SSR00772
SSR11012
(TC)20
(AG)12
(AT)25
140
172
215
TGCTA
CCTCA
CATGG
TTTTG
AGAAGCG
TTGGGGG
AAAATA
21.7
10.9
Sương
mai
(mốc
nấm
Pseudoperon
ospora
S. Zhang và
cộng sự (2013)
TCGTAAT
TTATGAA
AATAGAA
CGGT
CGATT
GCGCA
AAATG
TGTAT
sương)
cubensis
TGGAG
GTCAT
TGAGA
CTTGC
T
CACCTCA
ACTCCTC
CATTCAA
5
6
7
6
5
5
98.8
7.9
SSR16882
SSR16110
SSR06303
(AT)24
(TA)22
(TCT)10
218
181
136
ATCCC
CAATT
CCTCC
AAAAC
GGAATAT
GGAAGGA
AAGCCA
TGACT
TTCTT
GATGG
TACCG
C
Sương
mai
(mốc
nấm
Pseudoperon
ospora
AGCTCTC
AACAACG
AAGGGA
Nie và cộng sự
39.0
(2015)
sương)
cubensis
CATGT
TTCCC
AATCC
CCCGA
GTGGCTG
GAGGAAG
CAGTAG
8
9
(TGC)4
201
256
263
282
GCACG
AGCAC
CAAAT
CGATC
AACTAGG
CTTGGTC
TCGCAC
(AGCA)3
Naegele,
Quesada-
Ocampo,
CTTGC
GCGGC
TTGAT
TTTCT
CGGAATT
CGCAGCT
CTTTCG
(CGA)4(T
GA)4
Sương
mai
(mốc
nấm
Pseudoperon
ospora
10
11
Kurjan,
Saude,
sương)
cubensis
GAAGT
CGGGC
TACTA
CGACG
GACCAAA
GTTCGCG
AATCGG
và Hausbeck
(2016)
(AAAG)3
TACCT
TCAAC
AGTGC
GTGCA
TTTAGGG
GAACACG
TGCCTC
12
13
(CTC)4
(TCG)4
227
246
GCGATCC
AGTGCAT
CTCTG
CCCAC
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
117
Fragment
size
Forward
primer
CGACTA
Reverse
SSR
Bệnh
Kháng
TLTK
Chr.
cM
Loci
Motif
primer
GTGTA
CGG
GTCTT
CAGCG
TCCAC
AGTCA
TGTTCAT
CTCGTGG
CAGTCC
14
15
16
(CAA)4
(TCG)4
294
246
263
AACGC
GTTCT
CAGAT
GACGT
GCGGTTC
TTGCAAC
GATCTC
GAAAT
GCACG
ATCGA
CAGGC
TCTACGT
GGCCAAC
TGGTTC
(GGCC)3
Call, Criswell,
Wehner,
TGCAC
CAAGC
AATAA
CTTGT
C
CCCTCTG
CTGCACA
TTATCC
17
18
1
6
12.7
SSR05793
(TA)22
(TA)15
195
220
Klosinska,
Sương
mai
(mốc
nấm
Pseudoperon
ospora
và Kozik
(2012);
Szczechura,
Staniaszek,
TCAAA
AGGCA
CATGT
GATGT
C
sương)
cubensis
TGCAGGT
CGACAAT
TCAATAA
101.
