Luận văn Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện bảo quản
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VI THỊ THU HÒA
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG GIỐNG
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS
TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN
Chuyên ngành:
Mã số:
Chăn nuôi
60.62.01.05
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Tuyết Lê
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2016
Tác giả luận văn
Vi Thị Thu Hòa
i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Lê đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức,
thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Dinh dưỡng - Thức ăn, Khoa Chăn nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành
luận văn./.
Hà Nội, ngày tháng
năm 2016
Tác giả luận văn
Vi Thị Thu Hòa
ii
MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn........................................................................................................................ ii
Mục lục ...........................................................................................................................iii
Danh mục các chữ viết tắt................................................................................................. v
Danh mục bảng ................................................................................................................ vi
Danh mục biểu đồ........................................................................................................... vii
Danh mục hình................................................................................................................ vii
Trích yếu luận văn .........................................................................................................viii
Thesis abstract................................................................................................................... x
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.
1.2.
Đặt vấn đề........................................................................................................... 1
Mục đích – yêu cầu............................................................................................. 2
1.2.1. Mục đích............................................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu............................................................................................................... 2
Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3
2.1.
Tổng quan về Lactobacillus ............................................................................... 3
2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus................................................................. 3
2.1.2. Lên men lactic ở Lactobacillus........................................................................... 4
2.1.3. Một số đặc tính probiotic của Lactobacillus ...................................................... 5
2.1.4. Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus trong chăn nuôi........................................... 6
2.2.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật ....................... 9
2.2.1. Yếu tố dinh dưỡng.............................................................................................. 9
2.2.2. Yếu tố vật lý ..................................................................................................... 11
2.2.3. Yếu tố hóa học.................................................................................................. 14
2.3.
Biến dị ở vi sinh vật.......................................................................................... 15
2.3.1. Khái niệm ......................................................................................................... 15
2.3.2. Các dạng biến dị ............................................................................................... 16
2.4.
Các phương pháp bảo quản vi sinh vật............................................................. 17
2.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật.................................................................. 17
2.4.2. Giữ giống vi sinh vật trong môi trường đất, cát, hạt ........................................ 19
2.4.3. Phương pháp đông khô và đông khô dịch thể trực tiếp.................................... 20
2.4.4. Bảo quản lạnh ................................................................................................... 21
2.4.5. Phương pháp bảo quản lạnh sâu ....................................................................... 21
2.5.
Vai trò của sinh khối vi khuẩn lactic trong chăn nuôi...................................... 22
Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 23
iii
3.1.
3.2.
Đối tượng – địa điểm – thời gian nghiên cứu................................................... 23
Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 23
3.2.1. Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Lactobacillus trong
thời gian giữ giống:........................................................................................... 23
3.2.2. Đánh giá sự biến đổi về đặc tính sinh học của các chủng Lactobacillus.......... 23
3.3.
Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 23
3.3.1. Nguyên vật liệu................................................................................................. 23
3.3.2. Phương pháp bảo quản, giữ giống.................................................................... 24
3.3.3. Phương pháp xác định hình thái ....................................................................... 24
3.3.4. Các phản ứng sinh hóa – Catalase Test ............................................................ 24
3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein........................................... 25
3.3.6. Phương pháp xác định khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa ................... 25
3.3.7. Phương pháp đánh giá sức sống của giống....................................................... 26
3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ
khác nhau.......................................................................................................... 26
3.3.9. Phương pháp xác định số lượng tế bào............................................................. 26
3.4.
Xử lý số liệu...................................................................................................... 27
Phần 4. Kết quả và thảo luận....................................................................................... 28
4.1.
Đánh giá sự biến đổi hình thái của vi khuẩn Lactobacillus trong quá
trình giữ giống .................................................................................................. 28
4.1.1. Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc ........................................................................ 28
4.1.2. Sự biến đổi hình thái vi khuẩn.......................................................................... 30
4.2.
