Luận văn Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (Biofilm) ở Việt Nam
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Trần Thúy Hằng
PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO
MÀNG SINH VẬT (BIOFILM) Ở VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Trần Thúy Hằng
PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO
MÀNG SINH VẬT (BIOFILM) PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:
60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN QUANG HUY
Hà Nội - 2011
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.
Nguyễn Quang Huy, người thầy mẫu mực đã tận tụy hướng dẫn và truyền đạt kiến
thức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như luôn quan tâm, động viên
và giúp đỡ chúng tôi trong cuộc sống.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dành mọi tâm
huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho chúng tôi trong suốt khóa học này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh, chị, em trong Phòng
Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ Protein và Enzyme; Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Bộ môn Vi sinh vật
học đã nhiệt tình cộng tác và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đặc biệt là chồng
tôi đã luôn ở bên động viên, chia sẻ khó khăn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và
thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2011
Học viên cao học
Trần Thúy Hằng
Trường Đại học KHTN
i
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................2
1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm)................................................................2
1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật..................5
1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên..............5
1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật.................................................................7
1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật............................................8
1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật.......................................11
1.3.1 Mạng lưới ngoại bào.....................................................................................11
1.3.2 Các thành phần khác.....................................................................................13
1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của màng sinh vật ........15
1.4.1 Các giai đoạn tạo thành màng sinh vật..........................................................15
1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật................................20
1.4.3 Điều hòa quá trình hình thành màng sinh vật ................................................22
1.5 Nghiên cứu ứng dụng màng sinh vật................................................................24
1.5.1 Ứng dụng màng sinh vật trong việc xử lý nước thải......................................24
1.5.2 Ứng dụng màng sinh vật trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại................25
1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác ................................................................26
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................29
2.1 Nguyên liệu .....................................................................................................29
2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu........................................................................29
2.1.2 Vi sinh vật kiểm định....................................................................................29
2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm..........................................................30
2.2.1 Môi trường nuôi cấy .....................................................................................30
2.2.2 Máy móc, thiết bị..........................................................................................31
2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................31
2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn ....................................................................31
Trường Đại học KHTN
ii
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.......................................................32
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng
vi sinh vật..............................................................................................................32
2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật...................................................33
2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt...........................35
2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn...............................................35
2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram ...........................................................................36
2.3.8 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét
..............................................................................................................................37
2.3.9 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA...............................37
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................39
3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật......39
3.1.1 Phân lập vi sinh vật.......................................................................................39
3.1.2 Khả năng phát triển và tạo màng sinh vật của các chủng phân lập.................40
3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo màng sinh vật của các chủng phân lập..........42
3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................................................42
3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường .....................................................................43
3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon.......................................................................44
3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ............................................................................46
3.2.5 Ảnh hưởng của giá thể..................................................................................47
3.3 Một số đặc tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật phân lập ..............50
3.3.1 Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt.............................................................50
3.3.3 Đặc điểm hình thái........................................................................................53
