Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ĐÔNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ HẠ

GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP THÂN CÂY

CHUỐI TIÊU (MUSA X PARADISIACA L.)

TRÊN THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Hoá sinh Dược

Mã số: 62720408

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2017

Công trình đƣợc hoàn thành tại: Bộ môn Hoá sinh,

trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

PGS.TS. Phùng Thanh Hƣơng

GS.TS. Nguyễn Hải Nam

Phản biện 1 : …………………………………………..

…………………………………………..

Phản biện 2 : …………………………………………..

…………………………………………..

Phản biện 3 : …………………………………………..

…………………………………………..

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án

cấp trƣờng họp tại: Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội

Vào hồi ….giờ……ngày….tháng…. năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại: Thƣ viện Quốc gia Việt Nam

Thƣ viện Trƣờng ĐH Dƣợc HN

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm qua, sô các nghiên cưu vê

tăng lên nhanh chong. Kết quả là sꢀ ra đꢁi cꢂa các thuốc mꢃi và các

́

̀ đai thao đương đa

́ ́ ̀

̃

́

ꢄng dụng trong điꢅu tr.ꢆCác thuốc điê

dụng đã cho thấy những hiꢇu quả nhất đꢆn.hTuy nhiên, hiêu

trong viêc ngăn ngưa cac biên chưng cua đái tháo đưꢁng thông qua

̀

u triđ

̣

ái tháo đưꢁng đang đươc

̣

sư

̉

̣

qua lâu dai

̉

̀

̣

́

̉

̀

́

̉

̃

kiêm soat glucose máuvân còn hạn chế, đô

̀

ng thơi nhưng phan ưng bâ

́

t

́

̀

̃

̉

́

lơi

̣

khi sư dun

̣

g thuô

́

c vân

̃

là một vấn đꢅ đáng lưu ý. Do đo, môt

̣

trong

̉

́

nhưng mô

́

i quan tâm hang đâ

̀

u cua cac nha khoa hoc

̣

hiên

trên sư

u tri đai thao đươn,g

̣

Từ hưꢃng nghiên cꢄu đó,

̣

nay la viêc

̣

kham pha

́ ́

̣

̃

̀

̉

́

̀

tꢈm ra những thuốc mꢃi điꢅu trꢆ đái tháo đưꢁng dưa

các đꢉch tác dụng mꢃi, nhăm nâng cao hiêu qua điê

đông thơi giam đươc nhưng phan ưng bât lơ.i

̣

̀

̣

̀

̣

́

̉

́

̀

̣

́

̉

̃

̉

̀

́

đã có nhiꢅu loại thảo dược được nghiên cꢄu và chꢄng minh tác dụng hạ

glucose máu như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh.

Cây Chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) được biết đến như một loại

thꢀc phẩm và cũng là một vꢆ thuốc. Theo kinh nghiꢇm dân gian cꢂa

đồng bào dân tộc thiểu số phꢉa Bắc Viꢇt Nam và một số quốc gia trên

thế giꢃi, phần thân chuối ép lấy nưꢃc uống để điꢅu trꢆ đái tháo đưꢁng,

kết quả hạ glucose máu. Tuy nhiên, cho đến thꢁi điểm này chưa có tài

liꢇu khoa học nào cꢂa Viꢇt Nam nghiên cꢄu vꢅ tác dụng sinh học cꢂa

thân cây chuối tiêu. Hiꢇn nay, trên thế giꢃi có một vài nghiên cꢄu vꢅ tác

dụng điꢅu trꢆ đái tháo đưꢁng cꢂa thân cây chuối tiêu nhưng chỉ mꢃi ở

mꢄc độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất, chưa có một nghiên cꢄu có

hꢇ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác dụng hạ glucose

máu cꢂa dược liꢇu này. Để có những bằng chꢄng khoa học vꢅ tác dụng

và cơ chế tác dụng cꢂa thân cây chuối tiêu trong điꢅu trꢆ đái tháo đưꢁng

luận án tiến hành đꢅ tài “Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose

máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên

thực nghiệm” vꢃi 2 mục tiêu.

1. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần từ

dịch ép thân cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm.

2. Nghiên cứu cơ chế hạ glucose máu của cắn toàn phần và

một số chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG

Trong phần đại cương vꢅ bꢇnh đái tháo đưꢁng, luận án đã

̉

trình bày các nội dung: đꢆnh nghĩa, dꢆch tễ, phân loại, tiêu chuân

̉

chân đoan, cơ chế bꢇnh sinh cꢂa bꢇnh đái tháo đưꢁng .