Đánh giá sự biến đổi các đặc tính sinh học của các chủng Lactobacillus
trong thời gian bảo quản giữ giống................................................................... 32
4.2.1. Khả năng phân giải protein............................................................................... 32
4.2.2. Khả năng đông vón sữa và sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus......... 35
4.2.3. Đánh giá sức sống của các chủng giống Lactobacillus trong thời gian
bảo quản............................................................................................................ 38
4.2.4. Khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau....................................... 39
Phần 5. Kết luận và kiến nghị...................................................................................... 50
5.1.
Kết luận............................................................................................................. 50
5.1.1. Về sự biến đổi hình thái của Lactobacillus trong thời gian bảo quản .............. 50
5.1.2. Về sự biến đổi đặc tính sinh học của Lactobacillus trong thời gian
bảo quản............................................................................................................ 50
5.2.
Kiến nghị .......................................................................................................... 51
Tồn tại............................................................................................................... 51
5.2.1
5.2.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 51
Tài liệu tham khảo........................................................................................................ 52
iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt
cs.
: Cộng sự
: Độ C
oC
h
: Giờ
NXB
ST
: Nhà xuất bản
: Sinh trưởng
: Tế bào
TB
VK
VSV
: Vi khuẩn
: Vi sinh vật
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hoạt độ của nước đối với một số giống vi sinh vật ..................................... 12
Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo
quản giữ giống ............................................................................................. 29
Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian bảo quản......................... 31
Bảng 4.3. Khả năng phân giải protein của các chủng vi khuẩn Lactobacillus
trong thời gian bảo quản .............................................................................. 32
Bảng 4.4. Khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong
thời gian bảo quản........................................................................................ 35
Bảng 4.5. Khả năng đông vón sữa ở thời điểm 24h của các chủng Lactobacillus
trong thời gian bảo quản giữ giống.............................................................. 37
Bảng 4.6. Số lượng tế bào sống (TB/ml) của các chủng Lactobacillus trong thời
gian bảo quản giữ giống............................................................................... 38
Bảng 4.7. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 30oC ........................ 41
Bảng 4.8. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 35oC ........................ 43
Bảng 4.9. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 40oC ........................ 45
Bảng 4.10. Khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở 45oC......................... 47
vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 2.1. Giới hạn nhiệt độ của các nhóm vi sinh vật ............................................... 13
Biểu đồ 4.1. Khả năng phân giải protein của các chủng Lactobacillus trong thời gian
bảo quản...................................................................................................... 34
Biểu đồ 4.2. Khả năng sinh axit lactic của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo
quản giữ giống ............................................................................................ 36
Biểu đồ 4.3. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 30oC.......................... 42
Biểu đồ 4.4. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 35oC.......................... 44
Biểu đồ 4.5. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 40oC.......................... 46
Biểu đồ 4.6. Khả năng sinh trưởng của Lactobacillus ở nhiệt độ 45oC.......................... 48
DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1. Đĩa petri nuôi cấy NCb ................................................................................... 31
Hình 4.2. Khuẩn lạc NCb................................................................................................ 31
Hình 4.3. NCb qua ba lần cấy chuyển ............................................................................ 31
Hình 4.4. Hình thái một số chủng giống Lactobacillus.................................................. 32
Hình 4.5. Khả năng phân giải protein của các chủng Lactobacillus .............................. 34
Hình 4.6. Khả năng đông vón sữa của vi khuẩn Lactobacillus ...................................... 38
Hình 4.7. Đánh giá sinh trưởng trên môi trường MRS dịch thể..................................... 40
vii
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Vi Thị Thu Hòa
Tên Luận văn: Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn
Lactobacillus trong điều kiện bảo quản
Ngành: Chăn Nuôi
Mã số: 60.62.01.05
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Đánh giá sự biến đổi về hình thái, đặc điểm sinh trưởng và một số đặc tính sinh học
của 6 chủng vi khuẩn Lactobacillus được bảo quản, giữ giống trên môi trường thạch
nghiêng trong tủ lạnh (4oC) trong 90 ngày để từ đó đánh giá phẩm chất giống và đưa ra quy
trình bảo quản giống phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
Đề tài có 4 nội dung chính
- Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Lactobacillus trong thời
gian giữ giống.