3.3.4 Phân loại các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên gen 16S rDNA.................55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................60
PHỤ LỤC..............................................................................................................69
Trường Đại học KHTN
iii
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi
sinh vật phân lập....................................................................................................44
Bảng 2: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi
sinh vật phân lập....................................................................................................45
Bảng 3: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo màng sinh vật của các chủng vi
sinh vật phân lập....................................................................................................47
Bảng 4: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu......................52
Trường Đại học KHTN
iv
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông
qua mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ..............................................3
Hình 2. Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên.................4
Hình 3. Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis
B-1 ..........................................................................................................................5
Hình 4. Một số ví dụ về màng sinh vật ....................................................................8
Hình 5. Mô hình phát triển của màng sinh vật .......................................................16
Hình 6. Khuẩn lạc một số chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch..........39
Hình 7. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu
nước thải làng miến Lại Trạch...............................................................................40
Hình 8. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu
nước thải nhà máy sản xuất bia..............................................................................41
Hình 9. Khả năng tạo màng sinh vật của một số chủng vi sinh vật phân lập từ mẫu
nước thải làng nghề bún Phú Đô............................................................................42
Hình 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo màng sinh vật từ các chủng
phân lập.................................................................................................................43
Hình 11. Màng nổi của 4 chủng vi sinh vật sau 5 ngày nuôi cấy............................48
Hình 12. Màng sinh vật trên bề mặt nhựa ..............................................................48
Hình 13. Cấu trúc màng sinh vật của các chủng phân lập ......................................49
Hình 14. Khả năng nhũ tương hóa dầu ăn của các chủng vi sinh vật......................51
Hình 15. Hình thái khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học.54
Hình 16. Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn trong màng sinh vật........................55
Hình 17. Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các loài có quan hệ họ hàng
dựa vào trình tự gen 16S rDNA.............................................................................56
Hình 18. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ họ hàng
dựa vào trình tự gen 16S rDNA.............................................................................57
Trường Đại học KHTN
v
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
Acyl - HSL
COD
dd NTP
đvC
Acyl - homoserine lactone
Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học)
Dideoxynucleotide
đơn vị Cacbon
E24
Emulsion index (chỉ số nhũ tương hóa)
Optical Density (Mật độ quang học)
Sodium dodecyl sulfate
OD
SDS
SEM
TCA
TOC
w/v
Scanning electron microscopy
Tricarboxylic acid
Total Organic Carbon
Khối lượng (g)/thể tích (ml)
Trường Đại học KHTN
vi
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
MỞ ĐẦU
Nghiên cứu vi sinh vật học là mô hình nghiên cứu ưu việt để tìm hiểu bản
chất của các quá trình sống, đồng thời nó cũng đóng vai trò quan trọng trong các
lĩnh vực y học, nông nghiệp, công nghiệp và môi trường.
Tuy nhiên, trong tự nhiên vi sinh vật ít khi tồn tại dưới dạng các tế bào đơn
lẻ mà chúng thường được tìm thấy dưới dạng tập hợp các tế bào liên kết chặt chẽ
với nhau và với các bề mặt thông qua mạng lưới chất ngoại bào gọi là màng sinh vật
(biofilm).
Nghiên cứu về màng sinh vật giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát hơn về
sự tăng trưởng, phát triển và thích nghi của vi sinh vật trong mối quan hệ với nhau
cũng như với các điều kiện môi trường. Đồng thời, việc tìm hiểu về màng sinh vật
cũng giúp chúng ta có những hiểu biết sâu hơn về mối liên hệ bên trong của các tế
bào trong một màng sinh vật cũng như các cơ chế điều hòa quá trình tạo màng sinh
vật.
Nghiên cứu về màng sinh vật góp phần tạo ra những sản phẩm ứng dụng cao
trong cuộc sống như tạo các công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường, xử lý
các sự cố tràn dầu, ứng dụng trong nghiên cứu phòng bệnh cho cây trồng cũng như
các nghiên cứu trong công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm v.v… mà hiện nay tại
Việt Nam các nghiên cứu về vi sinh vật tạo màng sinh vật và ứng dụng của chúng
còn rất mới mẻ.
Chính từ những ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài:
“Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả
năng tạo màng sinh vật phân lập ở Việt Nam”.
Trường Đại học KHTN
1
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái niệm về màng sinh vật (biofilm)
Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ,
muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi. Vi sinh vật không phải là
một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật
khác nhau và giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau [1].
Lịch sử nghiên cứu và phát triển của vi sinh vật học đã ghi nhận người có
công phát hiện ra thế giới vi sinh vật và cũng là người đầu tiên mô tả hình thái nhiều
loại vi sinh vật - Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Với việc tự chế tạo ra
trên 400 chiếc kính hiển vi, ông đã lần lượt quan sát mọi thứ có xung quanh mình,
trong đó có cả các vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà ông đã gọi là những “động
vật vô cùng nhỏ bé”. Ông là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng bám dính và
phát triển phổ biến của vi khuẩn trên bề mặt răng tạo thành các mảng bám răng, một
dạng của màng sinh vật sau này [1].