5
SSR01643
SSR9-56
Klosinska,
và Kozik
(2015)
CAAAACA
AGGTAAG
GTGTATT
GGA
TAAAA
GGCAG
GACAT
GCTCA
19
20
6
6
27.6
35.4
7637340
9628895
CAAAT
TCAAC
AAAAC
CCTAC
CA
CMV
(cucumber
mosaic
CGTGGCA
TAAAACC
ACGAAT
virus
CMV
Shi và cộng sự
SSR11-
177
(2018)
virus)
GGAGG
GAAAG
GAAGG
AGAGA
ACAAAGC
TTCTCCG
CAAATG
21
22
23
6
5
5
32.6
17.7
18.5
SSR11-1
SSR03529
SSR07100
9025951
136
TGAATTG
AATAGAC
ACAACAA
TATGC
ACATG
TTGGG
ACTCC
ATGTG
(AT)14
(CT)16
CATTT
GGTTC
AGAAA
GGGGA
CACACCA
TTTACGG
TTATGGG
192
TCTTC
GAGAA
ATGGG
ATTTT
G
ATCTCAG
CCCTTGG
ATCCTT
Weng và cộng
sự (2010)
(AGGAA)
6
24
Lá
5
13.1
SSR17464
143
CCACA
AACGT
AAAGA
GATTC
ACA
GGCGCCA
CAAATAT
TCAACA
25
26
5
6
26.5
31.3
SSR01498
SSR00170
(AT)13
(AG)14
220
187
TTGCAAT
TTGTGCA
GGGATA
AGGTA
TTATG
GCCCA
118
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
Fragment
size
Forward
primer
Reverse
primer
AAGGG
SSR
Bệnh
Kháng
TLTK
Chr.
cM
24.9
80.2
Loci
Motif
GTCGT
TTTCC
GCGAT
TCTAC
GATTCTC
CGGAAAC
GGATTT
27
28
6
6
SSR03940
SSR18956
(AGG)11
(TAT)20
213
183
TCGAA
ACCTC
AATAC
TTCTA
CCAA
CGTATGT
ACGACAA
AATGTGA
ACAG
Jat và cộng sự
Hoa
(2019)
GGTCAAT
CCAAAAG
AGAAAGC
A
ATCAA
CACCA
TTGAC
GACCA
29
30
31
5
5
5
84.5
10.9
7.9
SSR13251
SSR16203
SSR04323
(AAG)14
(AT)19
162
146
197
ATGTG
TCAAA
CCCAC
CCATT
TCGAGGT
AAATCAA
AACCGA
xác định
tính trạng
quả có hại
(Tuberculati
on fruit)
GCTAG
GGCAC
AAGAA
CGAAG
TGGTGGA
AAAGAAA
AAGGGA
W. Zhang và
cộng sự (2010)
(TTA)12
Quả
CACAA
TTTTTGGT AGCAA
32
5
48.4
SSR03943
(TA)16
130
GAAAAGG
AACGTG
AATTG
AGGGA
A
GCCTC
TAGCC
TGAAA
GACCA
GGACATG
TCAACTC
CCCTGT
đắng
(bitterfree
foliage),
không có lá
(virescent
leaf)
33
34
35
5
5
6
7.9
7.9
SSR15818
SSR06003
SSR18405
(AT)24
(AT)26
219
156
210
TTGGG
TGTCA
AATGG
AAGAA
TGAGGGG
CAAAATT
GGTAAA
Miao và cộng
sự (2011)
GACAA
ACAAG
GGGAC
GAAAA
CGCAGGT
GCATCTC
ATGTAA
33.3
(TAT)13
không có lá
(virescent
leaf)
TGAAA
AGAGG
GAACA
AAAGC
A
TTCATTG
CAAAGCA
CACACA
36
6
10.8
SSR00004
(AT)15
(AT)31
216
TTGAA
GGAGA
GAGGG
AATGG
AGATGCC
CCATTCA
GTTTTG
37
38
1
1
64.5
84.1
SSR20354
SSR17922
177
197
CATTCTA
GGTCAAT
GAATCGC
A
GCAAA
GTTGC
CACAT
TGAAG
(AAT)7(A
AG)11
Chiều dài và
đường kính
T. Zhang và
cộng sự (2019)
Quả
GGCAA
TCATT
ACCAA
AAACC
A
TCAACTT
ATCCCTC
TTTCTATT
TTCC
39
40
2
2
37.5
59.3
SSR22558
SSR10518
(TA)23
170
211
(ATTA)5(
A)30
TCTAATT
CGCTCCG
TTGCA
GCGAA
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
119
Fragment
size
Forward
primer
GATGAT
Reverse
SSR
Bệnh
Kháng
TLTK
Chr.