́

1.2. CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU

Tăng glucose máu mạn tꢉnh là đặc trưng cơ bản cꢂa bꢇnh đái

tháo đưꢁng , gây ra các biến chꢄng nguy hiểm. Vꢈ vậy hầu hết các

thuốc điꢅu trꢆ bꢇnh đái tháo đưꢁng đꢅu nhằm mục đꢉch làm hạ

glucose máu vꢃi các cơ chế khác nhau. Nhꢈn chung, cơ chế hạ

glucose máu rất phong phú. Mỗi thuốc có thể tác động theo một

hoặc nhiꢅu cơ chế khác nhau. Luận án đã trꢈnh bày một số cơ chế hạ

glucose máu đã được áp dụng trong điꢅu trꢆ hoặc trong các nghiên

cꢄu thꢀc nghiꢇm như:

Tăng cưꢁng số lượng insulin thông qua ꢄc chế kênh K_ATP,

tăng nồng độ calci nội bào, kꢉch thꢉch tiểu đảo tụy sản xuất insulin

và thông qua các incretin, một số hormon nguồn gốc từ ruột tăng tiết

insulin.

Tăng cưꢁng nhạy cảm cꢂa mô đꢉch vꢃi insulin thông qua

̣

viꢇc hoạt hóa AMPK, tăng gia nhâp glucose vao cơ , giảm tân tạo

̀

̉

glucose ơ gan , tăng hoat đông cua ty thê ... gây ha glucose máu .

̣

̉

Thông qua receptor PPAR là kꢉch thꢉch biꢇt hoá tế bào mỡ, kꢉch

thích các enzym và protein vận chuyển cꢂa tế bào mỡ, làm tăng nhạy

cảm vꢃi insulin ở mô đꢉch . Thông qua quá trꢈnh truyꢅn tꢉn hiꢇu cꢂa

insulin ở tế bào đꢉch tác động vào nguyên nhân gây kháng insulin

Tác dụng điꢅu hòa, chuyển hóa tương tꢀ như insulin thông

qua ꢄc chế G6Pase và thông qua hoạt hóa GLUT4.

Ức chế tiêu hóa carbohydrat thông qua ꢄc chế enzym α-

amylase và α-glucosidase làm hạ glucose máu sau ăn.

2

1.3. CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU

THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƢỜNG

Luận án đꢅ cập tꢃi mô hꢈnh thꢀc nghiꢇm in vivo và in vitro.

Mô hꢈnh thꢀc nghiꢇm in vivo luận án trꢈnh bày các mô hꢈnh

gây bꢇnh đái tháo đưꢁng typ 1 và typ 2. Trong đó mô hꢈnh gây bꢇnh

đái tháo đưꢁng typ 1 bao gồm các phương pháp: Đái tháo đưꢁng typ

1 do di truyꢅn, cắt bỏ tuyến tụy, nhiễm virus, sử dụng hóa chất

(Streptozocin, Alloxan liꢅu cao). Mô hꢈnh gây bꢇnh đái tháo đưꢁng

typ 2 gồm các phương pháp: gây đái tháo đưꢁng typ 2 do đột biến

gen, chế độ ăn nhiꢅu carbohydrat, sử dụng hóa chất (Streptozocin

liꢅu thấp, Streptozocin kết hợp vꢃi nicotinamid, kết hợp STZ liꢅu

thấp và chế độ ăn giàu chất béo)

Mô hình thꢀc nghiꢇm in vitro bao gồm: Đánh giá tác động

lên hoạt tính cꢂa các enzym tiêu hóa và chuyển hóa glucid. Đánh giá

khả năng bài tiết insulin cꢂa tế bào β đảo tụy (trên đảo tụy cô lập

hoặc tế bào β đảo tụy, trên khả năng chết theo chương trꢈnh hoặc sꢀ

sinh sản, thay đổi kꢉch thưꢃc tế bào β). Đánh giá mꢄc độ nhạy cảm

cꢂa mô đꢉch vꢃi insulin (thông qua mꢄc độ mꢄc độ biểu hiꢇn cꢂa các

protein có vai trò quan trọng trong hoạt động cꢂa insulin như IRS-1,

Akt, GSK3, AMPK, PPAR, GLUT4 trên các dòng tế bào cơ xương

và tế bào mô mỡ). Đánh giá thông qua ꢄc chế PTP1B, GSK-3α giảm

kháng insulin trong con đưꢁng truyꢅn tín hiꢇu cꢂa insulin.

1.4. CÂY CHUỐI TIÊU

Phần tổng quan vꢅ cây chuối tiêu, luận án trꢈnh bày các nội

dung vꢅ: vꢆ trꢉ phân loại và đặc điểm thꢀc vật, tên khoa học, bộ phận

dùng, các nghiên cꢄu vꢅ thành phần hóa học và tác dụng dược lý cꢂa

cây chuối tiêu đặc biꢇt là các nghiên cꢄu vꢅ tác dụng hạ glucose máu

liên quan đến đái tháo đưꢁng cꢂa thân cây chuối tiêu.