Cùng với sự ra đời của kính hiển vi quang học hoàn chỉnh vào đầu thế kỷ 19,
đặc biệt là việc chế tạo thành công chiếc kính hiển vi điện tử đầu tiên (1934) đã góp
phần tạo nên những cống hiến lớn lao của các nhà khoa học trong lĩnh vực vi sinh
vật học [1]. Năm 1936, Zobell và cộng sự [87] đã nghiên cứu cho thấy số lượng vi
khuẩn bám dính tại vị trí tiếp xúc giữa nước biển và bề mặt vật rắn lớn hơn nhiều so
với các vị trí xung quanh. Lợi ích của bề mặt chất rắn mang lại được đánh giá như
một nơi cư trú của các vi khuẩn giúp tập trung hấp thụ chất dinh dưỡng, tăng cường
hoạt động của các enzyme và hấp thụ các chất chuyển hóa. Trong những nghiên cứu
về hiệu quả của bề mặt rắn đối với hoạt tính của vi khuẩn, Zobell [86] đã chỉ ra rằng
bên cạnh việc cung cấp nơi khu trú và tập trung chất dinh dưỡng, bề mặt chất rắn
còn làm chậm sự khuếch tán của các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sự đồng hóa các
chất dinh dưỡng thông qua quá trình thủy phân trước khi chúng được hấp thụ.
Một loạt những nghiên cứu tiếp theo đó cũng đề cập đến khả năng hoạt động
và tăng trưởng đáng kể của vi sinh vật bằng cách bám dính vào một bề mặt xác
Trường Đại học KHTN
2
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
định. Nghiên cứu của Heukelekian và cộng sự [39] cho thấy giới hạn nồng độ chất
dinh dưỡng không cố định mà phụ thuộc vào tổng diện tích bề mặt tiếp xúc với môi
trường.
Jones và cộng sự [43] đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để chỉ ra
sự xuất hiện của màng sinh vật trong bộ lọc nhỏ giọt của một nhà máy xử lý nước
thải và cho thấy rằng chúng bao gồm nhiều loại, nhóm các vi sinh vật khác nhau
(dựa trên đặc điểm hình thái tế bào). Bằng cách sử dụng chất nhuộm màu
polysaccarit đặc biệt là đỏ Ruthenimum và cố định bởi Osmium tetroxide (OsO4),
các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng vật liệu chất nền bao xung quanh và kết
dính các tế bào trong cấu trúc màng sinh vật chính là polysaccarit.
Hình 1. Các vi sinh vật gắn kết với bề mặt nhựa nhân tạo và liên kết với nhau thông qua
mạng lưới polysaccarit dưới kính hiển vi điện tử ( 57700) [43].
Dựa trên những quan sát ở mảng bám răng và một số thí nghiệm khác, năm
1978, Costerton và cộng sự [14] đã đưa ra giả thuyết về màng sinh học: “Trong tự
nhiên, các tế bào vi khuẩn gắn kết với nhau và bám dính trên một bề mặt nhất định
nhờ hệ thống sợi glycocalyx”. Giả thuyết này đã góp phần giải thích cơ chế bám
dính của vi sinh vật trên các vật liệu vô sinh và hữu sinh và những lợi ích thu được
nhờ phương thức sinh thái thích hợp này.
Trường Đại học KHTN
3
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng sinh
vật được đưa ra ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn. Hiện nay, khái niệm màng
sinh vật được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề
mặt các môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng
tạo ra [26], [56]. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt môi trường vô sinh
hay hữu sinh và là một hiện tượng phổ biến xuất hiện trong tự nhiên, trong đời sống
hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.
