Xác định đồng thời Aspartame và Saccharin trong một số loại đồ uống bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 25, Số 2/2020

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ASPARTAME VÀ SACCHARIN TRONG MỘT SỐ

LOẠI ĐỒ UỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Đến tòa soạn 2-12-2019

Dương Thị Tú Anh

Khoa Hóa học-Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Phạm Thanh Tùng

Trường THPT Cửa Ông, Thành phố Cẩm Phả, Tỉnh Quảng Ninh

Đoàn Mạnh Cường

Khoa Công nghệ điện tử & Truyền thông- Trường ĐHCN TT &TT- Đại học Thái Nguyên

SUMMARRY

SIMULTANEOUS IDENTIFICATION OF ASPARTAME AND SACCHARIN

IN SOME DAILY BEVERAGES BY USING HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD

In this research, we reported some results of simultaneous identification of aspartame and saccharin by

using High Performance Liquid Chromatography method (HPLC) and simultaneous identification the

content of aspartame and saccharin in some beverages by using HPLC. It is shown that, detection limit

and quantitative limit by HPLC for aspartame was 0,2 ppm and 0,667 ppm; for Saccharin was 0,03

ppm and 0,1 ppm; the linear concentration of aspartame ranged from 0,5 to 100 ppm, with a coefficient

R²is 0,9997; while the linear concentration of saccharin was in a range of 0,1 to 200 ppm with the

same coefficient as aspartame. The content of aspartame and saccharin in analytical samples

fluctuated from 6,931 to 19,06 ppm and from 41,70 to 79,69ppm. The recovery of aspartame and

saccharin in analytical samples fluctuated from 90,14 to 98,75% and from 90,45 to 99,15 %.

1. MỞ ĐẦU

quy, thuốc chữa bệnh, kem đánh răng; là chất

làm ngọt chính trong các loại thuốc dùng cho

trẻ em, bao gồm aspirin nhai, xi-rô ho, các loại

thuốc kê đơn và không kê đơn khác…, ngoài

ra nó còn được sử dụng trong cả những sản

phẩm mỹ phẩm, vitamin và dược phẩm. Sử

dụng SCR làm xuất hiện chứng nhạy cảm ánh

sáng, buồn nôn, rối loạn tiêu hóa, nhịp tim

nhanh và một số loại ung thư. Tuy nhiên tất cả

những biến chứng do việc sử dụng SCR vẫn

còn là một tranh cãi và chưa có kết luận nào

thực sự có tính thuyết phục.

Asparame (ASP) là chất ngọt rất được ưa

chuộng. ASP cũng không ổn định trong các

dung dịch nước và dần dần chuyển thành

diketopiperazine (DKP). Ngay sau khi được

con người tiêu thụ, ASP phân hủy thành 3 hợp

chất hóa học: phenylalanine (khoảng 50%

trọng lượng), aspartic acid (40%), và methanol

(10%). Những chất này có thể tồn tại trong

gan, thận và não trong một thời gian khá dài.

Các tác dụng phụ thường gặp khi sử dụng ASP

bao gồm đau đầu, đau nửa đầu, rối loạn tâm lý,

chóng mặt và xuất hiện các cơn hưng cảm.

Saccharin (SCR) là một chất phụ gia tạo ngọt

nhân tạo, nó được sử dụng để làm ngọt các sản

phẩm như đồ uống giải khát, kẹo, bánh bích

Việc sử dụng ASP và SCR quá liều lượng hoặc

không đúng cách sẽ gây ảnh hưởng lớn tới sức

khỏe con người. Chính bởi vậy, việc kiểm soát

hàm lượng ASP và SCR trong các mẫu thực

207

phẩm nói chung cũng như mẫu đồ uống nói riêng

là rất cần thiết. Có rất nhiều phương pháp phân

tích đã được nghiên cứu và áp dụng để xác định

hàm lượng ASP và SCR trong thực phẩm như

phương pháp trắc quang, phương pháp chuẩn độ

thể tích, phương pháp điện di mao quản, phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1- 6]. Trong bài