Mặc dù đã có một số nghiên cꢄu bưꢃc đầu chꢄng minh tác

dụng hạ glucose máu cꢂa thân cây chuối tiêu trên chuột thꢀc nghiꢇm

nhưng chưa có nghiên cꢄu nào đi vào tꢈm hiểu cơ chế hạ glucose

máu cũng như tác động trên chuyển hóa cꢂa bộ phận dùng này.

3

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Dƣợc liệu nghiên cứu: Thân giả cây chuối tiêu (Musa x

paradisiaca L.) thống nhất gọi thân cây chuối tiêu.

2.1.2. Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt và chuột cống trắng

2.1.3. Các dòng tế bào: Tế bào cơ vân chuột nhắt (C₂C₁₂) và tế bào

mô mỡ chuột nhắt (3T3-L1).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp điều chế mẫu nghiên cứu

- Điều chế cắn toàn phần: Thân cây chuối tiêu ép lấy dꢆch,

cất quay chân không thu cắn, sấy áp xuất giảm, thu cắn toàn phần.

- Điều chế cắn phân đoạn: Dꢆch ép toàn phần được lắc vꢃi

các dung môi hữu cơ (n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol,

cắn nưꢃc còn lại), sấy áp xuất giảm thu được cắn phân đoạn.

Cắn toàn phần và cắn phân đoạn được pha trong dung môi

NaCMC 0,5% thành hỗn dꢆch. Sử dụng liꢅu 1000mg/kg chuột nhắt

và 500mg/kg chuột cống. Thꢉ nghiꢇm in vitro phụ thuộc mô hình

thꢀc nghiꢇm để sử dụng các dung môi pha mẫu thử cho thꢉch hợp.

2.3.2. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên chuột thực nghiệm

- Trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm

bởi Streptozocin (STZ) liều 150 mg/kg

+ Đánh giá tác dụng của cắn toàn phần: Chuột nhắt thí

nghiꢇm gây tăng glucose máu bằng cách tiêm màng bụng STZ liꢅu

150 mg/kg. Sau 72 giꢁ, chọn các chuột có glucose máu trên 11,0

mmol/L chia thành 4 lô (chꢄng bꢇnh, gliclazid, metformin, mẫu

thử), song song tiến hành thí nghiꢇm vꢃi 1 lô chuột bꢈnh thưꢁng.

Chuột được uống mẫu thử liên tục 15 ngày. Ngày thꢄ 16 chuột nhꢆn

đói 10h, thu máu toàn phần để đꢆnh lượng glucose, insulin huyết

thanh, xác đꢆnh hoạt độ G6Pase.

- Trên chuột cống đái tháo đƣờng typ 2 thực nghiệm

+ Mô hình gây bệnh đái tháo đường typ 2 thực nghiệm:

chuột cống trắng, được nuôi bằng chế độ ăn 60% tổng số calo cꢂa

khẩu phần ăn là chất béo. Sau 60 ngày tiêm màng bụng STZ vꢃi liꢅu

4

50 mg/kg. Sau 72 giꢁ đꢆnh lượng glucose máu lúc đói cꢂa chuột.

Chọn những chuột có glucose máu trên 11 mmol/L để làm thꢉ

nghiꢇm

+ Đánh giá tác dụng của cắn toàn phần: Chuột đái tháo

đưꢁng typ 2 được chia thành 3 lô (chꢄng bꢇnh, chꢄng dương, mẫu

thử) lô chuột bꢈnh thưꢁng uống dung môi pha hỗn dꢆch thử. Ngày

thꢄ 16, chuột nhꢆn đói 10h, đꢆnh lượng glucose, insulin huyết thanh,

triglycerid (TG), cholesterol toàn phần (Cho TP), hoạt độ G6Pase

gan, tình trạng đại thể và vi thể cꢂa tụy.

- Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống đái

tháo đƣờng typ 2 thực nghiệm

Chuột đái tháo đưꢁng typ 2 uống mẫu thử 15 ngày, cho

chuột nhꢆn đói 10 giꢁ, sau đó cho uống dung dꢆch glucose 3 g/kg thể

trọng. Đꢆnh lượng glucose máu sau khi uống dung dꢆch glucose ở

các thꢁi điểm 0 phút; 30, 60, 90 và 120 phút.

- Đánh giá tác dụng của cắn phân đoạn: Tiến hành trên

chuột tiêm STZ liꢅu 150 mg/kg để tꢈm ra phân đoạn có tác dụng hạ

glucose máu chiếm ưu thế. Sau đó chọn phân đoạn này thử nghiꢇm

trên chuột đái tháo đưꢁng typ 2 thꢀc nghiꢇm. Từ đó lꢀa chọn phân

đoạn phân lập chất đꢆnh hưꢃng điꢅu trꢆ đái tháo đưꢁng.

2.3.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh trong thực nghiệm in vivo

Đꢆnh lượng glucose máu, insulin, cholesterol toàn phần,

triglycerid huyết thanh, xác đꢆnh hoạt độ enzym G6Pase.