Hình 2. Ảnh SEM một màng sinh vật do Staphylococcus aureus tạo nên [26]
Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh vật khác biệt với các tế bào sống
trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với
nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trưởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các
gen đặc biệt nào đó. Khả năng bám dính của vi sinh vật là một quá trình phức tạp
được điều hòa bởi các đặc điểm khác nhau về môi trường nuôi cấy, chất nền ngoại
bào và bề mặt tế bào [57].
Vi khuẩn bắt đầu quá trình tạo màng sinh vật để đáp ứng với những tác động
cụ thể từ môi trường sống như nguồn chất dinh dưỡng và oxy. Quá trình tạo thành
màng sinh vật cũng trải qua các biến đổi động học trong việc chuyển từ đời sống tự
Trường Đại học KHTN
4
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
10 m
1 m
Hình 3. Ảnh SEM màng sinh vật nổi được hình thành bởi chủng Bacillus subtilis B-1 [57]
do sang dạng sống bám dính trong cấu trúc màng sinh vật, bao gồm cả việc sản xuất
các chất chuyển hóa thứ cấp và gia tăng các chất chống lại các tác nhân vật lý, hóa
học và sinh học gây hại [56].
1.2 Các dạng màng sinh vật trong tự nhiên và vai trò đối với vi sinh vật
1.2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật trong tự nhiên
Các vi sinh vật trong tự nhiên ít khi tồn tại riêng rẽ mà thường hình thành tập
hợp quần xã vi sinh vật với một loạt các hoạt động chức năng sinh lý và sinh hóa.
Sự tạo thành màng sinh vật diễn ra tại bề mặt rắn tiếp xúc với môi trường chất lỏng.
Tại đây, các mảnh vụn hữu cơ và chất khoáng tập trung lại tạo điều kiện cho phép
các vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển thành các vi khuẩn lạc và dần hình
thành nên màng sinh vật trưởng thành [13].
Phân tích thành phần vi sinh vật của màng cho thấy sự hiện diện của vi tảo
và vi khuẩn Gallionella spp. Đặc biệt khả năng oxi hóa sắt của chủng Gallionella
spp gây kết tủa sắt trong đường ống tạo ra những thay đổi không mong muốn về độ
đục, màu sắc và mùi của nước [58]. Các chủng vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas
putrefaciens, Escherichia coli, Bacillus sp, Serratia sp cũng được phân lập. Trong
Trường Đại học KHTN
5
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
đó, nghiên cứu cho thấy chủng P. putrefaciens có khả năng tạo chất ngoại bào giúp
gắn kết các nhóm vi sinh vật với nhau để hình thành màng sinh vật [66].
Trong công nghiệp thực phẩm, khả năng bám dính của các vi sinh vật trên bề
mặt các thiết bị chế biến có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến giá trị cảm quan của
sản phẩm thực phẩm. Nghiên cứu của Sule và cộng sự [78] cho thấy chủng E. coli
O157:H7 là tác nhân gây bệnh có thể phân lập từ các mẫu thịt tươi. Bằng kỹ thuật
Real-time PCR, 13 trong số 15 gen ở chủng E. coli này được nghiên cứu cho thấy
có liên quan đến các chức năng sống như trao đổi chất, phân chia tế bào, hình thành
màng sinh học và khả năng gây bệnh.
Nghiên cứu của Kubota và cộng sự [47] về khả năng hình thành màng sinh
vật trên 3 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis và
Lactobacillus fructivorans đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic gây hư hỏng thực
phẩm. Đặc điểm của sự hình thành màng sinh vật ở các chủng vi khuẩn này cung
cấp cho chúng ta một hướng nghiên cứu trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh
trong các sản phẩm thực phẩm.