cM
Loci
Motif
primer
CAATC
CTGTA
ATCAA
CTCTG
AGACA
TAATG
GATTT
TTGAAAC
TTGTGGC
TACCCC
41
42
3
3
9.5
SSR22158
SSR03918
(TA)30
187
143
TGTGT
TTGAC
GAGACAA AAAGG
TGAGGGT
(CTTTGC)
7
31.7
CAAATCA
AAAGG
AA
TACTG
TCCGA
ACGTG
TTCCA
TCATGTC
AAGCGAA
GGAAGA
43
44
45
1
1
1
54.8
84.1
66.6
SSR04805
SSR23049
SSR03860
(GAC)9
(TGGGT)6
(AT)17
139
168
187
TTCGT
CAAAT
TTGGT
TGTCG
GCTTGCT
GCTAAAG
GGGATT
AATTG
AGGGG
CACTT
ATTGG
GCCCTTA
TTAACCC
AAGTTGC
TCCAT
TGGCTTTT GGTAC
46
47
48
49
50
1
3
2
7
3
78.2
5.3
66.3
0
SSR05723
SSR05737
SSR12810
SSR15477
SSR00670
(AT)17
(CT)17
209
185
177
213
156
CTGTCAC
GTCC
AACAA
GAATC
ACA
GAAGT
AAATG
GGTTG
GACGC
TTGCCTTC
GTAAGCA
AAAA
TTTTG
GAGAG
TTCCCAC
AAAACAA AAAAG
ATCTTGG
Pandey, Ansari,
Mishra,
(ATT)13
(AAAG)12
(GAA)8
GTTGG
A
Đa
dạng
di
Singh,
AATTC
TTCTG
GGAAT
GGCCT
CTGCCAT
TTCTGGG
TTTGAT
truyền
và Singh
(2013)
TCCAT
GGAAG
CAGAT
CTTAA
AAA
TCTCAAA
CCAAGAA
TTGGGG
2.2
CATCA
GCTGA
ATTAC
GAGGC
T
CTGCTGC
TAGAAAG
GCTGCT
51
52
1
6
22.7
37.6
SSR21336
SSR03932
(AGAA)5
(ATT)3
190
158
Weng và cộng
sự (2015)
CACGA
ATGCT
GCTCT
AACCA
CTTTTTGG
GGACCCT
TCATT
Nguồn: Kết quả xử lý dữ liệu của nhóm tác giả
Chúng tôi thu nhận 52 mồi SSR. Các mồi này nằm trải dài trên 07 NST của dưa leo.
120
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
Ngoài ra, những mồi này đã được chứng minh liên kết với những tính trạng quan trọng trong
chọn giống dưa leo bao gồm đường kính và kích thước lá (06 SSR), hình dạng quả, chiều dài quả
(10 SSR), hoa (02 SSR), khả năng kháng bệnh (21 SSR) và có khả năng được sử dụng để phân
tích đa dạng di truyền (06 SSR ).
3.1.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp phù hợp của các mồi SSR cho phản ứng PCR
Tiến hành xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho 50 cặp mồi SSR đã xác định ở trên. Tiến
hành chỉnh nồng độ về 10ng/µl cho mỗi mồi SSR. Thực hiện phản ứng PCR với DNA mẫu đã
được kiểm tra kiểu gene trước đó là đồng hợp qui định cho cây có toàn hoa cái làm DNA mạch
khuôn với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng đã mô tả ở trên. Kết quả điện di của tất cả các
mồi được thể hiện trong Hình 1 bên dưới.
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
121
Hình 1. PCR với gradient nhiệt độ để xác định nhiệt độ bắt cặp cho tất cả 50 mồi SSR. Các dấu
‘và’ tương ứng với nhiệt độ bắt cặp số 02 và 03 trong Bảng 1 cho mỗi mồi
Kết quả cho thấy hầu hết các mồi đều cho kết quả rõ ở gradient nhiệt độ khảo sát. Tuy
nhiên, có 08 mồi SSR không chạy ra kết quả là 08,09,10,11,13,14,15,18 và 03 mồi cho ra kết quả
mờ là 01, 12, 26. Đối với 03 mồi cho ra kết quả mờ này, tiến hành giảm nhiệt độ bắt cặp 10 độ so
với nhiệt độ bắt cặp gradient chọn ban đầu ở Bảng 1. Kết quả cho thấy khi giảm nhiệt độ bắt cặp,
các mồi này đều cho kết quả tốt (Hình 1).
