Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall. ex Roxb.) A.DC.)
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
…………***…………
HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG
(ANODENDRON PANICULATUM (WALL. EX ROXB.) A.DC.)
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 62.44.01.14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Huế, năm 2018
Công trình được hoàn thành tại:
Đại học Huế
Trường Đại học Khoa học
Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. NGUYỄN THỊ HOÀI
Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế - Đại học Huế
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học
Huế họp tại:
Vào hồi: ……….giờ………..ngày………tháng………..năm
Có thể tìm hiểu Luận án tại:
- Thư viện
- Thư viện
MỞ ĐẦU
Sự gia tăng nhanh chóng của nhiều căn bệnh nguy hiểm có khả
năng lan rộng như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp
SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, dịch Ebola, chứng đầu nhỏ
do virus Zika… đang là một cuộc khủng hoảng thực sự cho sức khỏe
cộng đồng và là thách thức không nhỏ cho hệ thống y tế trên toàn thế
giới. Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các
nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các thuốc mới,
các phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho thấy thực
vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển
thuốc.
Trong quá trình sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây
thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị mà chúng tôi đã
khảo sát, 10 cây thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống ung
thư đã được đưa vào sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Trong
đó, cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum Roxb. A.DC. –
Apocynaceae) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung
thư tốt trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 thấp,
đặc biệt là trên các dòng tế bào LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung
thư gan) và MKN-7 (ung thư dạ dày). Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt
Nam chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tác dụng sinh
học của loài này. Việc sử dụng cây Tốc thằng cáng để chữa các bệnh
liên quan đến khối u chủ yếu là dựa vào tri thức bản địa của đồng bào
Pako, Vân Kiều. Do đó loài cây này cần được nghiên cứu sâu hơn về
thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Từ những lí do nêu
trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc
tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum
1
(Wall. ex Roxb.) A.DC.)” được đề xuất với 2 mục tiêu:
1. Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chính của loài
Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC.
2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất
phân lập được từ loài này
Nội dung nghiên cứu của luận án:
1. Chiết tách, phân lập, tinh chế các hợp chất từ loài Anodendron
paniculatum (Roxb.) A.DC.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập
3. Thử hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các hợp
chất đã phân lập.
Đóng góp mới của luận án:
1. Đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất mới
[anopaniester, anopanin A–C] và 16 hợp chất đã biết từ loài
Anodendron paniculatum. Trong đó, 14 hợp chất [cycloartenol, (E)-
phytol, desmosterol, esculentic acid, kaempferol-3-O-rutinoside,
rutin, sargentol, 4-O-β-D-glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid,
inugalactolipid A, gingerglycolipid A–C, (2S)-1-O-palmitoyl-3-O-[-
D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol, (2R)-1-
O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol] được phân
lập lần đầu tiên từ chi Anodendron.
2. Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của 17 hợp chất
phân lập được trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau (LU-1,
MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480, HL-60, LNCaP, MCF-7). Trong đó,
desmosterol có tác dụng ức chế ở mức trung bình với 5 dòng tế bào
LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480 với giá trị IC50 từ 28,11±1,95
đến 41,41±2,31 µg/mL. Hợp chất ursolic acid, (2R)-1-O-palmitoyl-3-
O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol thể hiện hoạt tính ức chế tế
2
bào LU-1 và MKN-7 với giá trị IC50 từ 30,89±3,60 đến 72,42±8,05
µg/mL.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Bản luận án chính đã tổng quan tài liệu về họ Trúc đào và chi
Anodendron với các mục:
1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae)
1.2. Giới thiệu về chi Anodendron
1.2.1. Vị trí phân loại
1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
1.2.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học
1.3. Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Phần trên mặt đất của loài Tốc thằng cáng (Anodendron
paniculatum (Roxb.) A.DC.)
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất
Phối hợp các phương pháp sắc ký: Sắc ký bản mỏng, sắc ký cột
trên Silica gel pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20, nhựa trao đổi
ion Diaion HP-20.
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Kết hợp các thông số vật lý (mp, [α]D), các dữ kiện phổ (IR, UV,
MS, 1D-, 2D-NMR) và các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân
tích, so sánh với các tài liệu tham khảo.