- Đánh giá khả năng sống sót của các chủng Lactobacillus trong thời gian bảo quản.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng Lactobacillus ở các điều kiện
nhiệt độ khác nhau trong thời gian bảo quản.
- Đánh giá một số đặc tính sinh học của giống:
+ Đánh giá khả năng phân giải protein
+ Đánh giá khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa
Nguyên vật liệu
Các chủng Lactobacillus sử dụng trong nghiên cứu:
+ 01 chủng Lactobacillus bulgaricus: Proc
+ 02 Lactobacillus acidophilus: LA, NCb
+ 03 Lactobacillus plantarum: LP, ND1, ND2
Tất cả các chủng giống đều được phân lập và chọn lọc mới từ các mẫu là các sản
phẩm lên men. Sử dụng môi trường MRS để giữ giống.
Phương pháp nghiên cứu.
- Phương pháp bảo quản, giữ giống: Giống Lactobacillus được nuôi cấy trên môi
trường thạch nghiêng MRS ở 37oC/48h sau đó giữ giống trong tủ lạnh (4oC).
viii
- Phương pháp xác định hình thái: Vi khuẩn nhuộm Gram và quan sát dưới kính
hiển vi quang học.
- Các phản ứng sinh hóa: gồm phản ứng lên men đường, Catalase Test.
- Phương pháp đánh giá khả năng phân giải protein: sử dụng phương pháp
khuếch tán trên thạch, đo đường kính vòng phân giải.
- Xác định khả năng sinh axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ và đông vón sữa.
- Phương pháp đánh giá sức sống của giống: Đếm số lượng tế bào sống bằng
phương pháp pha loãng nồng độ.
- Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau:
xác định số lượng tế bào nuôi cấy ở các mức nhiệt độ 30, 35, 40 và 45oC ở 24-48h.
Kết quả chính và kết luận
- Với phương pháp bảo quản giữ giống trên môi trường thạch nghiêng ở 4oC
trong 90 ngày với thời gian cấy truyền 1 tháng/lần thì khuẩn lạc và hình thái tế bào của
các chủng giống nghiên cứu không có sự biến đổi so với ban đầu.
- Trong số 6 chủng giống kiểm tra chỉ có 3 chủng LA, LP và Proc vẫn duy trì
chất lượng giống ổn định trong suốt 90 ngày bảo quản.
- Ở mức nhiệt độ thường (30-35oC): Các chủng giống có tốc độ sinh trưởng lớn
nhất gồm LA, LP, NCb, Proc. Ở nhiệt độ cao (40-45oC): Các chủng giống có tốc độ
sinh trưởng lớn nhất gồm LA và LP.
- Chủng Lactobacillus LA là chủng giống có sức sống và đặc tính sinh học ổn
định nhất trong suốt quá trình bảo quản.
ix
THESIS ABSTRACT
Master candidate: Vi Thi Thu Hoa
Thesis title: Evaluation of viability and stability of some Lactobacillus strains
under storage condition
Major: Animal Science
Code: 60.62.01.05
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
Six Lactobacillus strains were preservated by On Agar Slopes Method at
refrigeration temperature 4o C. Their morphology, viability, growth ability and some
functional properties relevant to their use as probiotics were evaluated during 90
days of preservation. The aim of this study was to evaluate of quality of six
Lactobacillus strains and establish a suitable preservation method for stater culture
at laboratory scale.
Materials and Methods
Four main subjects:
- Evaluation of mophology characteristics of six Lactobacillus strains during 90
days of preservation.