Đối với 08 mồi SSR chưa xác định được nhiệt độ bắt cặp, tiến hành chạy gradiant nhiệt
độ bắt cặp lại cho 08 mồi SSR này với mẫu DNA từ cây có kiểu gene đồng hợp quy định tính
trạng toàn hoa đực đã xác định trước đó. Tuy nhiên, chúng tôi không thu được vạch sản phẩm
mong đợi. Kết quả thể hiện ở Hình 2.
Hình 2. PCR với gradient nhiệt độ bắt cặp cho 08 mồi SSR với DNA từ cây có kiểu gene đồng
hợp quy định toàn hoa đực
Tiếp theo, tiến hành chạy gradiant nhiệt độ bắt cặp lại cho 08 mồi SSR với mẫu B1-
5(gyno) với nhiệt độ giảm lần lượt 10 và 05 độ so với nhiệt độ bắt cặp đã xác định trước đó. Kết
quả thể hiện trong Hình 3 và 4.
122
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
Hình 3. PCR với với gradient giảm 10 độ so với nhiệt độ gradient xác định ban đầu cho 8 mồi
SSR khó khuyếch đại
Hình 4. PCR với với gradient giảm 05 độ so với nhiệt độ gradient xác định ban đầu cho 08 mồi
SSR khó khuyếch đại
Kết quả cho thấy khi giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 10 và 05 độ, mồi 14, 18 ra được nhiệt
độ phù hợp, mồi 09 bị mờ và vạch tạp, mồi 10 sáng nhưng bị vạch tạp. Các mồi không có vạch
lần lượt là 08,11,13,15.
Như vậy, chúng tôi đã tìm ra được nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho 46 cặp mồi SSR (còn
06 cặp mồi chưa tìm được nhiệt độ thích hợp). Kết quả được tóm tắt trong Bảng 3.
Bảng 3
Nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng PCR của 46 mồi SSR sử dụng
Số thứ tự mồi
Nhiệt độ bắt cặp phù
Nhiệt độ bắt cặp phù
Số thứ tự mồi SSR
SSR
hợp
hợp
SSR1
SSR2
SSR3
SSR4
SSR5
SSR6
SSR7
SSR8
50o
59o
58o
58o
61o
58o
61o
SSR26
SSR27
SSR28
SSR29
SSR30
SSR31
SSR32
SSR33
44o
59o
66o
59o
57o
57o
58o
63o
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
123
Số thứ tự mồi
Nhiệt độ bắt cặp phù
Nhiệt độ bắt cặp phù
Số thứ tự mồi SSR
SSR
hợp
hợp
SSR9
SSR10
SSR11
SSR12
SSR13
SSR14
SSR15
SSR16
SSR17
SSR18
SSR19
SSR20
SSR21
SSR22
SSR23
SSR24
SSR25
SSR26
SSR27
SSR34
SSR35
SSR36
SSR37
SSR38
SSR39
SSR40
SSR41
SSR42
SSR43
SSR44
SSR45
SSR46
SSR47
SSR48
SSR49
SSR50
SSR51
SSR52
54o
59o
57o
59o
59o
62o
58o
61o
59o
59o
58o
62o
60o
58o
58o
58o
59o
60o
60o
55o
58o
63o
61o
53o
60o
59o
62o
61o
62o
59o
62o
44o
59o
Nguồn: Kết quả xử lý dữ liệu của nhóm tác giả
3.2. Thảo luận
Năng suất và chất lượng là hai yếu tố chính của tiến trình cải thiện giống dưa leo, hai đặc
tính này cùng với những tính trạng có liên quan là những đặc điểm được quan tâm nhiều nhất của
các nhà chọn giống. Việc chọn ra giống dưa leo tốt bằng chỉ thị phân từ giúp các nhà chọn giống
rút ngắn thời gian, tiết kiệm chi phí. Hiện nay, việc chọn lọc dưa leo tốt nhờ hỗ trợ phân tử hay
cụ thể hơn là chuyển một số đặc điểm ưu thế lai quan trọng từ dòng dưa leo này sang dòng dưa
leo khác là hoàn toàn khả thi: Bộ gene của dưa leo đã được giải trình tự; Bản đồ liên kết có độ
bao phủ của các marker đã được xác định; Vị trí các tính trạng nông học quan trọng nhưng phức
tạp ở dưa leo đã được xác định trên bộ gene và các marker có sự liên kết với các tính trạng này