3
Phương pháp xác định thành phần monosaccharide
Mẫu saponin được thủy phân bằng dung dịch TFA 4 M ở 105oC
trong 4 giờ. Monosaccharide sau đó được khử thành alditol bằng
NaBH4 và được acetyl hóa bằng hỗn hợp acetic anhydride–pyridine
(1:1, v/v) ở 110oC trong 2 giờ. Các alditol per-acetate tạo thành được
phân tích bằng phương pháp GC-MS. Thành phần monosaccharide
được xác định thông qua việc so sánh thời gian lưu của các dẫn xuất
alditol per-acetate của chúng với các giá trị tương ứng của
monosaccharide chuẩn trong cùng điều kiện phân tích.
Phương pháp xác định hợp phần acid béo của các glycolipid
Glycolipid được hòa tan trong toluene sau đó bổ sung thêm lần
lượt MeOH, dung dịch HCl 8% (pha trong MeOH). Hỗn hợp được ủ
ở 45oC khoảng 2h (để thủy phân một phần) hoặc qua đêm (để thủy
phân hoàn toàn). Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm n-
hexane và nước để chiết lấy dẫn xuất methyl ester (FAME) tạo thành.
Các dẫn xuất FAME được phân tích bằng phương pháp GC-MS.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc tế bào in vitro được thử trên 8 dòng tế bào
(HL-60, LNCaP, MCF-7, LU-1, Hep-G2, KB, MKN-7 và SW-480)
theo phương pháp SRB tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
4
Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết:
Bột nguyên liệu khô đã qua xử lý (2,5 kg) được chiết với MeOH
(10,0 lít x 3 lần) ở nhiệt độ phòng (72 giờ/lần), cất loại dung môi
dưới áp suất thấp thu được cao chiết MeOH (105 g). Cao chiết này
được phân tán vào nước rồi lần lượt chiết với chloroform (CHCl3, 2
lít x3 lần), ethyl acetate (EtOAc, 2 lít x3 lần). Cất loại dung môi dưới
áp suất thấp thu được các phân đoạn tương ứng là CHCl3 (AC, 50,7
g), EtOAc (AE, 10,2 g) và nước (AW, 27,5 g).
3.2. Quá trình phân lập các hợp chất:
Pha tĩnh
Silica gel
Silica gel
Silica gel
YMC RP-18
Silica gel
Silica gel
Pha động
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
Gradient CHCl3–MeOH (100:00:100, v/v)
Gradient n-hexan–acetone (100:04:1, v/v)
n-hexan–EtOAc (10:1, v/v)
MeOH–acetone–H2O (10:5:1, v/v)
n-hexan–acetone (5:1, v/v)
CHCl3–MeOH (20:1, v/v)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn
chloroform của cây Tốc thằng cáng
5
Pha tĩnh
Pha động
(1)
Diaion HP-20
Gradient MeOH−H2O (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
YMC RP-18
Silica gel
Sephadex LH-20 MeOH
Silica gel
Silica gel
Sephadex LH-20 MeOH–H2O (4:1, v/v),
YMC RP-18
Silica gel
MeOH–H2O (1:1, v/v)
CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v)
CHCl3–MeOH–H2O (5:1:0,1, v/v)
CHCl3–MeOH–H2O (4:1:0,1, v/v)
MeOH–MeCN–H2O (3:2:3, v/v)
CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v)
CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v)
MeOH–H2O (3:2, v/v)
MeOH–H2O (6:1, v/v)
EtOAc–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v)
(10) Silica gel
(11) YMC RP-18
(12) YMC RP-18
(13) Silica gel
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước
của cây Tốc thằng cáng
6
3.3. Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập
3.3.1. Hợp chất AP1: Cycloartenol
Chất bột màu trắng; IR (KBr) max (cm-1): 3418, 2928, 1670,
1
13
1443, 1377; CTPT C30H50O; M = 426; H và C-NMR: xem Bảng
4.1 và Phụ lục 1.