Một trong những hướng nghiên cứu ứng dụng của màng sinh vật là kiểm soát
sinh học các tác nhân gây bệnh hại ở cây trồng. Các chủng vi khuẩn được phân lập
từ rễ cây hoặc đất trồng ở các khu vực canh tác nông nghiệp cũng cho thấy khả
năng hình thành màng sinh vật tương đối cao như: Bacillus subtilis, Agrobacterium
tumefaciens, Xylella fastidiosa, Rhizobium leguminosarum… Nghiên cứu của Fall
và cộng sự [30] cho thấy Bacillus subtilis bám dính ở rễ cây có khả năng hình thành
màng sinh vật tốt ở nồng độ K+ cao trong môi trường nuôi cấy. Bacillus subtilis
cũng có khả năng ức chế sự lây nhiễm của tác nhân gây bệnh Pseudomonas
syringae pv tomato DC3000 ở rễ cây Arabidopsis nhờ khả năng tạo thành màng
sinh vật và sản xuất surfactin [5]. Khả năng cộng sinh với mô thực vật cũng như sự
tạo thành màng sinh vật trên bề mặt chóp rễ của các chủng Agrobacterium
tumefaciens, Xylella fastidiosa [69] cho thấy sự tương tác cùng có lợi giữa thực vật
và vi khuẩn trong việc cung cấp chất dinh dưỡng và hạn chế các tác nhân gây bệnh.
Trường Đại học KHTN
6
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
Ngoài ra, một số chủng vi khuẩn được thu thập từ khu vực nước thải của các
nhà máy, làng nghề cũng được phân lập nhằm tìm ra những chủng có khả năng hình
thành màng sinh vật tốt, ứng dụng trong việc xử lý nước thải và vệ sinh môi trường.
1.2.2 Các dạng tồn tại của màng sinh vật
Trong tự nhiên, có thể bắt gặp và quan sát thấy màng sinh vật trong rất nhiều
môi trường khác nhau: từ môi trường tự nhiên như trên bề mặt của các viên đá nằm
dưới đáy sông suối, trên bề mặt nước của các hồ, ao tù đến các hệ thống nhân tạo
như vòi hoa sen, ống dẫn nước.
1.2.2.1 Trong môi trường tự nhiên
Môi trường nước trong các hồ, ao, sông, suối là điều kiện thuận lợi nhất cho
việc hình thành và phát triển một mạng lưới màng sinh vật. Màng sinh vật có thể
được tạo thành ngay trên bề mặt nước (khoảng tiếp xúc với không khí) để hình
thành nên dạng cấu trúc màng nổi (floating biofilm), có thể quan sát dưới dạng
những cặn hay váng của vi sinh vật trên mặt ao, hồ hay bể lọc nước.
Một dạng khác của màng sinh vật trong tự nhiên được tìm thấy là khi các vi
sinh vật bám dính trên bề mặt vật liệu rắn như các viên sỏi, đá trong nước tạo thành
dạng màng sinh vật bề mặt (hình 4a).
1.2.2.2 Trong các hệ thống thiết bị nhân tạo
Màng sinh vật cũng tồn tại trên bề mặt các thiết bị nhân tạo được cấu tạo chủ
yếu từ vật liệu vô sinh (nhựa, thủy tinh, thép …) như trên vỏ của tàu thuyền, trong
lòng các ống dẫn nước, ống dẫn dầu hay dẫn khí đốt, trên sàn các quầy hàng thực
phẩm.
Trong các thiết bị, đồ dùng gia đình cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật
khi các vi sinh vật bám dính trong hệ thống vòi hoa sen, bồn rửa mặt.
1.2.2.3 Trong cơ thể sinh vật sống
Ngay trong cơ thể sống con người cũng xuất hiện màng sinh vật chủ yếu là
của những loài vi sinh vật gây bệnh. Màng sinh vật có thể hình thành trên bề mặt
Trường Đại học KHTN
7
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
lớp tế bào biểu mô như biểu mô ống dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng hay trên
răng tạo thành cấu trúc màng sinh vật gọi là mảng bám răng (hình 4c). Thậm chí bề
mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể như van tim, niệu quản nhân tạo cũng
có thể là vị trí tồn tại của màng sinh vật.
