Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập nem chua Thủ Đức
62
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Evaluation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria strains isolated from
“nem chua Thu Duc”
Chi N. Vo, Phuong T. Nguyen∗, Tuyet T. A. Nguyen, Khoa A. Dinh, Tuyen B. Phan,
Hang D. Hoang, Thuy T. Le, & Tuyen C. Kha
Faculty of Chemical Engineering and Food Technology, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, Vietnam
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Research Paper
This study aimed to select some lactic acid bacteria (LAB)
strains to produce bacteriocin isolated from two different
local brand names of nem chua Thu Duc, a Vietnamese
traditional fermented meat product. Eight different LAB
strains were isolated from products. However, only Pedio-
Received: January 27, 2021
Revised: April 10, 2021
Accepted: April 16, 2021
coccus pentosaceus isolated from 72-h fermented “Ba Chin”
products and Weissella paramesenteroides isolated from 120-
h fermented “Diem” products were selectively screened for
their bacteriocin production. The antimicrobial activity was
detected by the agar diffusion method against Escherichia
coli ATCC 25922, Salmonella enterica serovar Typhimurium
ATCC 13076, Staphylococcus aureus ATCC 6538, and Bacil-
lus cereus ATCC 25924 used as target strains. Bacteriocin
of Pediococcus pentosaceus strain showed a high antibacterial
ability with a sterile ring diameter that produces an aver-
age of 12.20 - 16.07 mm. Bacteriocin of Weissella paramesen-
teroides strain only showed inhibitory activity on the growth
of indicator microorganisms with an average inhibitory ring
diameter of 9.75 - 15.27 mm. In conclusion, it seems like
both bacteriocin-producing P. pentosaceus and W. parame-
senteroides give potential applications as a starter culture,
bio-preservation and bio-safety control in fermented meat as
well as other kinds of fermented foods.
Keywords
Bacteriocin
lactic acid bacteria (LAB)
Nem chua Thu Duc
Pediococcus pentosaceus
Weissella paramesenteroides
∗Corresponding author
Nguyen Thi Phuong
Email: nguyenthiphuong@hcmuaf.edu.vn
Cited as: Vo, C. N., Nguyen, P. T., Nguyen, T. T. A., Dinh, K. A., Phan, T. B., Hoang, H. D.,
Le, T. T., & Kha, T. C. (2021). Evaluation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria strains
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
63
Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên
nem chua Thủ Đức
Võ Ngọc Chi, Nguyễn Thị Phượng∗, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Đinh Anh Khoa,
Phan Bích Tuyền, Hoàng Diễm Hằng, Lê Thị Thủy & Kha Chấn Tuyền
Khoa Công Nghệ Hóa Học và Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, TP. Hồ Chí Minh
THÔNG TIN BÀI BÁO
TÓM TẮT
Bài báo khoa học
Mục đích của nghiên cứu là tuyển chọn được các chủng vi
khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin được phân lập trên
nem chua tại Thủ Đức. Kết quả cho thấy có 2 trong số 8 chủng
vi khuẩn lactic được phân lập, có khả năng sinh bacteriocin là
Pediococcus pentosaceus trên nem chua Bà Chín lên men ngày
thứ 3 và Weissella paramesenteroides trên nem chua Diễm lên
men ngày thứ 5. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Pediococcus
pentosaceus và chủng Weissella paramesenteroides được phát
hiện bằng phương pháp khuếch tán thạch đều cho thấy hoạt
tính đối kháng với cả 4 chủng vi sinh vật chỉ thị là Escherichia
coli ATCC 25922, Salmonella enterica serova Typhimurium
ATCC 13076, Staphylococcus aureus ATCC 6538 và Bacillus
cereus ATCC 25924. Bacteriocin của chủng Pediococcus pen-
tosaceus có khả năng kháng khuẩn tốt với đường kính vòng vô
khuẩn tạo ra trung bình từ 12,20 - 16,07 mm. Đối với bacteri-
ocin của chủng Weissella paramesenteroides chỉ cho thấy hoạt
tính ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật chỉ thị với
đường kính vòng ức chế trung bình từ 9,75 - 15,27 mm. Tóm
lại có thể ứng dụng 2 chủng vi khuẩn lactic này trong việc tạo
ra các chế phẩm bacteriocin sinh học thay thế các chất bảo
quản hóa học kéo dài thời gian sử dụng sản phẩm thực phẩm.