3.3.2. Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới)
Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3443, 2922, 2853,
1736, 1630, 1466, 1377, 1260, 1180, 1094; UV (MeOH) max (nm):
201, 231; HRESIMS: m/z 725,5805 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho
1
công thức C48H78O3Na, 725,5849); CTPT: C48H78O3; M = 702; H-
NMR (500 MHz, CDCl3) H (ppm): 1,22 (H-1a), 1,60 (H-1b), 1,61 (H-
2a), 1,74 (H-2b), 4,56 (dd, J = 11,0, 4,5 Hz, H-3), 1,42 (H-5), 0,79 (H-
6a), 1,57 (H-6b), 1,08 (H-7a), 1,31 (H-7b), 1,52 (dd, J = 12,0, 4,5 Hz,
H-8), 1,11 (H-11a), 1,98 (H-11b), 1,61 (H-12), 1,28 (H-15), 1,29 (H-
16a), 1,92 (H-16b), 1,58 (H-17), 1,96 (s, H-18), 0,33 (br.d, J = 4,0 Hz,
H-19a), 0,57 (br.d, J = 4,0 Hz, H-19b), 1,38 (H-20), 0,88 (d, J = 7,0
Hz, H-21), 1,04 (H-22a), 1,41 (H-22b), 1,86 (H-23a), 2,03 (H-23b),
5,10 (t, J = 6,0 Hz, H-24), 1,68 (s, H-26), 1,60 (s, H-27), 0,84 (s, H-
28), 0,89 (s, H-29, H-30), 2,30 (H-2), 1,61 (H-3), 1,30 (H-4), 1,30
(H-5), 1,30 (H-6), 1,36 (H-7), 2,17 (td, J = 8,0, 7,0 Hz, H-8), 5,43
(td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-9), 5,97 (dd, J = 11,5, 10,5 Hz, H-10), 6,51
(dd, J = 15,0, 11,5 Hz, H-11), 5,69 (dd, J = 15,0, 6,5 Hz, H-12), 4,20
(m, H-13), 2,33 (H-14), 5,36 (td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-15), 5,57 (td, J
= 10,5, 7,5 Hz, H-16), 2,06 (m, H-17), 0,97 (t, J = 7,5 Hz, H-18);
13C-NMR (125 MHz, CDCl3) C (ppm): 31,7 (C-1), 27,0 (C-2), 80,5
(C-3), 39,6 (C-4), 47,3 (C-5), 21,1 (C-6), 26,0 (C-7), 48,0 (C-8), 20,3
(C-9), 26,1 (C-10), 26,6 (C-11), 33,0 (C-12), 45,4 (C-13), 48,9 (C-14),
35,7 (C-15), 28,3 (C-16), 52,4 (C-17), 18,1 (C-18), 29,9 (C-19), 36,0
7
(C-20), 18,4 (C-21), 36,5 (C-22), 25,1 (C-23), 125,3 (C-24), 131,0 (C-
25), 25,9 (C-26), 17,8 (C-27), 25,6 (C-28), 15,4 (C-29), 19,4 (C-30),
173,8 (C-1), 35,0 (C-2), 25,2 (C-3), 29,1 (C-4), 29,2 (C-5), 29,6 (C-
6), 29,8 (C-7), 27,8 (C-8), 133,1 (C-9), 127,9 (C-10), 126,0 (C-11),
135,2 (C-12), 72,3 (C-13), 35,4 (C-14), 123,9 (C-15), 135,3 (C-16),
20,9 (C-17), 14,4 (C-18).
3.3.3. Hợp chất AP3: (E)-Phytol
Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3449, 2932, 1636,
1462, 1381, 1003; HRESIMS: m/z 319,2931 [M + Na]+ (tính toán lý
thuyết cho công thức C20H40ONa, 319,2977); CTPT C20H40O; M =
296; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.4 và Phụ lục 3
3.3.4. Hợp chất AP4: Desmosterol
Chất bột màu trắng; mp: 122–124oC; IR (KBr) max (cm-1): 3445,
2936, 1636, 1462, 1377, 1053; HRESIMS: m/z 385,3513 [M + H]+
(tính toán lý thuyết cho công thức C27H45O, 385,3470); CTPT
C27H44O; M = 384; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.5 và Phụ lục 4.
3.3.5. Hợp chất AP5: Ursolic acid
Chất bột màu trắng;
20 +65 (c 0,5, EtOH), mp 284–286oC, UV
[]D
(MeOH) λmax (nm): 201, 230; IR (KBr) νmax (cm-1): 3433, 2870, 1690;
ESIMS: m/z 479,2 [M + Na]+, 455,2 [M - H]-; CTPT C30H48O3; M =
456; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.6 và Phụ lục 5.
3.3.6. Hợp chất AP6: Vanillin
Chất bột màu trắng; mp 82–84oC, UV (MeOH) λmax (nm): 204, 231,
278, 309; IR (KBr) νmax (cm-1): 3310, 1674, 1589, 1512, 1026, ESIMS:
13
m/z 175,0 [M + Na]+; CTPT C8H8O3; M = 152; 1H và C-NMR: xem
Bảng 4.7 và Phụ lục 6.