(a)
(b)
(c)
Hình 4. Một số ví dụ về màng sinh vật
(a): Màng sinh vật trên tảng đá; (b): Màng sinh vật trên bề mặt bàn chải đánh răng;
(c): Màng sinh vật của vi khuẩn sâu răng hình thành nên mảng bám răng
1.2.3 Ảnh hưởng của màng sinh vật đối với vi sinh vật
Sự tạo thành màng sinh vật là một hiện tượng phổ biến trong đời sống của
các vi sinh vật và trở thành phương thức giúp chúng tồn tại và phát triển trong tự
nhiên.
1.2.3.1 Bảo vệ tế bào trước những bất lợi của môi trường
Mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật cung cấp nơi khu trú và một hằng số
nội môi thích hợp cho các vi khuẩn tồn tại. Nó đóng vai trò quan trọng trong cấu
trúc và chức năng của các màng sinh vật. Chất nền ngoại bào này cũng có khả năng
ngăn chặn sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn vào trong màng nhờ hoạt tính
trao đổi anion. Điều này cũng có nghĩa là nó sẽ làm hạn chế sự khuếch tán của một
số hợp chất từ môi trường xung quanh vào trong màng sinh vật [45].
Màng sinh vật của các chủng vi sinh vật tạo màng giúp chúng kháng lại các
tác nhân là các vi khuẩn, các chất kháng sinh hay chất sát trùng. Cơ chế bảo vệ của
màng sinh vật có thể là: ngăn chặn sự xâm nhập của các chất này vào trong màng
Trường Đại học KHTN
8
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
sinh vật; thay đổi tốc độ tăng trưởng của các vi sinh vật trong màng hay các biến đổi
chức năng sinh lý khác thông qua các phương thức tăng trưởng. Đặc tính này phần
lớn phụ thuộc vào tính chất của cả mạng lưới biofim và tác nhân kháng khuẩn và
thường thể hiện rõ với các chất kháng sinh thuộc nhóm ưa nước và tích điện dương
như các aminoglycoside [36].
Mạng lưới chất ngoại bào cũng được ghi nhận là có khả năng giúp tế bào
chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo
vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trường như sự thay đổi độ pH, bức xạ
tia cực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn [45]. Thành phần chính của màng sinh
vật chiếm tới 97% là nước. Khả năng giữ nước cao của mạng lưới ngoại bào thông
qua các liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo vệ màng chống lại sự khô hạn
trong môi trường tự nhiên. Quá trình hấp thụ các nguyên tố kim loại nặng được biết
đến do tác dụng của nhóm mang điện tích âm trong mạng lưới chất ngoại bào như
nhóm phosphate, lưu huỳnh, hay nhóm chức axit [56].
1.2.3.2 Thu nhận nguồn chất dinh dưỡng từ môi trường
Môi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh vật cung cấp phương tiện trao
đổi dinh dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn, tăng
cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất
có nguy cơ độc hại [23]. Các vi khuẩn trong mạng lưới màng sinh vật thường bao
gồm nhiều quần thể vi khuẩn khác nhau. Chúng là kết quả của mối liên hệ giữa các
loài sinh vật đồng trao đổi chất. Mối liên kết chặt chẽ này tạo điều kiện thuận lợi
cho sự trao đổi, loại bỏ và phân phối các sản phẩm trao đổi chất trung gian giữa các
loài.
Màng sinh vật cung cấp một môi trường lý tưởng cho sự thiết lập mối quan
hệ hợp dưỡng giữa các loài vi sinh vật. Hợp dưỡng là một trường hợp đặc biệt của
mối quan hệ cộng sinh, trong đó hai loài (hoặc hai chủng) vi sinh vật khác nhau phụ
thuộc lẫn nhau về mặt trao đổi chất để sử dụng một số cơ chất nhất định, đặc biệt là
cho các yêu cầu về năng lượng [31].