báo này, chúng tôi thông báo kết quả xác định

đồng thời ASP và SCR trong một số loại đồ uống

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

2. THỰC NGHIỆM

30 mL nước cất, rung siêu âm 30 phút. Sau đó,

chuyển toàn bộ lượng mẫu vào bình định mức

100 mL, thêm 2 mL dung dịch carrez 1 (15g

K₄[Fe(CN)₆].3H₂O trong 100 mL nước cất),

lắc đều, tiếp tục thêm 2 mL dung dịch carrez 2

(30g ZnSO₄.7H₂O trong 100 mL nước cất), lắc

đều, định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần rồi

lọc qua giấy lọc băng xanh. Dung dịch thu

được tiếp tục được lọc qua màng lọc whatman

0,45 µm và định lượng bằng phương pháp

HPLC với detector DAD ở bước sóng 210nm,

dựa vào thời gian lưu, diện tích pic để định tính

và định lượng chất phân tích.

2.1. Thiết bị và hóa chất

Thiết bị

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - hãng

Shimadzu (Nhật bản) kết nối máy tính, Detector

DAD, cột C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm); bể rung

siêu âm (wise clean): Daihan, Máy ly tâm: HermLe,

Z300 WUC-A10H; Cân phân tích Scientech SA

210 độ chính xác 0,0001g; Máy đồng nhất mẫu:

IKA, T25 BASIC ULTRA-TURRAX; Máy đo pH

và các dụng cụ thủy tinh khác.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích

3.1.1. Lựa chọn detector và xác định bước

sóng hấp thụ cực đại

Detector là một bộ phận quan trọng quyết định

độ nhạy của phương pháp. SCR và ASP có khả

năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại rất

tốt do trong cấu tạo phân tử của các chất phân

tích này đều có liên kết π . Vì vậy, detector

DAD và detector UV đều có thể được sử dụng

cho việc định tính và định lượng SCR và ASP,

song detector DAD cho phép đo đồng thời tại

nhiều bước sóng (đo phổ UV) trong quá trình

sắc ký. Để thuận lợi cho quá trình phân tích

chúng tôi lựa chọn detector DAD khi thực hiện

các nghiên cứu tiếp theo.

Xác định bước sóng hấp thụ cực đại của SCR

và ASP: sử dụng detector DAD để quét tìm,

với khoảng quét phổ là 190 ÷ 400 nm. Nồng độ

của SCR và ASP là 10 ppm. Hình ảnh quét phổ

của SCR và ASP thể hiện ở hình 1.

Hóa chất

Chất chuẩn gốc riêng rẽ thuộc hãng Sigma:

SCR 99,95%, ASP 99,85%.

Các hóa chất khác: K₄[Fe(CN)₆].3H₂O (merk),

ZnSO₄.7H₂O (merk), NaH₂PO₄(merk), H₃PO₄

(merk),

Acetonitril

(merk),

Methanol

(MeOH,merck)…

Dung môi pha mẫu: dung dịch đệm photphat

(pH =4,5): dung dịch axetonitril (ACN) tỉ lệ

90:10 về thể tích.

2.2. Quá trình phân tích

Lấy 5 ÷ 10 mL mẫu lỏng vào ống ly tâm; thêm

5mL MeOH, lắc đều trên máy lắc votex, thêm

Hình 1. Sắc ký đồ của của SCR và ASP

208

Kết quả quét phổ cho thấy píc của sacchrin và

ASP lần lượt tách ra ở các thời gian lưu là 6,48

phút và 27,5 phút ở bước sóng 210 nm. Vì vậy

chúng tôi lựa chọn bước sóng 210 nm để xác

định đồng thời SCR và ASP.

Do cấu trúc phân tử SCR, ASP là chất phân

cực yếu. Vì vậy, để tách được các chất này nên

chọn pha tĩnh là pha ngược. Mặt khác, sử dụng

chất nhồi pha ngược thì hệ dung môi là những

chất phân cực nên kinh tế hơn, ổn định và

không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ ẩm

như chất nhồi của pha thường. Sắc đồ hỗn hợp

các chất được phân tích bằng cột C18

(250mm×4,6mm× 5μm) được thể hiện ở hình

2.

3.1.2. Lựa chọn cột tách

Cột tách của hệ thống HPLC quyết định quá

trình tách có độ phân giải tốt hay không. Căn

cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của

chất phân tích để lựa chọn cột tách phù hợp.