3.3.7. Hợp chất AP7: Esculentic acid
Chất bột màu trắng; mp 267–268oC; IR (KBr) νmax (cm-1): 3425,
8
2927, 2363, 1690, 1458, 1038; HRESIMS: m/z 511,3390 [M + Na]+
(tính toán lý thuyết cho công thức C30H48O5Na, 511,3399); CTPT
C30H48O5; M = 488; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.8 và Phụ lục 7.
3.3.8. Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside
[]2D0
Chất bột màu vàng;
+11 (c 0,8, MeOH); mp 188–190oC,
UV (MeOH) λmax (nm): 203, 267, 351; IR (KBr) νmax (cm-1): 3410, 1659,
1605, 1497, 1566, 1180, 1065; ESIMS: m/z 617,1 [M + Na]+, 593,1 [M
1
13
- H]-; CTPT C27H30O15; M = 594; H và C-NMR: xem Bảng 4.9 và
Phụ lục 8.
3.3.9. Hợp chất AP9: Rutin
Chất bột màu vàng;
20 +4 (c 0,5, MeOH), mp 193–195oC, UV
[]D
(MeOH) λmax (nm): 204, 257, 357; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 1651, 1605,
1504 , 1204, 1065; ESIMS: m/z 633,1 [M + Na]+, 609,1 [M - H]-; CTPT
C27H30O16; M = 610; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.10 và Phụ lục 9.
3.3.10. Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới)
Chất bột trắng; mp: 213–215oC;
(KBr) max (cm-1): 3418, 2932, 1713, 1632, 145, 1383, 1265, 1070,
1030; HRESIMS: m/z 1025,5294 [M + Na]+ (tính toán cho
22 -19,9 (c 0.1, MeOH); IR
[]D
1
C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT C50H82O20; H và 13C-NMR: xem
Bảng 4.11, 4.12.
3.3.11. Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới)
Chất bột trắng; mp: 222–224oC;
(KBr) max (cm-1): 3443, 2930, 1730, 1647, 1460, 1377, 1252, 1074,
1028; HRESIMS: m/z 1027,5452 [M + Na]+ (tính toán cho
22 +77,7 (c 0,1, MeOH); IR
[]D
1
C50H84O20Na, 1027,5454); CTPT C50H84O20; H-NMR (600 MHz,
C5D5N) H (ppm): 1,11 (H-1a), 1,43 (H-1b), 1,84 (m, H-2a), 2,27 (m,
H-2b), 3,38 (dd, J = 11,4, 4,2 Hz, H-3), 1,26 (H-5), 0,68 (q, J = 12,6
Hz, H-6a), 1,51 (H-6b), 1,03 (H-7a), 1,22 (H-7b), 1,52 (H-8), 1,06
9
(H-11a), 1,98 (H-11b), 1,60 (H-12a), 1,66 (H-12b), 1,48 (H-15a),
2,01 (H-15b), 5,27 (dd, J = 6,0, 6,0 Hz, H-16), 2,15 (s, CH3COO),
2,08 (dd, J = 10,2, 6,6 Hz, H-17), 1,01 (s, H-18), 0,20 (d, J = 4,2 Hz,
H-19a), 0,46 (d, J = 4,2 Hz, H-19b), 1,78 (H-20), 1,02 (d, J = 6,0 Hz,
H-21), 1,74 (H-22), 1,88 (H-23), 3,76 (m, H-24), 1,52 (s, H-26), 1,55
(s, H-27), 1,30 (s, H-28), 1,14 (s, H-29), 1,13 (s, H-30), 4,86 (d, J =
7,2 Hz, H-1), 4,29 (H-2), 4,30 (H-3), 4,26 (H-4), 3,84 (ddd, J =
9,6, 3,6, 3,0 Hz, H-5), 4,49 (H-6a), 4,53 (H-6b), 5,42 (d, J = 7,8, H-
1), 4,10 (H-2), 4,23 (H-3), 4,34 (H-4), 3,94 (ddd, J = 9,6, 3,6,
3,6 Hz, H-5), 4,48 (H-6a), 4,52 (H-6b), 5,16 (d, J = 7,8 Hz, H-
1‴), 4,09 (H-2‴), 4,26 (H-3‴), 4,24 (H-4‴), 4,00 (m, H-5‴), 4,32 (H-
6‴a), 4,51 (H-6‴b); 13C-NMR (150 MHz, C5D5N) C (ppm): 32,5