đã được xác định. Phương pháp lai ngược với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử đã được chứng minh
có hiệu quả cao hơn so với phương pháp truyền thống trong việc chuyển gene từ dòng này sang
dòng khác trong cùng một loài. Phương pháp này đã được áp dụng trong một số cây trồng ở Việt
Nam và đã cho thấy kết quả tốt. Để có thể áp dụng chỉ thị phân tử hỗ trợ chọn giống, cần thiết
124
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
phải xây dựng một cơ sở dữ liệu SSR để làm cơ sở cho bước sàng lọc phía sau.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã bước đầu xây dựng bộ cơ sở dữ liệu gồm 52 SSR có
liên kết với những tính trạng quan trọng cho chọn giống của dưa leo như đường kính và kích
thước lá, hình dạng quả, chiều dài quả, hoa, khả năng kháng bệnh và trải dài trên 07 nhóm liên
kết của dưa leo. Ngoài ra, nhiệt độ bắt cặp của các mồi SSR này cho phản ứng PCR khuếch đại
DNA dưa leo đã được bước đầu xác định. Mặc dù một số mồi SSR cho thấy khó khuếch đại, các
mồi SSR còn lại ở nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho sản phẩm khá đặc hiệu, sản phẩm mạnh. Đây là
một trong cơ sở dữ liệu quan trọng trước khi chúng tôi thực hiện xây dựng bản đồ liên kết của
các SSR với các giống dưa leo để chọn giống tiếp theo.
4. Kết luận và gợi ý
Chúng tôi đã xác định được 52 SSR có liên kết với các tính trạng quan trọng trong chọn
giống dưa leo như đường kính và kích thước lá, hình dạng quả, chiều dài quả, hoa, khả năng
kháng bệnh. Nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR tương ứng với từng mồi SSR đã được
xác định.
LỜI CÁM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cho
TS. Lê Thị Kính và các cộng sự năm 2020 (QĐ-240/SKHCN).
Tài liệu tham khảo
Call, A. D., Criswell, A. D., Wehner, T. C., Klosinska, U., & Kozik, E. U. (2012). Screening
cucumber for resistance to downy mildew caused by Pseudoperonospora cubensis
(Berk. and Curt.) Rostov. Crop Science, 52(2), 577-592.
Fazio, G., Staub, J., & Stevens, M. (2003). Genetic mapping and QTL analysis of horticultural
traits in cucumber (Cucumis sativus L.) using recombinant inbred lines. Theoretical and
Applied Genetics, 107(5), 864-874.
Huang, S., Li, R., Zhang, Z., Li, L., Gu, X., Fan, W., . . . Li, S. (2009). The genome of the
cucumber, Cucumis sativus L. Nature Genetics, 41(12), 1275-1281.
Jat, G. S., Munshi, A. D., Behera, T. K., Choudhary, H., Dash, P., Ravindran, A., & Kumari,
S. (2019). Genetics and molecular mapping of gynoecious (F) locus in cucumber
(Cucumis sativus L.). The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 94(1),
24-32.
Miao, H., Zhang, S., Wang, X., Zhang, Z., Li, M., Mu, S., . . . Gu, X. (2011). A linkage map
of cultivated cucumber (Cucumis sativus L.) with 248 microsatellite marker loci and
seven genes for horticulturally important traits. Euphytica, 182(2), 167-176.
Naegele, R. P., Quesada-Ocampo, L. M., Kurjan, J. D., Saude, C., & Hausbeck, M. K. (2016).