Hình 2. Sắc đồ phân tích SCR và ASP bằng cột C18

3.1.3. Lựa chọn pha động

ACN, chế độ chạy sắc ký pha động thành phần

không đổi (isocratic) với các tỷ lệ khác nhau

của thành phần pha động. Kết quả cho thấy với

thành phần pha động NaH₂PO₄: ACN = 90 :

10 (v/v) tại bước sóng 210nm, sắc đồ của SCR

và ASP rõ nét và pic cân đối nhất.

Để tách ASP và SCR ra khỏi các chất cản trở

trong nền mẫu và định lượng nó dễ dàng và

chính xác, pha động sử dụng phải phân cực.

Qua tham khảo các tài liệu [1-6], chúng tôi

chọn lựa pha động là hỗn hợp NaH₂PO₄và

Hình 3. Sắc đồ phân tích SCR và ASP với thành phần pha động NaH₂PO₄: ACN = 90 : 10 (v/v)

3.1.4. Khảo sát pH của pha động

các chất phân tích này là vùng axit vì ở vùng

pH này, các chất phân tích tồn tại ở dạng aitx

nên hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn. Tiến hành

khảo sát các giá trị pH khác nhau của dung

dịch NaH₂PO₄(pH = 3; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0), tỷ lệ

Nếu pH của pha động cao, ASP sẽ bị phân hủy,

pH của pha động chỉ nên trong khoảng 2-7, vì

lớn hơn 7 hay nhỏ hơn 2 sẽ làm tăng độ tan của

các hạt silic trên pha tĩnh. pH tốt nhất để tách

209

dung môi pha động là NaH₂PO₄: ACN = 90 :

10 (v/v), tốc dộ dòng là 1 mL/phút, thể tích

bơm mẫu 10 µL, chất chuẩn hỗn hợp có nồng

độ 10 ppm. Kết quả phân tích cho thấy ở pH =

4,5, diện tích pic của SCR và ASP cao hơn, pic

nhọn và cân đối hơn so với các giá trị pH khác.

Vì vậy chúng tôi chọn pH của dung dịch đệm

NaH₂PO₄là 4,5 để thực hiện các nghiên cứu

tiếp theo.

3.1.5. Độ đặc hiệu, chọn lọc

Để xác định tính chọn lọc, chúng tôi tiến hành

phân tích các mẫu trắng và mẫu trắng có thêm

chất chuẩn, so sánh mẫu trắng và mẫu trắng có

thêm chuẩn SCR và ASP với nồng độ 10ppm.

Kết quả thu được ở hình 4.

(A)

(B)

Hình 4: Sắc ký đồ của mẫu trắng (A) và mẫu trắng có thêm chuẩn (B)

Trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện pic tại

các thời gian lưu của SCR và aspartam. Còn

trên sắc đồ mẫu thêm chuẩn có xuất hiện các

pic tại các thời gian lưu tương ứng của SCR và

aspartam. Như vậy phương pháp có tính đặc

hiệu và chọn lọc đáp ứng yêu cầu phân tích.

3.1.6. Khoảng tuyến tính

Bảng 1. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ

tuyến tính của SCR và ASP

SCR

Diện tích

pic

ASP

Diện tích

Nồng

Nồng độ

độ

pic

(mAuxphút)

22,658

(ppm)

(ppm) (mAuxphút)

0,1

0,2

6374

12090

0,5

1,0

Với các điều kiện chạy HPLC đã chọn, chúng

tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính

của diện tích pic sắc ký vào nồng độ của SCR

trong khoảng 0,1 ÷ 200 ppm và ASP trong

khoảng 0,5 ÷100pm. Kết quả phân tích được

chỉ ra trong bảng 1 và hình 5, 6. Kết quả phân

tích cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic sắc

ký và nồng độ của các chất phân tích.