(C-1), 30,3 (C-2), 89,4 (C-3), 41,7 (C-4), 48,2 (C-5), 21,5 (C-6), 26,8
(C-7), 48,0 (C-8), 19,8 (C-9), 26,8 (C-10), 27,1 (C-11), 33,5 (C-12),
47,0 (C-13), 48,0 (C-14), 46,2 (C-15), 80,8 (C-16), 171,2 (CH3COO),
22,0 (CH3COO), 58,1 (C-17), 19,5 (C-18), 30,4 (C-19), 34,7 (C-20),
19,1 (C-21), 33,7 (C-22), 28,5 (C-23), 79,6 (C-24), 73,2 (C-25), 26,6
(C-26), 26,4 (C-27), 26,2 (C-28), 15,8 (C-29), 20,3 (C-30), 105,1 (C-
1), 82,2 (C-2), 77,1 (C-3), 81,6 (C-4), 76,5 (C-5), 62,6 (C-6),
106,0 (C-1), 77,6 (C-2), 78,6 (C-3), 72,2 (C-4), 78,7 (C-5), 63,3
(C-6), 105,4 (C-1‴), 75,3 (C-2‴), 78,3 (C-3‴), 71,9 (C-4‴), 78,9
(C-5‴), 62,7 (C-6‴).
3.3.12. Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới)
Chất bột trắng; mp: 218–219oC;
(KBr) max (cm-1): 3428, 2932, 1709, 1630, 1456, 1381, 1261, 1072,
1028; HRESIMS: m/z 1025,5293 [M + Na]+ (tính toán cho
22 +66,7 (c 0,1, MeOH); IR
[]D
1
C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT C50H82O20; H-NMR (600 MHz,
C5D5N) H (ppm): 1,07 (H-1a), 1,42 (H-1b), 1,84 (m, H-2a), 2,27 (m,
10
H-2b), 3,38 (dd, J = 11,4, 4,2 Hz, H-3), 1,25 (H-5), 0,68 (q, J = 12,6
Hz, H-6a), 1,51 (H-6b), 1,01 (H-7a), 1,23 (H-7b), 1,52 (H-8), 1,04
(H-11a), 1,92 (H-11b), 1,62 (H-12a), 1,66 (H-12b), 1,48 (H-15a),
2,01 (m, H-15b), 5,33 (dd, J = 7,8, 7,2 Hz, H-16), 2,21 (s, CH3COO),
2,51 (dd, J = 10,8, 6,0 Hz, H-17), 1,03 (s, H-18), 0,20 (d, J = 3,6 Hz,
H-19a), 0,46 (d, J = 3,6 Hz, H-19b), 1,68 (m, H-20), 1,21 (d, J = 6,6
Hz, H-21), 4,19 (m, H-22), 2,10 (m, H-23a), 2,29 (m, H-23b), 4,28
(H-24), 6,41 (d, J = 4,8 Hz, 24-OH), 1,31 (s, H-26), 1,53 (s, H-27),
1,30 (s, H-28), 1,14 (s, H-29), 1,06 (s, H-30), 4,86 (d, J = 7,8 Hz, H-
1), 4,29 (H-2), 4,30 (H-3), 4,25 (H-4), 3,83 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,0
Hz, H-5), 4,48 (H-6a), 4,53 (H-6b), 5,42 (d, J = 7,2 Hz, H-1),
4,10 (H-2), 4,23 (H-3), 4,35 (H-4), 3,94 (ddd, J = 9,6, 3,6, 3,6 Hz,
H-5), 4,46 (H-6a), 4,51 (H-6b), 5,16 (d, J = 8,4 Hz, H-1‴), 4,09
(H-2‴), 4,25 (H-3‴), 4,24 (H-4‴), 4,00 (m, H-5‴), 4,32 (H-6‴a),
13
4,50 (H-6‴b); C-NMR (150 MHz, C5D5N) C (ppm): 32,5 (C-1),
30,3 (C-2), 89,4 (C-3), 41,7 (C-4), 48,2 (C-5), 21,5 (C-6), 26,7 (C-7),
48,0 (C-8), 19,8 (C-9), 26,8 (C-10), 27,1 (C-11), 33,5 (C-12), 47,1
(C-13), 48,0 (C-14), 46,2 (C-15), 80,3 (C-16), 171,0 (CH3COO), 22,1
(CH3COO), 56,2 (C-17), 19,4 (C-18), 30,4 (C-19), 38,3 (C-20), 12,8
(C-21), 76,3 (C-22), 39,6 (C-23), 78,3 (C-24), 82,8 (C-25), 27,1 (C-
26), 24,2 (C-27), 26,2 (C-28), 15,8 (C-29), 20,2 (C-30), 105,1 (C-1),
82,2 (C-2), 77,1 (C-3), 81,6 (C-4), 76,5 (C-5), 62,6 (C-6), 105,9
(C-1), 77,6 (C-2), 78,6 (C-3), 72,2 (C-4), 78,7 (C-5), 63,3 (C-
6), 105,4 (C-1‴), 75,3 (C-2‴), 78,3 (C-3‴), 71,9 (C-4‴), 78,9 (C-
5‴), 62,7 (C-6‴).