- Evaluation of viability of six Lactobacillus strains during 90 days of
preservation.
- Evaluation of growth ability of six Lactobacillus strains at different
temperatures during 90 days of preservation.
- Evaluation of some functional properties of six Lactobacillus strains during 90
days of preservation such as protease activity, lactic acid production and milk
coagulation ability.
Materials
Lactobacillus strains were used in this study:
+ 01 Lactobacillus bulgaricus strain: Proc
+ 02 Lactobacillus acidophilus strains: LA, NCb
+ 03 Lactobacillus plantarum strains: LP, ND1, ND2
All strains were isolated from fermented products and preserved on MRS agar
Slopes Method.
x
Study methods
- Preservation of pure culture: Pure culture of six Lactobacillus strains were
preserved on MRS agar slopes after taking a growth of 48 h at 37o C at ordinary
refrigeration temperature (4oC).
- Morphological examination of culture: Morphological and cultural
examination was carried out by using Gram’s staining method.
- Biochemical tests: sugar fermentation and catalase test.
- Protein hydrolysis test by determining of clearing zone around the bacterial
growth.
- Evaluation of lactic acid production by titratable acidity method and milk
coagulation ability.
- Viability of culture: Viability was estimated as described by Awan and
Rahman (2002) at 0, 30, 60 and 90 days of storage. Bacterial count based on serial
dilution and plate count method.
- Methods of assessment of growth in the various temperature conditions 30, 35,
40 and 45oC: Bacterial count method according to Vinogradxki – Sulghina – Brid
(Nguyễn Lân Dũng, 1978).
Main results and conclusions
- The morphology of six Lactobacillus strains preservated on MRS agar slope at
refrigeration temperature 4o C have showed no changes in cell morphology as well as
colony morphology during the 90 days of preservation.
- 3/6 Lactobacillus strains including LA, LP and Proc almost remained stability,
vitality and growth ability during storage of 90 days.
- Growth ability at temperature 30 and 35oC: The best growth rate was detected
4 in Lactobacillus strains including LA, LP, NCb, Proc.
- Growth ability at hight temperature 40 and 45oC: The best growth rate was
detected 4 in Lactobacillus strains including LA and LP.
It is concluded that only Lactobacillus strain LA showed the stability during
storage of 90 days.
xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi khuẩn sống, có tác động làm cân
bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh hưởng tốt cho động vật. Cách
thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh, qua đó tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ
sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, chúng cũng sinh ra các hoạt
chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch của vật nuôi.
Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi nhất trong chế
tạo probiotics. Hoạt động của Lactobacillus rất hiệu quả trong việc tạo khả năng
bám dính vào tế bào, loại trừ hoặc làm giảm khả năng lan truyền bệnh, tính bền
vững và khả năng nhân lên (Rolfe, 2000). Các chủng Lactobacillus được tìm thấy
và phân lập nhiều ở trong đường tiêu hóa của động vật, trong các phế phụ công
nghiệp sản xuất bia, rượu, đường và sản phẩm lên men.... Các sản phẩm này có
chứa hàm lượng axit lactic rất cao là tiềm năng để sản xuất probiotics.
Để thu được những chủng giống vi khuẩn lactic có phẩm chất sinh học tốt,
đáp ứng yêu cầu trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các giống
khởi động có chất lượng cao thì khâu phân lập, chọn lọc đóng vai trò then chốt.
Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng rất tốn kém, đòi hỏi công sức và phụ
thuộc rất nhiều vào công tác bảo quản giống sau phân lập. Các chủng giống được
chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có các đặc tính sinh học cao, nhưng
chúng dễ bị biến đổi hoặc xuất hiện những biến dị không mong muốn nếu khâu
bảo quản và giữ giống không tốt.
Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật hiệu
quả như đông lạnh, đông khô…. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi phải có
thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước chưa đáp ứng
được. Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được giữ giống với
phương pháp truyền thống là nuôi cấy trên thạch nghiêng và bảo quản trong tủ
lạnh. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém nhưng lại có một
số nhược điểm như thời gian bảo quản ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của
giống, thoái hóa giống… Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các
đặc điểm về hình thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Lactobacillus
1
sử dụng làm chế phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng
tôi tiến hành đề tài:
“Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus
trong điều kiện bảo quản”.
1.2. MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU
1.2.1. Mục đích
Theo dõi các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong quá trình bảo quản, giữ
giống ở nhiệt độ bảo quản tủ lạnh (4oC) để đánh giá sự biến đổi đặc tính sinh học
của chúng trong các điều kiện và thời gian khác nhau, từ đó đánh giá phẩm chất
giống và đưa ra quy trình bảo quản giống phù hợp.
1.2.2. Yêu cầu
Đánh giá phẩm chất giống vi khuẩn Lactobacillus trong thời gian giữ giống
trên các tiêu chí sau:
- Đánh giá về hình thái.
- Đánh giá về đặc tính sinh học như: sức sống, khả năng phân giải
protein, khả năng sinh axit lactic và đông vón sữa; khả năng sinh trưởng ở các
điều kiện nhiệt độ khác nhau.
2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ LACTOBACILLUS
2.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus
Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s (2005) Lactobacillus được
phân loại như sau:
Ngành:
Lớp:
Firmicutes
Bacilli
Bộ:
Eubacteriales
Lactobacillaceae
Lactobacillus
Họ:
Giống:
Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic gồm một số
giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính là các vi khuẩn Gram
dương và lên men carbohydrate thành năng lượng và axit lactic.
Giống Lactobacillus rất đa dạng. Sự đa dạng của chúng có thể được đánh
giá bằng hàm lượng G+C trong ADN của các loài, thường chiếm 32-53 mol%.
Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn các giống khác là
dạng hình que và khả năng tạo ra axit lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ
yếu. Bên cạnh đó, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành
bào tử và hiếm khi di động. Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có
dạng hình que, với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5-1,2)×(1-10) µm, đôi
khi trông chúng có thể gần giống như hình cầu (coccoid) trong điều kiện nào đó
và thường hình thành dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn (Abee et al., 1999).
Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus trên môi trường agar có kích thước 2-
5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu. Những tế bào này đòi hỏi môi
trường nuôi cấy phức tạp, có khả năng lên men và phân hủy saccharose. Ít nhất
một nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactose.
Về nhu cầu oxy, Lactobacillus là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, thường sinh
trưởng chậm trong không khí. Đôi khi, sự sinh trưởng của chúng có thể được
kích thích bằng cách thêm 5% CO2 vào môi trường nuôi cấy.
Về nhu cầu dinh dưỡng, vi khuẩn Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng
đặc biệt, chúng phát triển rất tốt trên môi trường có chứa nhiều phức chất.
3
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus là 30 – 400C.
Nhưng chúng có thể sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ là 5 – 530C.
Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu đựng được môi trường có tính
axit. pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là pH 5,5 – 5,8.
Lactobacillus có một số đặc tính sinh hóa đặc trưng như: catalase âm tính,
khử nitrate âm tính (đôi khi dương tính với pH > 6), có khả năng lên men
glucose… (Axelsson and Lars, 2004).
Lactobacillus phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt là trong
các sản phẩm lên men, chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực
phẩm: các sản phẩm chế biến từ sữa và rượu bia. Người ta có thể tìm thấy
Lactobacillus ở cả động vật và thực vật. Ở người, Lactobacillus thường tìm thấy
ở ruột và âm đạo (Fuller, 1989).
2.1.2. Lên men lactic ở Lactobacillus
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic nhờ vi sinh vật,
điển hình là vi khuẩn lactic. Lactobacillus có khả năng lên men nhiều loại đường đơn
và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột.