2.3.4. Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học

Nguyên tắc: Theo phương pháp nhuộm (HE) thưꢁng quy

nhân tế bào beta bắt màu xanh đen, bào tương bắt màu hồng.

2.3.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9)

́

- Nguyên tăc

G6Pase

 _{Glucose + phospho vô cơ (Pi)}

Glucose-6-phosphat + H₂O

2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế các enzym in vitro

- Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase

1B (PTP1B - EC 3.1.3.48)

Nguyên tắc: Dꢀa vào phản ꢄng loại bỏ nhóm phosphat ở

phân tử tyrosin đã được phosphoryl hóa (pTyr 1158) trong tiểu đơn

vꢆ beta cꢂa insulin receptor dưꢃi tác dụng cꢂa PTP1B. Phần phospho

5

tꢀ do (Pi) tạo ra từ phản ꢄng được đꢆnh lượng bằng phương pháp đo

quang ở bưꢃc sóng 595nm.

- Đánh giá khả năng ức chế α-amylase (EC 3.2.1.1)

Nguyên tắc: Dꢀa vào phản ꢄng thꢂy phân cơ chất là 2-

chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotriosid bởi enzym α-amylase tạo

thành 2-chloro-4-nitrophenol, phát hiꢇn màu cꢂa 2-chloro-4-

nitrophenol ở bưꢃc sóng 400 nm.

- Đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase (EC 3.2.1.20)

Nguyên tắc: Dꢀa vào phản ꢄng thꢂy phân cơ chất p-

nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) bởi α-glucosidase tạo ra

p-nitrophenol (PNP). Đꢆnh lượng p-nitrophenol/môi trưꢁng kiꢅm

bằng phương pháp đo quang ở bưꢃc sóng 405nm.

2.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng trên sự phosphoryl hóa AMPK và

IRS-1

Nguyên tắc: AMPK được hoạt hóa khi phosphoryl hóa gốc

Threonin 172 trên tiểu đơn vꢆ α cꢂa AMPK. Trong khi đó IRS-1 bꢆ

mất hoạt tꢉnh, từ đó làm gián đoạn chuỗi truyꢅn tꢉn hiꢇu nội bào cꢂa

insulin khi gốc Serin 307 trên protein này được phosphoryl hóa.

Đánh giá khả năng phosphoryl hóa AMPK và ꢄc chế sꢀ phosphoryl

hóa IRS-1 (Ser307) thông qua bán đꢆnh lượng p-AMPKα (Thr 172)

và p-IRS-1 (Ser 307) ở tế bào C₂C₁₂sau khi đã được ꢂ vꢃi các mẫu

thử bằng kĩ thuật Western Blot.

2.3.5. Đánh giá khả năng ức chế biệt hóa của TB mô mỡ 3T3-L1

Nguyên tắc: Tế bào 3T3-L1 trong môi trưꢁng nuôi cấy thꢉch

hợp sẽ biꢇt hóa để tạo thành các tế bào mô mỡ thông qua khả năng

tổng hợp triglycerid (TG). Lượng TG hòa tan trong dầu đỏ (Oil Red)

được đꢆnh lượng bằng phương pháp đo quang ở bưꢃc sóng 500nm.

2.3.7. Phƣơng pháp nghiên cứu thành phần hóa học

Đꢆnh tꢉnh các nhóm chất hóa học bằng các phản ꢄng hoá học

thưꢁng quy, phân lập chất từ 2 phân đoạn có tác dụng hạ glucose

máu chiếm ưu thế bằng sắc ký cột ở pha thưꢁng và pha đảo. Xác

đꢆnh cấu trúc thông qua nhiꢇt độ nóng chảy, dữ liꢇu các phổ...

2.3.8. Xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưꢃi dạng X_tb±SD (giá trꢆ trung

bꢈnh cꢂa từng lô và độ lꢇch chuẩn). Xử lꢉ số liꢇu bằng phần mꢅm

SPSS 16 và Microft Excel 2007, Graphpad Prism 7.03,

Wolframalpha, Image J, khác biꢇt khi p < 0,05.

6

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU

TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

3.1.1. Kết quả tác dụng hạ của cắn toàn phần

3.1.1.1. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột

tiêm STZ liều 150mg/kg

Sau 15 ngày uống mẫu thử, mꢄc hạ glucose máu cꢂa các lô

chuột thꢉ nghiꢇm so vꢃi ngày đầu tiên được trꢈnh bày tại hình 3.1

Hình 3.1. Mức hạ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm tiêm

STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử

Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, mꢄc hạ glucose máu cꢂa lô

chuột uống hỗn dꢆch cắn toàn phần khác biꢇt (p < 0,01) so vꢃi lô

chꢄng bꢇnh.