3.3.13. Hợp chất AP13: Sargentol
Chất bột màu trắng; 20 –70 (c 0,05, MeOH), mp 271–272oC, UV
[]D
(MeOH) λmax (nm): 207, 273; IR (KBr) νmax (cm-1): 3387, 1597, 1504,
11
1466, 1234, 1072; ESIMS: m/z 325 [M–H–2OCH3]-; CTPT C17H24O10,
M = 388; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.17 và Phụ lục 13.
3.3.14. Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic
acid
Chất bột màu trắng; UV (MeOH) λmax (nm): 250, 205; IR (KBr)
νmax (cm-1): 3379, 2916, 1694, 1605, 1504, 1250, 1084, 1042;
HRESIMS: m/z 391,1398 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công
1
13
thức C18H24O8Na, 391,1369); CTPT C18H24O8, M = 368; H và C-
NMR: xem Bảng 4.18 và Phụ lục 14.
3.3.15. Hợp chất AP15: Inugalactolipid A
Chất bột màu trắng; HRESIMS: m/z 937,5842 [M + Na]+ (tính
toán lý thuyết cho công thức C49H86O15Na, 937,5864); CTPT
C49H86O15; M = 914; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.19 và Phụ lục 15.
3.3.16. Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A
Chất bột màu trắng;
763,3423 [M+Na+4xO]+ (tính toán lý thuyết cho công thức
22 +35,7 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z
[]D
1
C33H56O18Na, 763,3364); CTPT C33H56O14; M = 676; H và 13C-
NMR: xem Bảng 4.20 và Phụ lục 16.
3.3.17. Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B
Chất bột màu trắng;
701,3721 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H58NaO14,
22 +57,0 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z
[]D
1
13
701,3724); CTPT C33H58O14; M = 678; H và C-NMR: xem Bảng
4.21 và Phụ lục 17.
3.3.18. Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C
Chất bột màu trắng;
703,3878 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H60NaO14,
22 +29,4 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z
[]D
1
13
703,3881); CTPT C33H60O14; M = 680; H và C-NMR: xem Bảng
4.22 và Phụ lục 18.
12
3.3.19. Hợp
galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol
Chất bột màu trắng;
22 +51,6 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z
chất
AP19:
(2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-
[]D
677,3746 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C31H58O14Na,
1
13
677,3724); CTPT C31H58O14; M = 654; H và C-NMR: xem Bảng
4.23 và Phụ lục 19.
3.3.20. Hợp
chất
AP20:
(2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6-
sulfoquinovopyranosyl)glycerol
Chất bột màu trắng; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 2932, 2367, 1713,
1383, 1265, 1070; HRESIMS: m/z 579,2797 [M+Na]+ (tính toán lý
thuyết cho công thức C25H48O11SNa, 579,2815); CTPT C25H48O11; M
= 556; 1H và 13C-NMR: xem Bảng 4.24 và Phụ lục 20.
3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết
Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết từ
Tốc thằng cáng được thử nghiệm trên các dòng tế bào LU-1, Hep-G2,
HL-60, KB, LNCaP, MKN-7, SW-480 và MCF-7. Kết quả được
trình bày ở Bảng 3.1.
13
Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc của các hợp chất đã phân lập trên
các dòng tế bào ung thư khác nhau
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập
Bằng cách kết hợp các phương pháp sắc ký, tổng cộng 20 hợp
chất đã được phân lập từ loài Anodendron paniculatum. Trong đó có
4 chất mới, 14 chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Anodendron.