Ngày nhận: 27/01/2021
Ngày chỉnh sửa: 10/04/2021
Ngày chấp nhận: 16/04/2021
Từ khóa
Bacteriocin
Nem chua Thủ Đức
Pediococcus pentosaceus
Vi khuẩn lactic
Weissella paramesenteroides
∗Tác giả liên hệ
Nguyễn Thị Phượng
Email: nguyenthiphuong@hcmuaf.edu.vn
1. Đặt Vấn Đề
như một phụ gia bổ sung trong chế biến thực
phẩm, giảm cường độ của các phương pháp xử lý
Nem chua là một sản phẩm thịt lên men truyền truyền thống, chẳng hạn như gia nhiệt. Hiện nay,
thống rất được ưa chuộng tại Việt Nam, đây là xu hướng về tiêu dùng các loại sản phẩm thực
một ứng dụng điển hình của lên men acid lac- phẩm với hương vị tươi ngon và không sử dụng
tic trong thực phẩm. Vi khuẩn lactic là tác nhân hóa chất bảo quản ngày càng tăng cao. Vì vậy,
quan trọng để lên men thịt, chúng có thể ức chế các chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên và có
sự phát triển của vi sinh vật khác bao gồm vi hoạt tính kháng khuẩn sinh học như LAB bacte-
khuẩn gây độc và hư hỏng thực phẩm vì chúng riocin được tìm kiếm để ứng dụng vào ngành công
sản sinh ra nhiều loại chất kháng khuẩn chẳng nghiệp thực phẩm thay thế các chất bảo quản hóa
hạn như các acid hữu cơ, hydro peroxide, diacetyl học bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng thực phẩm.
và bacteriocin (Pilasombut & ctv., 2015). Bacte-
riocin của vi khuẩn lactic được nghiên cứu nhiều 2. Vật Liệu và Phương Pháp Nghiên Cứu
nhất do tính ưu việt của chúng trong bảo quản
2.1. Vật liệu
thực phẩm cũng như tính an toàn với người sử
dụng (Woraprayote & ctv., 2016). Bacteriocins
thường không làm gây ra những thay đổi trong
sản phẩm thực phẩm và có thể được sử dụng
Nem Bà Chín được thu thập từ cơ sở nem Bà
Chín ở địa chỉ: số 58 đường Trần Hưng Đạo,
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
64
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Phường Hiệp Phú, Quận 9, Thành phố Hồ Chí trong môi trường, sau khi ly tâm xong dịch nổi
Minh và Nem Diễm được thu thập từ cơ sở nem được điều chỉnh pH bằng NaOH 1 N để đạt pH 6,8
Diễm ở địa chỉ: số 41 đường Lê Văn Ninh, Phường - 7,0 (Nguyen & ctv., 2017). Sau đó lấy phần dịch
Linh Tây, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí nổi bơm qua màng lọc Minisart (d = 0,2 M) để
Minh.
tách cặn khuẩn còn sót lại. Phần dịch lỏng thu
được sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp
theo.
Chủng vi sinh vật chỉ thị bao gồm: Escherichia
coli ATCC 25922, Salmonella enterica serova Ty-
phimurium ATCC 13076, Staphylococcus aureus
Khảo sát khả năng sinh bacteriocin bằng
ATCC 6538, Bacillus cereus ATCC 25924. Bốn phương pháp khuếch tán đĩa giấy theo Kirby
chủng vi sinh vật chỉ thị được cung cấp bởi Viện Bauer. Tiến hành tăng sinh 4 chủng vi sinh vật
Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Công chỉ thị bao gồm Escherichia coli, Salmonella Ty-
Nghiệp TP.HCM.
phimurium, Bacillus cereus và Staphylococcus au-
reus trong ống nghiệm chứa 10 mL môi trường
TSB nuôi ở 30oC trong 8 - 10 giờ. Sau đó 100 L
mỗi dung dịch được trải trên đĩa thạch TSA. Đặt
đĩa giấy đã được vô trùng có kích thước d = 7 mm
(4 - 6 đĩa giấy) trên đĩa môi trường thạch, dùng
micropipette hút 20 L dịch ly tâm của LAB ở
trên cho vào từng đĩa giấy. Các đĩa được giữ trong
tủ lạnh ở 4oC trong 4 giờ và sau đó ủ ở 30oC trong
24 giờ.