3.1.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần trên nồng độ glucose máu

của chuột đái tháo đƣờng typ 2

Sꢀ thay đổi nồng độ glucose máu cꢂa các lô chuột đái tháo

đưꢁng typ 2 sau 15 ngày điꢅu trꢆ được thể hiꢇn ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của chuột cống đái tháo đường

typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

Glucose máu (mmol/L)

Lô chuột

Mẫu thử

Ngày 1

Ngày 16

5,88  0,94^***

18,95  2,48

19,18  1,97

19,07  2,17

5,69  0,88^***

18,75  2,00

9,01  1,37^**

14,02  1,66^*

Lô 1 (chꢄng sinh lý)

Lô 2 (chꢄng bꢇnh)

Lô 3 (chꢄng dương)

Lô 4 (Thử)

DM pha hỗn dꢆch thử

Metformin

Cắn TP

7

Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, nồng độ glucose máu cꢂa lô 3

giảm khác so vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p < 0,05). Kết quả mꢄc hạ glucose

máu cꢂa các lô chuột thử nghiꢇm sau 15 ngày uống mẫu thử được

thể hiꢇn trên hꢈnh 3.2.

Hình 3.2. Mức hạ glucose máu của các lô chuột đái tháo đường

typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

Nhận xét: lô chuột uống hỗn dꢆch cắn toàn phần có mꢄc hạ glucose

máu khác so vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p<0,05)

3.1.1.3. Tác dụng của cắn toàn phần trên khả năng dung nạp

glucose của chuột cống đái tháo đƣờng typ 2

Đồ thꢆ biểu diễn nồng độ glucose máu cꢂa các lô chuột đái

tháo đưꢁng typ 2 trong test dung nạp glucose bằng đưꢁng uống được

thể hiꢇn trong hình 3.3.

Hình 3.3. sự thay đổi nồng độ glucose máu của các lô chuột đái

tháo đường typ 2 thực nghiệm trong test dung nạp glucose

8

Nhận xét: glucose máu cꢂa các lô chuột uống metformin và cắn toàn

phần tăng khác so vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p<0,01 và p<0,05). Sꢀ tồn lưu

glucose trong máu cꢂa chuột được đánh giá bằng diꢇn tꢉch dưꢃi

đưꢁng cong (AUC), kết quả được thể hiꢇn trong hꢈnh 3.4.

Hình 3.4. Sự tồn lưu glucose trong máu của chuột cống đái tháo

đường typ 2

Nhận xét: AUC glucose cꢂa lô 3 và lô 4 (uống metformin và

cắn toàn phần), giảm khác biꢇt so vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p<0,01 và 0,05)

3.1.2. Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn

3.1.2.1. Tác dụng của cắn phân đoạn trên glucose máu của chuột

tiêm STZ liều 150mg/kg

Mꢄc hạ glucose máu cꢂa các lô chuột thꢉ nghiꢇm sau 15

ngày uống hỗn dꢆch cắn các phân đoạn, cắn toàn phần và metformin

được thể hiꢇn trong hꢈnh 3.5.

Hình 3.5. Mức hạ glucose máu của các lô chuột tiêm STZ 150

mg/kg sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn các phân đoạn

9

Nhận xét: trong các phân đoạn dꢆch chiết, chỉ có lô 5 và lô 6 (uống

cắn phân đoạn ethylacetat và phân đoạn n-buthanol) có mꢄc hạ

glucose khác biꢇt có ý nghĩa thống kê so vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p<0,01)

3.1.2.2. Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn ethylacetat và n-

butanol trên chuột đái tháo đƣờng typ 2.

Sau 15 ngày uống cắn ethylacetat và n-butanol, mꢄc hạ

glucose máu cꢂa các lô chuột được thể hiꢇn trong hꢈnh 3.6.

Hình 3.6. Mức hạ glucose máu của các lô chuột đái tháo đường

typ 2 sau 15 ngày uống cắn phân đoạn n-butanol và ethylacetat

Nhận xét: mꢄc hạ glucose máu ở cả 2 lô chuột uống cắn PĐ

ethylacetat và n-butanol khác (p<0,01) so vꢃi lô chꢄng bꢇnh.

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.2.1. Định tính các nhóm chất

Thân cây chuối tiêu có chꢄa các hợp chất tanin, sterol,

đưꢁng khử và acid hữu cơ. Phân đoạn ethylacetat có tannin, sterol,

acid hữu cơ và phân đoạn n-butanol có sterol, đưꢁng khử.

3.2.2. Kết quả phân lập chất

Phân đoạn ethylacetat và n-butanol phân lập được 6 chất là:

cycloeucalenon, acid procatechuic, acid myristic, daucosterol, β-

sitosterol và bis-(2-ethyl hexyl hexanoat).