Sự phát triển của chúng cần sự có mặt của peptone, axit amin hay muối amoni. Vi
khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, axit amin
và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường axit pH từ 5,5÷6,
khi pH < 5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men
0
thích hợp khác nhau, nếu nhiệt
từ 15÷50 C. Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ
độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.
Quá trình lên men lactic diễn ra trong tế bào vi khuẩn. Đầu tiên, đường sẽ
được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng
của màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng
chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường
khác thì sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide rồi mới vào chu trình chuyển
hóa. Sau đó phân tử đường này sẽ đi vào các chu trình chuyển hóa khác nhau và
cuối cùng cho sản phẩm là axit lactic, axit axetic, CO2…
Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men mà người ta chia chúng
ra làm hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men
dị hình (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2002)
4
Các loài thuộc nhóm lên men đồng hình tạo ra 85% axit lactic từ glucose,
trong khi các loài lên men dị hình chỉ tạo ra 50% axit lactic và một lượng đáng kể
carbone dioxide, acetate và ethanol. Các loài Lactobacillus lên men đồng hình
gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus
leichmannii… và các loài lên men dị hình gồm: Lactobacillus brevis,
Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum…
(Axelsson and Lars, 2004). Mặc dù tất cả các loài Lactobacillus đều tạo ra axit
lactic, nhưng các loài khác nhau có thể tạo ra các axit lactic khác nhau về đồng
phân hóa học.
2.1.3. Một số đặc tính probiotic của Lactobacillus
2.1.3.1. Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh
Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất ức chế với cả vi khuẩn Gram
dương, Gram âm, kể cả nấm và có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao
gồm các axit hữu cơ, hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như
bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin (Hollang et al., 1987; Mishra and
Lambert, 1996).
Axit hữu cơ có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, được sản
sinh bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, axit probionic. Một vài vi khuẩn chi
Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển của E. coli, M. luteus, Salmonella
typhi và Shigella flexneri bằng cách sinh ra ra axit lactic (Mai Thị Đàm Linh và cs.,
2008). Cả axit lactic và axit axetic đều có khả năng hạn chế sự phát triển của các vi
sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh
hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác.
Ngoài ra, Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacteriocin, một loại
protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm
thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân
giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào.
Bacteriocin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng,
trong đó có các vi khuẩn gây bệnh như: E.coli, Samonella, Vibrio,
Campylobacter, Shigella, Clostridium, Candida albicans, và một số virus khác
(Mishra and Lambert, 1996).
5
2.1.3.2. Khả năng chịu mặn
Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu
tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển. Khả
năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này chế tạo chế phẩm sử
dụng cho nuôi trồng thủy sản ở các vùng khác nhau. Một số chủng
Lactobacillus đã được biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so
với độ mặn trung bình từ 3,1% tới 3,8% của nước biển như L. amylovorus DCE
471 có thể tồn tại và sinh ra bacteriocin trong môi trường 3 % (w/v) NaCl
(Patricia et al., 2003).
2.1.3.3. Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa và ức chế vi khuẩn gây bệnh
Trong các điều kiện in vitro, nhiều chủng Lactobacillus đã được tuyển chọn
với khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động vật thủy sản
như môi trường axit HCl ở dạ dày, môi trường kiềm của ruột, lyzozyme, dịch
tụy, dịch mật (Srikanjana et al., 2008).
Khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa giúp
cho các vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh được vị trí bám dính và các
nguồn dinh dưỡng, năng lượng với các vi khuẩn gây hại. Một số chủng
Lactobacillus có khả năng tồn tại tốt trong đường tiêu hóa đã được phân lập
như: L. curvatus, L. reuteri, L. plantarum, L. parapentarum, L. pentosus, L.
keferi, L. fermentum, L. animalis, L. mucosae, L. Aviaries, L. hilgardii, và L.
Panis (Srikanjana et al., 2008 ; Yazid et al., 1999).