Môi trường: MRS broth, MRS agar, TSB, TSA
(Himedia, Ấn Độ).
Hóa chất: NaCl 0,85%, glycerol, H2O2 3%, cồn
95%, CaCO3, NaOH, Crystal Violet, Safranin,
Lugol.
Thuốc thử: Đĩa giấy thử phản ứng oxydase.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng
sinh bacteriocin với phương pháp thực hiện như
sau: Tách chiết DNA và thực hiện PCR với mồi
đặc hiệu vùng 16s. Sau đó giải trình tự trực tiếp
rồi so sánh trình tự với ngân hàng dữ liệu NCBI
bằng công cụ BLAST SEARCH từ đó xác định
mẫu vi khuẩn thuộc loài nào.
Phân lập vi khuẩn: 225 mL dung dịch NaCl
0,85% vô trùng được cho vào bao PE vô trùng
có chứa 25 g nem chua. Sau đó, đặt túi mẫu vào
trong máy dập mẫu và đồng nhất trong vòng 1
phút để tạo thành dung dịch huyền phù mẹ có
nồng độ 10−1. Dịch huyền phù được xác định
pH, sau đó tiếp tục được pha loãng đến nồng độ
10−8 (Mathara & ctv., 2004). Tiến hành cấy đĩa
ở các nồng độ 10−5, 10−6, 10−7 và 10−8. Dùng
micropipette hút 100 L dung dịch pha loãng cho
lên bề mặt đĩa thạch MRS. Dùng que cấy trang
đã tiệt trùng dàn đều dịch cho đến khi bề mặt
thạch khô. Đĩa thạch được đem đi ủ kỵ khí trong
48 giờ ở 37oC.
2.3. Phương pháp xử lí số liệu thống kê
Số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft
Excel 2013 và Statgraphics với độ tin cậy là 95%.
3. Kết Quả và Thảo Luận
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic bằng
cách tiến hành xác định hình thái khuẩn lạc,
nhuộm Gram, xác định đặc điểm tế bào, đồng
thời khảo sát khả năng di động và kiểm tra các
phản ứng sinh hóa như catalase, oxydase, khả
năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn đã
phân lập được.
3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ
các dòng vi khuẩn lactic phân lập được
Nguyen & ctv., (2013) đã phân lập được các
chủng LAB từ nem chua bao gồm: Lactobacil-
lus pentosus, Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. para-
casei, Lb. fermentum, Lb. acidipiscis, Lb. farci-
minis, Lb. rossiae, Lb. fuchuensis, Lb. namuren-
sis, Lc. lactis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc
fallax, Pediococcus acidipiscis, Pediococcus pen-
tosaceus, Pediococcus stilesii, Weissella cibaria và
Weissella paramesenteroides. LAB là tác nhân
quan trọng để lên men thịt, chúng có thể ức chế
sự phát triển của vi sinh vật khác bao gồm vi
khuẩn gây độc và hư hỏng thực phẩm vì chúng
sản sinh ra nhiều loại chất kháng khuẩn chẳng
Gia tăng sinh khối và thu dịch ly tâm sinh khối:
Dùng que cấy tiệt trùng lấy 1 vòng que cấy vi
khuẩn trong ống gốc eppendorf cho vào ống ly
tâm vô trùng có chứa 10 mL MRS. Các ống ly
tâm này được ủ ở 37oC trong 16 - 18 giờ (Hoa &
ctv., 2012). Các ống ly tâm sẽ được đem ly tâm
ở 8000 vòng trong 15 phút ở 4oC thu dịch nổi.