Trường Đại học KHTN
9
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
1.2.3.3 Thu nhận những đặc tính di truyền mới
Quá trình trao đổi gen (horizontal gene transfer) đóng vai trò quan trọng
trong sự tiến hóa và đa dạng di truyền của cộng đồng các vi sinh vật trong tự nhiên.
Trao đổi gen được biết đến là sự di chuyển vật liệu di truyền giữa các loài vi sinh
vật khác nhau. Hiện tượng này xảy ra trong vi khuẩn là cách kết hợp trực tiếp DNA
tự do của các tế bào vi khuẩn. Nhờ việc thu nhận những đặc tính di truyền mới giúp
cộng đồng vi sinh vật trong màng tiếp nhận được những gen cần thiết tham gia tích
cực trong hoạt động sống của màng sinh vật [45].
Tầm quan trọng của quá trình trao đổi gen đã được ứng dụng trong những
nghiên cứu về khả năng kháng thuốc của vi sinh vật, kỹ thuật di truyền tạo nên
chủng vi sinh vật mới trong các ngành công nghiệp. Trong đó cơ chế trao đổi gen
phổ biến ở vi sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp. Tuy nhiên
khi các vi khuẩn trong tự nhiên tồn tại dưới dạng màng sinh vật, liên kết với nhau
thông qua mạng lưới chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ
đó vi khuẩn trong màng sinh vật có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác
[26].
1.2.3.4 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài
Màng sinh vật được hình thành nhờ sự hợp tác cùng chung sống của nhiều
loài vi sinh vật tạo nên một quần xã vi sinh vật có cấu trúc không gian phức tạp. Do
đó, các loài sinh vật cùng tồn tại trong màng sinh vật thích nghi với những điều kiện
dinh dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong màng. Ngoài
ra, khả năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các vi sinh
vật tận dụng được tối đa nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hỗ trợ lẫn nhau
theo hướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất [4].
Mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong màng sinh vật cũng có tác động lớn
đến chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên. Sự phối hợp của nhiều
nhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải một hợp chất
hữu cơ và việc cùng cư trú trong màng sinh vật của các nhóm vi sinh vật sẽ góp
phần thúc đẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn [45].
Trường Đại học KHTN
10
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
1.3 Thành phần, cấu trúc và đặc điểm của màng sinh vật
Quá trình tạo màng sinh vật cần có sự tham gia của nhiều yếu tố để hình
thành nên cấu trúc đặc trưng của màng. Tỷ lệ và mức độ bám dính của tế bào vi
khuẩn vào một bề mặt phụ thuộc vào đặc tính kỵ nước của bề mặt tế bào, sự hiện
diện của lông roi, tiêm mao và chất kết dính, ngoài ra còn có protein màng tế bào và
sự sản suất mạng lưới chất ngoại bào [26]. Thêm vào đó, các bằng chứng thực
nghiệm cho thấy rằng sự phát triển chủ yếu của một màng sinh vật có thể được điều
hòa bởi mật độ tế bào - phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của gen được điều khiển
bởi các phân tử tín hiệu ngoại bào.
1.3.1 Mạng lưới ngoại bào
Mạng lưới chất ngoại bào chứa hàm lượng cacbon chiếm 50 - 90% tổng
lượng cacbon hữu cơ trong màng sinh vật và được xem như là vật liệu chất nền
chính của màng sinh vật.