3.3. KẾT QUẢ CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU

3.3.1. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vivo

3.3.1.1. Kết quả nồng độ insulin huyết thanh

10

- Trên chuột tiêm tiêm STZ liều 150mg/kg: sau 15 ngày

uống mẫu thử, đꢆnh lượng insulin huyết thanh, tꢉnh chỉ số kháng

insulin và chꢄc năng tế bào beta cꢂa chuột thể hiꢇn trong bảng 3.12.

Bảng 3.12. Nồng độ insulin huyết thanh của các lô chuột tiêm

STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

Mẫu thử

Insulin

(ng/mL)

IR

18,984,02 617,3724,35

13,523,55 29,813,64

13,373,20 198,3818.11

%β

Lô

1,440,13^**

Lô 1 (Chꢄng DM pha HD

sinh lý) thử

Lô 2 (Chꢄng DM pha HD

0,41±0,06

0,84±0,08^*

0,45±0,07

0,43±0,07

bꢇnh,)

Lô 3 (Chꢄng

dương)

Lô 4 (Chꢄng

dương)

thử

Gliclazid

Metformin

7,372,62

101,176,38

96,307,57

Cắn TP

Lô 5 (Thử)

706,252,59

Trong đó %β là chức năng tế bào β, IR là chỉ số kháng insulin

Nhận xét: hai lô chuột uống metformin và cắn toàn phần có

nồng độ insulin huyết thanh, chꢄc năng tế bào β không khác biꢇt so

vꢃi lô chꢄng bꢇnh. Lô chuột uống gliclazid có nồng độ insulin và

chꢄc năng tế bào β cao khác biꢇt vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p<0,05)

- Trên chuột đái tháo đường typ 2: Sau 15 ngày uống mẫu

thử, đꢆnh lượng insulin huyết thanh, chỉ số kháng insulin và chꢄc

năng tế bào beta cꢂa chuột, kết quả được trꢈnh bày trong bảng 3.15.

Bảng 3.15. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống đái tháo

đường typ 2 sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn toàn phần

Lô

Mẫu

Insulin HT

IR

%β

thử

(ng/ml)

Ngày

1

Ngày

16

Ngày

1

Ngày

16

Ngày

1

Ngày

16

Lô 1

DM pha 0,73±

0,20

DM HD 1,39±

pha thử 0,23

Metform 1,41±

0,29

0,78±

0,10^*

1,42±

0,17

1,38±

0,19

9,64±

2,50

10,03 269,52 278,13

±3,01 ±15,15 ±15,54

(sinh lý) HD thử

Lô 2

(bꢇnh)

Lô 3

(dương) in

Lô 4

(thử)

59,03± 49,46 74,12± 75,64±

6,91

56,8±

7,43

±6,51

28,15 68,13± 204,15

±3,07 9,08 ±13,23

73,1± 103,42

7,68 ±9,36

9,41

9,62

Cắn toàn 1,32± 1,35±0, 60,78± 43,00

phần 0,14 14 7,22 ±6,53

11

Nhận xét: sau 15 ngày uống metformin và hỗn dꢆch cắn toàn phần

có sꢀ khác biꢇt vꢅ chꢄc năng tế bào β và chỉ số kháng insulin so vꢃi

lô chꢄng bꢇnh (p<0,01 và p<0,05) .

3.3.1.2. Tình trạng mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột đái tháo

đƣờng typ 2

Ảnh hưởng cꢂa mẫu thử đến tꢈnh trạng mô tụy cꢂa chuột đái

tháo đưꢁng typ 2, kết quả được thể hiꢇn ở hꢈnh 3.13

1.Chꢄng sinh lý

2. Chꢄng bꢇnh

T

B

4. Thử

3.Chꢄng dương (metformin)

B

Hình 3.13. Mô bệnh học tụy của các lô chuột đái tháo đường typ 2

sau 15 ngày uống mẫu thử (nhuộm HE x 400 lần)

B: tế bào beta; T: dấu hiệu thoái hóa

Nhận xét: kết quả cho thấy ở lô chꢄng bꢇnh (lô 2), mật độ tiểu đảo

tụy giảm, đảo tụy biến dạng, teo lại và giảm vꢅ kꢉch thưꢃc, tế bào

tiểu đảo tụy giảm vꢅ số lượng, có dấu hiꢇu thoái hóa hốc.

3.3.1.3. Kết quả nồng độ lipid huyết thanh

Mꢄc hạ nồng độ Cho TP và TG cꢂa các lô chuột sau 15 ngày

uống mẫu thử được thể hiꢇn trong hꢈnh 3.14

12

Hình 3.14. Phần trăm hạ lipid máu của các lô chuột thí nghiệm

^*: p<0,01 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: ở lô chuột uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và lô

chuột uống metformin có mꢄc hạ Cho TP và TG khác biꢇt so vꢃi lô

chꢄng bꢇnh (p<0,01).