Nhằm tránh ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm
bởi sự ức chế gây ra bởi các acid hữu cơ có mặt
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
65
S. aureus
B. cereus
S. Typhimurium
E. coli
Hình 1. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic LAB1.
S. aureus
B. cereus
E. coli
S. Typhimurium
Hình 2. Hoạt tính ức chế của chủng vi khuẩn lactic LAB2 trên môi trường TSA.
Bảng 1. Đường kính vòng kháng khuẩn của LAB1 trên môi trường TSA
Vi
khuẩn
Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic LAB1 (dkk) mm
Staphylococcus aureus Bacillus cereus Salmonella Typhimurium Escherichia coli
Đường
kính
13,53a 0,21 16,07b 0,21 12,80ac 0,20 12,20c 0,70
a,b,cCác ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
Bảng 2. Đường kính vòng ức chế LAB2 trên môi trường TSA
Vi
khuẩn
Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn LAB2 (dkk) mm
Staphylococcus aureus Bacillus cereus Salmonella Typhimurium Escherichia coli
Đường
kính
11,90a 0,36 15,27b 0,35 9,75c 0,36
11,78a 0,27
a,b,cCác ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
hạn như các acid hữu cơ, hydro peroxide, diacetyl chỉ thị và có đường kính vòng kháng khuẩn trung
và bacteriocin (Pilasombut & ctv., 2015).
Diễm có hoạt tính ức chế đối với 4 chủng vi sinh
vật chỉ thị với đường kính vùng ức chế trung bình
thấy hoạt tính đối kháng với cả vi khuẩn Gram
âm và vi khuẩn Gram dương. Nhìn chung đường
kính vòng tròn kháng khuẩn hay ức chế của bac-
teriocin được sản sinh bởi vi khuẩn lactic đối với
Kết quả nghiên cứu trên 8 chủng vi khuẩn lac-
tic phân lập được từ 2 loại nem chua Thủ Đức đối
với 4 chủng vi sinh vật chỉ thị cho thấy có 2 chủng
vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin là
chủng LAB1 (được phân lập từ nem Bà Chín) và
Bà Chín kháng cả 4 chủng vi sinh vật gây bệnh
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
66
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Hình 3. Dạng khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của mẫu LAB1.
Hình 4. Trình tự gen chi tiết của mẫu LAB1.
Hình 5. Dạng khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của mẫu LAB2.
vi khuẩn Gram dương là lớn hơn so với vi khuẩn khuẩn Gram âm. Sự khác biệt này là vì vi khuẩn
Gram âm. Vì vi khuẩn Gram dương chỉ có một Gram âm có màng ngoài và không gian chu chất
lớp lipid, chúng thường nhạy cảm hơn so với vi trong khi ở vi khuẩn Gram dương thì không tìm
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
67
Hình 6. Trình tự gen chi tiết của mẫu LAB2.
thấy (Ceylan & Fung, 2007).
đa số các vi khuẩn Gram dương. Các đặc tính của
weissellin A làm cho nó trở thành một tác nhân
đầy hứa hẹn trong việc bảo quản thực phẩm.
3.2. Kết quả định danh các dòng vi khuẩn lac-
tic sinh bacteriocin
4. Kết Luận
Kết quả giải trình tự gen cho thấy mẫu LAB1
thuộc loài Pediococcus pentosaceus với mức tương
Và đặc điểm tế bào như sau: Tế bào có dạng hình
cầu đôi, cầu tứ, tế bào vi khuẩn Gram dương.
Theo Bajpai & ctv. (2016), dịch ly tâm sinh khối
của Pediococcus pentosaceus thể hiện tác dụng
kháng khuẩn đáng kể (P < 0,05) với đường kính
của vùng ức chế (16,5 - 20,4 mm) chống lại các
vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm.