Afolabi et al. (2008) cho biết, vi khuẩn lactic có thể sản sinh các hoạt chất
kháng lại cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Adesokan et al. (2008) đã báo
cáo, nhiều loài vi khuẩn lactic có khả năng ức chế Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Escherichia coli and Proteus
vulgaris. Obadina et al. (2006) cũng cho biết Lactobacillus plantarum có khả
năng ức chế Salmonella thyphii, Staphylococcus aureus, E.coli và B.substilis.
2.1.4. Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus trong chăn nuôi
2.1.4.1. Trong bảo quản và chế biến thức ăn chăn nuôi
Công nghệ lên men trong bảo quản thức ăn đã được sử dụng từ lâu. Đó là
kỹ thuật truyền thống lên men thức ăn xanh được gọi là “ủ xanh” để bảo quản
dự trữ thức ăn dùng trong chăn nuôi gia súc lớn. Nguyên lý của phương pháp
là sử dụng quá trình lên men của vi khuẩn lactic hình thành một lượng axit
6
lactic đủ để hạ độ pH của thức ăn xuống dưới mức 4,2 làm ức chế vi khuẩn
thối rữa hoạt động làm thối hỏng thức ăn. Để quá trình lên men được tốt, làm
cho thức ăn xanh có thể bảo quản lâu dài cần bảo đảm các điều kiện về nhiệt
độ lên men trên dưới 30oC, độ ẩm 75% và trạng thái yếm khí.
Kỹ thuật lên men thức ăn xanh hiện nay được cải tiến nhiều hơn, đặc biệt
là việc chọn giống vi sinh vật để không những có tác dụng cho việc bảo quản
dự trữ mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của các thức ăn được bảo quản.
Raimbault (1995) đã phân lập từ sắn ở Senegal các chủng vi khuẩn lactic
thuộc chi Lactobacillus có khả năng lên men trực tiếp tinh bột sắn được dùng
trong bảo quản. Khoảng 100 chủng vi khuẩn cũng được tách từ các nguồn
thực phẩm ở Mexico và trong đó tác giả đã chọn được một chủng thuộc chi
Lactobacillus có tác dụng bảo quản sắn tươi và làm giàu protein rất tốt.
Những vi khuẩn này đã được sử dụng trong bảo quản các sản phẩm giàu tinh
bột khác (thức ăn củ quả như khoai lang, dong riềng) và các phụ phẩm nông
nghiệp nhằm làm tăng khả năng tiêu hóa, tăng hương vị các sản phẩm như bã
mia, vỏ lá dứa, thân lõi ngô. Tác dụng của sự lên men bảo quản này còn ở chỗ
nó khử được mùi vị khó chịu và chất độc có trong sản phẩm như vỏ bã sắn, vỏ
hạt cà phê, vỏ xoài… (Ali et al., 2012)
Trong chăn nuôi, các phụ phẩm nông nghiệp là nguồn nguyên liệu quan
trọng. Và để tăng cường chất lượng các loại thức ăn bảo quản là các phụ phẩm
nông nghiệp như bã chuối, bã mía, bã củ cải đường, rơm, rạ. Rất nhiều nghiên
cứu đã sử dụng các chủng vi khuẩn lactic kết hợp với các chủng nấm men và
các chủng vi nấm có khả năng đường hóa xơ và sử dụng nguồn nitơ vô cơ tốt để
bảo quản. Ở độ ẩm nguyên liệu 55-70%, nhiệt độ trong thức ăn bảo quản là 29-
30oC có bổ sung thêm ure, muối amoni đã cải thiện rất nhiều chất lượng của
thức ăn cho gia súc, gia cầm.