3.3.1.4. Kết quả trên hoạt độ enzym G6Pase gan

- Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột tăng glucose máu

bằng STZ liều 150mg/kg

Để đánh giá tác dụng cꢂa cắn toàn phần thân cây chuối tiêu

trên sꢀ tổng hợp glucose nội sinh, tiến hành đánh giá ảnh hưởng cꢂa

mẫu thử trên hoạt độ enzym G6Pase ở gan chuột cꢂa các lô thꢉ

nghiꢇm, kết quả được trꢈnh bày ở bảng 3.17.

̣

Bảng 3.17. Hoạt độ G6Pase gan của các lô chuôt tiêm STZ 150

mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử

Hoạt độ riêng

% hoạt

độ enzym chế

% ức

Lô

Mẫu thử

(µgPi/phút/mg

protein)

0,54±0,14^*

Lô 1 (Sinh lý) DM pha HD

100%

Lô 2 (Bꢇnh )

Lô 3 (Dương)

Lô 4 (Dương)

Lô 5 (Thử)

DM pha HD

Gliclazid

Metformin

Cắn TP

0,81±0,17

150,00%

0,56±0,15^*

0,55±0,16^*

103,70 % 46,30

101,85%

105,56%

48,15

44,44

0,57±0,16^*

Nhận xét: các lô uống mẫu thử và chꢄng dương, làm giảm hoạt độ

G6Pase có ý nghĩa thống kê so vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p < 0,05).

- Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột đái tháo đường typ 2

13

Chuột đái tháo đưꢁng typ 2 sau khi uống mẫu thử trong 15

ngày, xác đꢆnh hoạt độ G6Pase gan, kết qꢂa được thể hiꢇn trong

bảng 3.18.

Bảng 3.18. Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột đái tháo đường

typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử

Hoạt độ riêng

% hoạt

độ

enzym

%

ức

chế

enzym G6Pase

(µgPi/phút/mg

protein)

1,98±0,59^*

3,01±0,87

2,03±0,77^*

2,20±0,73^*

Lô

Mẫu thử

Lô 1 (sinh lý,

DM pha HD thử

100%

Lô 2 (chꢄng bꢇnh)

DM pha HD thử

152,02%

103%

Lô 3 (chꢄng dương) Metformin

Lô 4 (Thử, ) Cắn toàn TP

49,02

111,11% 40,91

*: p < 0,05 so với lô chứng bệnh

Nhận xét: hoạt độ enzym G6Pase gan ở lô uống hỗn dꢆch cắn toàn

phần và metformin giảm có ý nghĩa so vꢃi lô chꢄng bꢇnh (p < 0,05).

3.2.2. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vitro

3.2.2.1.Tác dụng ức chế enzym α-amylase của cắn toàn phần và

các chất phân lập

Khả năng ꢄc chế hoạt tꢉnh cꢂa enzym α-amylase cꢂa cắn

toàn phần và các chất phân lập, được trꢈnh bày trong bảng 3.20

Bảng 3.20. Khả năng ức chế enzym α-amylasecủa cắn toàn phần

và các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

Chất phân lập

Tên chất

Khả năng ức chế (%)

5µM

10µM

25µM

Cắn TP (5,10,30µg/ml) (-)

Cycloeucalenon

Acid myristic

-

Bis(2-ethylhexyl) hexanoat

β-sitosterol

16,34±1,47 23,38±0,9

51,95±0,85

Acid protocatechuic

Daucosterol

-

Acarbose*

29,77±4,45 37,64± 2,17 55,22±1,5

(-): không có tác dụng ;

*: chứng dương

14

Nhận xét: Chỉ có β-sitosterol có tác dụng ꢄc chế enzym α-amylase

vꢃi các mꢄc liꢅu khác nhau vꢃi IC₅₀là 20,37µM.

3.2.2.2.Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cắn toàn phần

và các chất phân lập

Khả năng ꢄc chế hoạt tꢉnh cꢂa enzym α-glucosidase cꢂa cắn

toàn phần và các chất phân lập, được trꢈnh bày trong bảng 3.23

Bảng 3.23. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của cắn toàn

phần và các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

Cắn toàn phần

Khả năng ức chế

(%)

Chất phân lập

Tên chất

Khả năng ức chế (%)

5µg/ml

14,03±

3,03

5µM

10µM

25µM

10µg/ml 25,07±

Cycloeucalenon

Acid myristic

0,4

30µg/ml 75,09±

3,53

-

Bis(2-ethylhexyl)

hexanoat

24,56± 33,73± 52,19±

β-sitosterol

2,67

1,14

1,40

Acid

protocatechuic

-

19,14± 28,25± 70,38±

2,39 0,83 2,41

34,68± 39,07± 53,2±

1,83 1,38 0,46

Daucosterol

Acarbose*

(-): không có tác dụng ;

*: chứng dương

Nhận xét: cắn toàn phần thân cây chuối tiêu thể hiꢇn khả năng ꢄc

chế enzym α-glucosidase ở nồng độ 10 và 30µg/ml là 25,07 và

75,09%. Trong 6 chất phân lập, chỉ có daucosterol và β-sitosterol có

tác dụng ꢄc chế enzym α-amylase vꢃi IC₅₀là 17,43 và 22,6µM.