Regional and temporal population structure of pseudoperonospora cubensis in Michigan
and Ontario. Phytopathology, 106(4), 372-379.
Nie, J., He, H., Peng, J., Yang, X., Bie, B., Zhao, J., . . . Cai, R. (2015). Identification and fine
mapping of pm5.1: A recessive gene for powdery mildew resistance in cucumber
(Cucumis sativus L.). Molecular Breeding, 35(1), 1-13.
Pandey, S., Ansari, W. A., Mishra, V. K., Singh, A. K., & Singh, M. (2013). Genetic diversity
Lương Hiếu Ngân và cộng sự. HCMCOUJS-Kỹ thuật và Công nghệ, 16(1), 112-125
125
in Indian cucumber based on microsatellite and morphological markers. Biochemical
Systematics and Ecology, 51, 19-27.
Ponting, C. P., Schultz, J., Milpetz, F., & Bork, P. (1999). SMART: Identification and
annotation of domains from signalling and extracellular protein sequences. Nucleic
Acids Research, 27(1), 229-232.
Rahman, A., Anisuzzaman, M., Ahmed, F., Islam, A., & Naderuzzaman, A. (2008). Study of
nutritive value and medicinal uses of cultivated cucurbits. Journal of Applied Sciences
Research, 4(5), 555-558.
Ren, Y., Zhang, Z., Liu, J., Staub, J. E., Han, Y., Cheng, Z., . . . Huang, S. (2009). An
integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One, 4(6),
Article e5795. doi:10.1371/journal.pone.0005795
Ribaut, J. M., & Betrán, J. (1999). Single large-scale marker-assisted selection (sls-mas).
Molecular Breeding, 5(6), 531-541.
Shi, L., Yang, Y., Xie, Q., Miao, H., Bo, K., Song, Z., . . . Gu,X. (2018). Inheritance and QTL
mapping of cucumber mosaic virus resistance in cucumber (Cucumis Sativus L.). PloS
One, 13(7), Article e0200571.
Szczechura, W., Staniaszek, M., Klosinska, U., & Kozik, E. U. (2015). Molecular analysis of
new sources of resistance to Pseudoperonospora cubensis (Berk. et Curt.) Rostovzev in
cucumber. Russian Journal of Genetics, 51(10), 974-979.
Weng, Y., Colle, M., Wang, Y., Yang, L., Rubinstein, M., Sherman, A., . . . Grumet, R.
(2015). Qtl mapping in multiple populations and development stages reveals dynamic
quantitative trait loci for fruit size in cucumbers of different market classes. Theoretical
and Applied Genetics, 128(9), 1747-1763.
Weng, Y., Johnson, S., Staub, J. E., & Huang, S. (2010). An extended intervarietal
microsatellite linkage map of cucumber, Cucumis sativus L. HortScience, 45(6), 882-
886.
Zhang, S., Liu, M., Miao, H., Zhang, S., Yang, Y., Xie, B., . . . Gu, X. (2013). Chromosomal
mapping and QTL analysis of resistance to downy mildew in cucumis sativus. Plant
Disease, 97(2), 245-251.
Zhang, T., Li, X., Yang, Y., Guo, X., Feng, Q., Dong, X., & Chen, S. (2019). Genetic analysis
and QTL mapping of fruit length and diameter in a cucumber (cucumber sativus L.)
Recombinant Inbred Line (RIL) population. Scientia Horticulturae, 250, 214-222.
Zhang, W., He, H., Guan, Y., Du, H., Yuan, L., Li, Z., . . . Cai, R. (2010). Identification and
mapping of molecular markers linked to the tuberculate fruit gene in the cucumber
(Cucumis sativus L.). Theoretical and Applied Genetics, 120(3), 645-654.
Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
14 trang
16820
Free
Bạn đang xem tài liệu "Bước đầu xây dựng bộ chỉ thị SSR của DNA dưa leo và nhiệt độ bắt cặp tối ưu của các mồi SSR cho phản ứng PCR", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- buoc_dau_xay_dung_bo_chi_thi_ssr_cua_dna_dua_leo_va_nhiet_do.pdf