Các hợp chất phân lập được thống kê ở bảng 4.25. Dưới đây trình
bày chi tiết quá trình xác định cấu trúc hóa học của 1 hợp chất mới
AP10.
Hợp chất AP10 được tách ra dưới dạng bột trắng. Phổ HRESIMS
của hợp chất này chỉ ra píc ion giả phân tử tại m/z 1025,5294 [M+Na]+
(tính toán cho công thức C50H82O20Na là 1025,5297). Kết hợp với
phân tích phổ NMR, CTPT của hợp chất AP10 được xác định là
C50H82O20. Phổ IR chỉ ra các dải hấp thụ mạnh ứng với nhóm carbonyl
(1713 cm-1), liên kết đôi (1632 cm-1), ether (1010, 1070 cm-1) và
hydroxyl (3418 cm-1).
1
Phổ H-NMR của AP10 trong C5D5N cho thấy các tín hiệu đặc
14
trưng của 7 nhóm methyl singlet tại δH 1,13 (H3-29), 1,25 (H3-30),
1,30 (H3-28), 1,57 (H3-18), 1,66 (H3-27), 1,67 (H3-26) và 1,69 (H3-
21); 1 nhóm acetoxy tại δH 2,06 (3H, s); 3 proton anomer tại δH 4,86
(1H, d, J = 7,2 Hz), 5,16 (1H, d, J = 7,8 Hz) và 5,41 (1H, d, J = 7,8
Hz) đề nghị sự có mặt của ba đơn vị đường với cấu hình . Ngoài ra,
hai proton methylene của nhóm cyclopropyl tại δH 0,22 (1H, d, J =
4,2 Hz, H-19a) và 0,49 (1H, d, J = 4,2 Hz, H-19b) cũng được ghi
nhận.
Phân tích phổ 13C-NMR, DEPT và HMQC chỉ ra 50 tín hiệu
trong đó 30 tín hiệu carbon được gán cho hợp phần aglycone, 18 tín
hiệu thuộc về 3 đơn vị đường hexose và 2 tín hiệu đặc trưng của
nhóm acetoxy (δC 171,2 và 22,0). Các dữ kiện phổ NMR gợi ý hợp
phần aglycone sở hữu bộ khung cycloartane với 2 carbon olefin của
liên kết đôi ba lần thế (δC 125,1 và 132,5), 3 nhóm oxymethine (δC
77,2, 79,0 và 89,4), 1 carbon bậc ba mang oxy (δC 76,7), 7 nhóm
methyl (δC 15,8, 18,6, 20,7, 21,2, 21,7, 26,2 và 26,4). Việc gán ghép
đầy đủ cho tất cả proton và carbon được thực hiện qua phân tích chi
tiết phổ HMQC, HMBC và COSY. Cụ thể, tương tác HMBC giữa
H3-28 (δH 1,30)/H3-29 (δH 1,13) và C-3 (δC 89,4)/C-4 (δC 41,7)/C-5
(δC 48,1) xác nhận vị trí của nhóm oxymethine (C-3) và nhóm gem-
dimethyl ở C-4 trong cấu trúc của vòng A. Tương tự, tương tác
HMBC giữa H3-21 (δH 1,69) và C-17 (δC 56,5)/C-20 (δC 76,7)/C-22
(δC 79,0), giữa H3-26 (δH 1,67)/H3-27 (δH 1,66) và C-24 (δC 125,1)/C-
25 (δC 132,5) giúp thiết lập vị trí của hai nhóm hydroxyl tại C-20, C-
22 cũng như liên kết đôi tại C-24/C-25 của mạch nhánh. Hơn nữa,
nhóm acetoxy tại C-16 (δC 77,2) được xác nhận thông qua tương tác
HMBC giữa H-16 (δH 6,20) và carbon của nhóm carboxyl tại δC
171,2 (Hình 4.33). Từ các dữ kiện trên cấu trúc phần aglycone được
15
xác định là 16-acetoxy-3,20,22-trihydroxycycloart-24-ene.