Mạng lưới ngoại bào có thể khác nhau về một số tính chất vật lý và hóa học
nhưng nó bao gồm chủ yếu là các polysaccarit. Một số polysaccarit là trung tính hay
mang điện tích âm, như trường hợp chất ngoại bào ở vi khuẩn gram âm. Sự hiện
diện của axit uronic (ví dụ như D - glucuronic, D - galacturonic, và axit
mannuronic) hoặc liên kết xeton trong phân tử axit pyruvic đưa đến tính chất của
ion âm [79]. Tính chất này rất quan trọng bởi nó cho phép các phân tử polysaccarit
ngoại bào liên kết được với các ion dương hóa trị II như Ca2+ và Mg2+. Từ đó hình
thành liên kết chéo giữa các sợi polymer và tạo ra lực liên kết lớn hơn trong cấu trúc
màng sinh vật. Trong trường hợp của một số vi khuẩn gram dương như
Staphylococcus, thành phần hóa học của mạng lưới ngoại bào có thể hoàn toàn khác
nhau và gồm chủ yếu là các ion dương. Hussain và cộng sự [41] đã phát hiện ra
rằng màng nhầy của tụ cầu khuẩn tạo coagulase - một loại enzyme cho phép chuyển
đổi fibrinogen thành fibrin gây đông máu - âm tính có chứa hỗn hợp axit teichoic và
một lượng nhỏ protein.
Trường Đại học KHTN
11
Luận văn thạc sĩ Sinh học
Trần Thúy Hằng
Mạng lưới ngoại bào có thể là ưa nước do kết hợp với một lượng lớn các
phân tử nước thông qua liên kết hydro hoặc cũng có thể là kỵ nước. Tuy nhiên,
phần lớn các dạng chất ngoại bào bao gồm cả ưa nước và kỵ nước. Đồng thời mạng
lưới ngoại bào cũng có thể thay đổi độ hòa tan của nó [26].
Sutherland [79] đã ghi nhận hai thuộc tính quan trọng của mạng lưới ngoại
bào. Thứ nhất, thành phần và cấu trúc của các polysaccarit xác định cấu tạo chính
của mạng lưới ngoại bào. Ví dụ, cấu trúc bộ khung của mạng lưới ngoại bào ở nhiều
vi khuẩn chứa nhiều liên kết 1,3 hoặc 1,4--D-fructan và có xu hướng làm cho nó
cứng chắc hơn, ít bị biến dạng và trong một số trường hợp trở nên kém hòa tan hoặc
không hòa tan. Các liên kết khác trong phân tử polysaccarit như liên kết 1,2 hoặc
1,6--D-glucan giúp cấu trúc mạng lưới ngoại bào trở nên linh hoạt hơn. Thứ hai,
mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật thường không đồng nhất, có thể thay đổi
theo không gian và thời gian.
Leriche và cộng sự [53] đã sử dụng liên kết đặc hiệu của lectin với một loại
đường đơn để đánh giá sự phát triển của màng sinh vật ở các vi sinh vật khác nhau.
Kết quả nghiên cứu cho thấy các sinh vật khác nhau sản xuất một lượng chất ngoại
bào khác nhau và lượng chất ngoại bào này tăng lên theo thời gian. Mạng lưới chất
ngoại bào có thể liên kết với các ion kim loại, các cation hóa trị hai hay các đại phân
tử khác như protein, DNA, lipit… Điều kiện dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy
cũng được chứng minh là có ảnh hưởng đến sự sản xuất chất ngoại bào. Nghiên cứu
cho thấy sự dư thừa nguồn carbon sẵn có và sự hạn chế của nitơ, kali, phospho
trong môi trường nuôi cấy đã thúc đẩy quá trình tổng hợp mạng lưới ngoại bào [79].
Sự tăng trưởng chậm của vi khuẩn cũng sẽ làm tăng cường sản xuất chất
ngoại bào. Sự tích nước trong mạng lưới chất ngoại bào là rất lớn, do đó nó ngăn
chặn sự khô hạn của màng sinh vật trong tự nhiên. Mạng lưới chất ngoại bào cũng
góp phần vào đặc tính kháng kháng sinh của màng sinh vật bằng cách cản trở sự
vận chuyển lượng chất kháng sinh qua màng, có lẽ là thông qua việc liên kết trực
tiếp với các chất này [25].
Trường Đại học KHTN
12
Tải về để xem bản đầy đủ
80 trang
12720
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (Biofilm) ở Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_van_phan_lap_nghien_cuu_dac_diem_sinh_hoc_cua_mot_so_ch.pdf