3.2.2.3.Tác dụng ức chế PTP1B của cắn toàn phần và các chất

phân lập

Khả năng ꢄc chế PTP1B cꢂa cắn toàn phần và các chất phân

lập, được trꢈnh bày trong bảng 3.25

15

Bảng 3.25. Khả năng ức PTP1B của cắn toàn phần các

chất phân lập từ thân cây chuối tiêu

Cắn toàn phần

Chất phân lập

Khả năng ức chế

Tên chất

(%)

Khả năng ức chế (%)

5µg/ml

17±77

0,23

5µM

10µM 25µM

10µg/ml 34,61±

0,81

30µg/ml 46,53±

1,09

61,16±

1,24

34,20±

1,08

72,39± 83,97±

Cycloeucalenon

Acid myristic

0,78

0,83

47,6±

0,35

69,86±

1,13

Bis(2-ethylhexyl)

hexanoat

β-sitosterol

Acid

-

protocatechuic

Daucosterol

-

51,83± 78,62±

Suramin*

28,18±0,43 0,31

0,58

(-): không có tác dụng ;

*: chứng dương

Nhận xét: cắn toàn phần thân cây chuối tiêu thể hiꢇn khả năng ꢄc

chế enzym α-glucosidase ở nồng độ 10 và 30µg/ml là 34,46 và

46,53%. Trong 6 chất phân lập, có cycloeucalenon và acid myristic

có tác dụng ꢄc chế PTP1B vꢃi IC₅₀là 3,11và 10,75µM.

3.3.2.4. Tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS1(Ser307) trên tế

bào cơ vân chuột nhắt C₂C₁₂

- Tác dụng của cắn toàn phần

Tiến hành thử vꢃi 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ lặp lại

thꢉ nghiꢇm 3 lần, kết quả được thể hiꢇn trong hꢈnh 3.17

Cắn toàn phần (µg/ml)

Chứng

12,5

25

50

p-IRS-1

(Ser307)

β-actin

Hình 3.17. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307

16

Mật độ ánh sáng cꢂa các dải protein được phân tꢉch bằng

phần mꢅm ImageJ, kết quả được trꢈnh bày tại hình 3.18.

Hình 3.18. So sánh lượng p-IRS-1(Ser307) giữa các lô ủ với cắn

toàn phần ở các nồng độ khác nhau

Nhận xét: Mꢄc độ biểu hiꢇn cꢂa β-actin không thay đổi cả 3 nồng

độ thử (12,5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml) đꢅu không làm giảm lượng

p-IRS-1(Ser307) có ý nghĩa thống kê so vꢃi lô chꢄng (p > 0,05).

- Tác dụng của hai chất phân lập là cycloeucalenon và

daucosterol

Tế bào C₂C₁₂đã được biꢇt hóa, sau khi ꢂ vꢃi các mẫu thử

trong 1 giꢁ, được thu protein, chạy điꢇn di và phân tꢉch Western

Blot theo quy trình mô tả ở phần 2.3.7, kết quả được trꢈnh bày tại

hình 3.19

Chứng

H1₂₅

H1₅₀

H2₂₅

H2₅₀

p-IRS-1

(Ser307)

β-actin

Hình 3.19. Ảnh hưởng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol

(H2) ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl

hóa ở Ser307

17

Mật độ ánh sáng cꢂa các dải protein được phân tꢉch bằng

phần mꢅm Image J. Kết quả được trꢈnh bày tại hꢈnh 3.20.

Hình 3.20. So sánh lượng p-IRS-1(Ser307) giữa các lô ủ với

cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau

Nhận xét: chỉ có nồng độ 50 µg/ml làm giảm lượng p-IRS-

1(Ser307) có ý nghĩa thống kê so vꢃi lô chꢄng âm (p<0,01).

3.3.2.5. Tác dụng hoạt hoá AMPK trên tế bào cơ vân chuột nhắt

C₂C₁₂

- Tác dụng của cắn toàn phần

+ Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của mẫu thử trên sự

phosphoryl hóa AMPK

Để đánh giá tác dụng phosphoryl hóa AMPKα (Thr172) cꢂa

cắn toàn phần thân cây chuối tiêu, tiến hành thử vꢃi 3 nồng độ khác

nhau, mỗi nồng độ lặp lại thꢉ nghiꢇm 3 lần.Kết quả được thể hiꢇn ở

hình 3.21.

Chứng

bệnh

Chứng

dƣơng

Cắn toàn phần (µg/ml)

12,5 25,0 50,0

p-AMPK

β actin

Hình 3.21. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau

trên lượng AMPKα phosphoryl hóa ở Thr172

18