Hóa lập thể của hợp phần aglycone của AP10 được thiết lập chủ
yếu dựa vào dữ liệu phổ ROESY cũng như phân tích hằng số tương
tác J. Theo đó, tương tác ROESY giữa H-3 (δH 3,38) với H-1 (δH
1,43)/H-5 (δH 1,26)/H3-28, giữa H-2 (δH 1,84) và H3-29 đề nghị định
hướng cho H-3, H-5 và H3-28 cũng như cấu dạng ghế của vòng A
(Hình 4.34). Thêm vào đó, giá trị J (11,4 và 4,2 Hz) giữa H-3 và H-2
(δH 1,84, 2,27) là đặc trưng cho H-3/axial của các triterpenoid
khung cycloartane. Tương tác ROESY giữa H-16 và H3-18/H-22 (δH
3,92), giữa H-17 (δH 3,19) và H3-30 (δH 1,25) cùng sự vắng mặt
tương tác giữa H-16 và H3-30 (δH 1,25) chứng tỏ định hướng của
nhóm 16-OAc và H-17. Cấu hình tuyệt đối của C-20 được xác định là
R dựa vào tương tác ROESY giữa H3-21 và H-12 (δH 1,91)/H-17,
giữa 20-OH (δH 5,61) và H-16/H3-18 cũng như sự vắng mặt của
tương tác giữa H3-21 và H3-18, giữa 20-OH và H-17. Lập luận này
cũng được củng cố thông qua việc so sánh độ chuyển dịch hóa học
của C-21 (δC 21,7) với các giá trị tương ứng của 4 đồng phân lập thể
của 5-cholestane-3,20,22-triol [δC-21: 21,1 (20R,22R), 21,9
(20R,22S), 23,8 (20S,22S), 24,2 (20S,22R)]. Cấu hình tuyệt đối của
C-22 được xác định là S bằng cách so sánh các giá trị δC của C-20 và
C-22 của AP10 với các dạng 20R,22R và 20R,22S (trong C5D5N) của
13
một số chất có cấu trúc tương tự. Trên phổ C-NMR của các hợp
chất có cấu hình 20R,22R như cholestane-3β,20R,22R-triol,
vitexirone, frondoside A7-3, frondoside A7-4 và stachysterone C, giá
trị C của C-20 và C-22 khá gần nhau (C < 0,4 ppm). Trái lại, các
giá trị C này khác nhau khoảng 2 ppm ở cấu hình 20R,22S. Giá trị C
13
của C-20 và C-22 trên phổ C-NMR của AP10 lần lượt là 76,7 và
79,0 ppm cho phép đề nghị cấu hình 20R,22S của AP10. Điều này
16
được củng cố nhờ tương tác ROESY giữa 22-OH (δH 5,64) với H3-
21/H-23 (δH 2,58), giữa H-22 với H-16 và sự khuyết tương tác giữa
22-OH với H-16/20-OH/H-23β (δH 2,93).
Thành phần monosaccharide của hợp chất AP10 được xác định
là D-glucose theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.2. Theo đó, sắc ký
đồ GC-MS cho một píc duy nhất với tR 26,65 phút trùng với dẫn xuất
alditol hexaacetate của D-glucose chuẩn (Sigma-Aldrich). Kết luận
13
này được củng cố nhờ vào sự tương đồng các giá trị phổ C-NMR
của phần đường với các giá trị tương ứng của hợp chất shatavarin IX
[3-O-{[-D-glucopyranosyl(1→2)][-D-glucopyranosyl(1→4)]--D-
glucopyranosyl}-(25S)-5-spirostan-3-ol]. Hơn nữa, các tương tác
HMBC từ H-1 (δH 5,41) đến C-2 (δC 82,2), từ H-1′′′ (δH 5,16) đến
C-4 (δC 81,6) cho phép thiết lập trật tự liên kết của các đơn vị đường
là
[β-D-glucopyranosyl(1→2)][β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D-
glucopyranosyl. Ngoài ra, các tương tác HMBC giữa H-1′ (δH 4,86)
với C-3 (δC 89,4) và giữa H-3 (δH 3,38) với C-1′ (δC 105,1) khẳng
định vị trí của phần đường tại C-3 của khung cycloartane.
Từ các bằng chứng trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP10
được
thiết
lập
là
(3,16,20R,22S)-16-acetoxy-20,22-
3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→2)][-D-
dihydroxycycloart-24-ene
glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucopyranoside (Hình 4.32). Đây là một
saponin mới, được đặt tên là anopanin A.
17
Hình 4.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP10
Hình 4.33. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP10
Hình 4.34. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP10
18
Tải về để xem bản đầy đủ
25 trang
12060
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall. ex Roxb.) A.DC.)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- tom_tat_luan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_g.pdf