Trong nghiên cứu này, 8 chủng vi khuẩn lac-
tic trên hai loại nem chua tại Thủ Đức là nem
Bà Chín và nem Diễm đã được phân lập. Từ
kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của 8
chủng vi khuẩn lactic này trên 4 chủng vi sinh
vật chỉ thị bao gồm Escherichia coli, Salmonella
Typhimurium, Bacillus cereus và Staphylococcus
aureus cho thấy có 2 chủng LAB có khả năng
sinh bacteriocin đó là Pediococcus pentosaceus và
Weissella paramesenteroides. Với khả năng sinh
bacteriocin, 2 chủng này có thể đem lại nhiều
tiềm năng mang tính ứng dụng trong việc tạo ra
chất bảo quản thực phẩm tự nhiên.
Kết quả giải trình tự gen cho thấy mẫu LAB2
thuộc loài Weissella paramesenteroides với mức
chuỗi, tế bào vi khuẩn Gram dương. Papagianni
& Papamichael (2011) đã chỉ ra rằng Weissella
paramesenteroides tạo ra một bacteriocin có tên
là weissellin A, có khả năng chịu nhiệt lên đến
121oC trong 1 giờ, và duy trì hoạt động của nó
trong phạm vi pH từ 2 - 10 hoạt động chống lại
Lời Cảm Ơn
Xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM đã tài trợ cho chúng tôi thực hiện
đề tài này (Mã số đề tài: CS-SV19-CNTP-04).
Tài Liệu Tham Khảo (References)
Bajpai, V. K., Han, J. H., Rather, I. A., Majumder, R.,
Nam, G. J., ChanSeo, P., Lim, J., Paek, W. K., & Park,
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
68
Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh
Y. H. (2016). Characterization of lactic acid bacterium
Pediococcus pentosaceus 4I1 from freshwater fish Zacco
koreanus and its antibacterial mode of action. PeerJ
PrePrints 4, e2121v1.
Nguyen, D. T. L., Van Hoorde, K., Cnockaert, M., De
Brandt, E., Aerts, M., & Vandamme, P. (2013). A
description of the lactic acid bacteria microbiota as-
sociated with the production of traditional fermented
vegetables in Vietnam. International Journal of Food
Microbiology 163(1), 19-27.
Ceylan, D. C., & Fung, Y. C., 2007. Antimicrobial activ-
ity of spices 1. Journal of Rapid Methods and Automa-
tion in Microbiology 12(1), 1-55.
Papagianni, M., & Papamichael, E. M. (2011). Purifica-
tion, amino acid sequence and characterization of the
class IIa bacteriocin weissellin A, produced by Weis-
sella paramesenteroides DX. Bioresource Technology
102(12), 6730-6734.
Hoa, T. T. M., & Nguyen, A. L. (2012). Classify of bacte-
ria lactococcus PD14 synthesized bacteriocin. Vietnam
Journal of Science and Technology 50(5), 635.
Mathara, J. M., Schillinger, U., Kutima, P. M., Mbugua,
S. K., & Holzapfel, W. H. (2004). Isolation, identifica-
tion and characterisation of the dominant microorgan-
isms of kule naoto: the Maasai traditional fermented
milk in Kenya. International Journal of Food Micro-
biology 94(3), 269-278.
Pilasombut, K., Rumjuankiat, K., Ngamyeesoon, N., &
Le, D. N. D. (2015). In vitro characterization of bac-
teriocin produced by lactic acid bacteria isolated from
Nem Chua, a traditional Vietnamese Fermented Pork.
Korean Journal for Food Science of Animal Resources
35(4), 473-478.
Nguyen, D. T. L., Hoang, V. T., Nguyen, T. T. T.,
Woraprayote, W., Malila, Y., Sorapukdee, S., Swetwi-
wathana, A., Benjakul, S., & Visessanguan, W. (2016).
Bacteriocins from lactic acid bacteria and their appli-
cations in meat and meat products. Meat Science 120,
118-132.
&
Nguyen, A. H. (2016). Isolation and selection
of lactic acid bacteria from Vietnamese fermented
pork meat product with antimicrobial activity and
characterization of bacteriocin. Vietnam Journal of
Agricultural Science 14(7), 1089-1099.
Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển 20(2)
7 trang
205420
Free
Bạn đang xem tài liệu "Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập nem chua Thủ Đức", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- khao_sat_kha_nang_sinh_bacteriocin_cua_vi_khuan_lactic_phan.pdf