Sử dụng vi khuẩn lactic có khả năng thủy phân tinh bột phối hợp với nấm
men hay vi nấm men để lên men thức ăn giàu xơ và tinh bột nhằm cải thiện mùi
vị cũng như giá trị dinh dưỡng để nâng cao hiệu quả sử dụng của chúng. Quá
trình lên men này đơn giản, thích hợp với các nước vùng nhiệt đới. Quá trình lên
men cơ chất đặc có khuấy trộn làm giàu protein của bột sắn, chuối, vỏ chuối, bã
sắn… có bổ sung thêm muối amoni hoặc ure bảo đảm ở độ ẩm 55- 70%, nhiệt độ
35- 40% sẽ cho sản phẩm có hàm lượng protein tăng cao như trong bột sắn có thể
7
tăng được lượng protein từ 2- 3% lên đến 18- 20%; lượng prorein trong vỏ chuối
có thể tăng 1,7- 1,8% lên đến 10- 12% (Oboh, 2006; Gunawan et al., 2015)
Raimbault (1995) đã tách 100 chủng vi khuẩn lactic từ các thực phẩm lên
men truyền thống như Pulque, Pozol, Tesguino. Lactobacillus đã được lựa chọn
để dùng vào việc chế biến làm giàu protein cho sắn tươi. Sắn tươi được lên men đã
có sự giảm đáng kể HCN do bị phân hủy và chuyển thành các amon và axit formic.
Vi khuẩn lactic hầu như không sinh độc tố lại tạo được hương vị thơm ngon
và sự độc đáo do các hợp chất hữu cơ được sinh ra nên chúng được sử dụng rộng
rãi trong chế biến thức ăn. Đó là ứng dụng làm sữa chua, dưa muối, cà muối…
Quá trình chế biến thức ăn do vi khuẩn lactic trước đây thường là quá trình lên
men tự nhiên, bởi các chủng vi khuẩn lactic tồn tại trong tự nhiên và có sẵn trong
thức ăn chủ yếu là thức ăn xanh, thực hiện sự lên men sinh axit và các hợp chất
hữu cơ khác làm cho thức ăn chế biến có mùi vị chua thơm.
2.1.4.2. Các chế phẩm sinh học có chứa vi khuẩn lactic sử dụng trong chăn nuôi
Có thể kể đến rất nhiều sản phẩm Probiotic từ vi khuẩn lactic được sản xuất
và sử dụng khá phổ biến hiện nay trong phòng và trị rối loạn tiêu hóa và tiêu
chảy với các tên thương phẩm khác nhau như Biolactyl (Lactobacillus
acidophillus, Lactobacillus casei), Antibio (Lyonphylized antibiotic resistant
Lactobacillus acidophillus), Lactomed (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
bifidus, Streptococcus feacalis), Lacteol Fort (Lactobacillus acidophillus) hay
Lactomin Plus (Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium longgum,
streptococcus feacalis)
Có thể nói một vài năm gần đây giống Lactobacillus được quan tâm nghiên
cứu như nguồn vi sinh vật hữu ích cho vật nuôi. Theo Shoeib et al. (1997) thấy
tốc độ sinh trưởng của gà broiler (tăng từ 4,88 – 6,12) và hiệu quả chuyển hóa
thức ăn được cải thiện rõ rệt khi được ăn thức ăn có bổ sung vi khuẩn lactic sống.
Tại Việt Nam, cũng có nhiều công trình khoa học nghiên cứu sử dụng vi
khuẩn lactic trong chăn nuôi. Viện công nghệ sinh học - Trung tâm khoa học và
công nghệ quốc gia đã sản xuất chế phẩm Biolactyl đông khô từ chủng Lactobacillus
acidophilus. Chế phẩm thương phẩm được chế ở dạng viên nén, có thể bảo quản ở
nhiệt độ 15-20oC có hoạt lực cao trong phòng trị bệnh đường ruột ở người và gia súc
(Nguyễn Văn Uyển và cs., 1994).
8
Tải về để xem bản đầy đủ
68 trang
04/04/2022
4660
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Đánh giá chất lượng giống của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện bảo quản", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_van_danh_gia_chat_luong_giong_cua_mot_so_chung_vi_khuan.pdf