59,130

0,5

31527

2,0

302,98

1,0

58227

5,0

588,96

2,0

117000

305013

627550

1326120

3119078

6129352

12685692

10,0

20,0

50,0

100,0

906,35

5,0

1231,34

2328,79

3552,07

10,0

20,0

50,0

100,0

200,0

y = 15056x + 27,433

R²= 0,9997

y = 63062x - 9149,5

R²= 0,9997

210

Hình 6. Đường chuẩn của ASP trong khoảng

Hình 5. Đường chuẩn của SCR trong khoảng nồng

nồng độ 0,5 ÷ 100 ppm

độ 0,1 ÷ 200 ppm

3.2. Kết quả phân tích một số mẫu thực

Bảng 2. Mẫu, địa điểm, thời gian lấy mẫu

Ký hiệu

mẫu

M1

STT

Tên mẫu

Nước ngọt có ga 1

Địa điểm lấy mẫu

Thời gian lấy mẫu

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Nước tăng lực 1

M2

Tháng 7 năm 2019

Nước ngọt có ga 2

M3

Nước khoáng vị chanh

Trà sữa đóng chai

M4

Thành phố Hạ long,

Tỉnh Quảng Ninh

M5

Nước giải khát vị hoa quả 1

Nước tăng lực 2

M6

M7

Tháng 8 năm 2019

Nước giải khát vị hoa quả 2

Nước tăng lực 3

M8

M9

Mẫu phân tích được lấy trực tiếp từ các mẫu đồ

uống đóng chai hoặc đóng lon của nhà sản xuất.

Việc xử lý và phân tích mẫu được thực hiện như

quá trình phân tích được trình bày ở mục 2.2 và

các điều kiện tối ưu đã khảo sát, lựa chọn. Mỗi

mẫu phân tích được lặp lại 5 lần, sau đó lấy kết

quả trung bình và xác định độ lệch chuẩn tương

đối (%RSD) của phép xác định. Kết quả phân

tích được chỉ ra trên bảng 3.

Bảng 3. Kết quả phân tích lặp lại hàm lượng SCR và ASP trong mẫu thực

SCR

ASP

Mẫu

Hàm lượng

(ppm)

Hàm lượng

SD

%RSD

SD

%RSD

(ppm)

18,96

14,36

43,79

6,431

19,06

M1

M2

M3

M4

M5

79,69

0,98

0,75

1,245

1,198

1,21

0,397

0,357

0,405

0,081

0,297

2,094

2,486

0,925

1,259

1,558

62,68

51,63

42,17

78,89

0, 625

0,322

0,497

0,734

0,63

211

M6

M7

M8

M9

41,70

51,13

77,66

64,63

0,435

0,845

0,283

0,435

1,043

1,653

0,364

0,673

6,045

11,42

17,93

15,03

1,159

0.248

0,171

0,292

1,917

2,172

0,954

1,943

Kết quả xác định SCR và ASP ở bảng 3 cho

thấy trong các mẫu phân tích đều có chứa SCR

và ASP với hàm lượng dao động trong khoảng

41,70 ÷ 79,69 ppm đối với SCR và 6,045 ÷

43,79 ppm đối với ASP. Các giá trị này đều

nằm dưới giới hạn cho phép của SCR và ASP

theo TCVN 2015 [6]. Kết quả phân tích cũng

cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) của

SCR và ASP trong các mẫu phân tích đều nhỏ

hơn 3%, điều đó chứng tỏ phép phân tích có độ

lặp tốt.

Để xác định độ đúng của phương pháp, chúng

tôi tiến hành xác định độ thu hồi bằng cách

thêm chuẩn 4mL ASP 113,5ppm và 4mL SCR

208,38ppm vào 10mL dung dịch mẫu phân

tích, định mức đến cùng thể tích và tiến hành

chạy sắc ký đồ trong các điều kiện thí nghiệm

đã lựa chọn, mỗi mẫu phân tích lặp lại 3 lần.

Kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 4.

Bảng 4. Kết quả xác định độ thu hồi của SCR và ASP

Mẫu

C_c(ppm)

(SAC)

M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

83,35

C_m(ppm)

(SAC)

79,69

62,68

51,63

42,17

78,89

41,70

51,13

77,66

64,63

C_m+c(ppm)

(SAC)

161,77 143,95 127,95 124,33 154,28 120,52 132,52 160,09 146,18

% Rev

98,48

45,40

97,50

45,40

91,56

45,40

98,57

45,40

90,45

45,40

94,56

45,40

98,85

45,40

99,15

45,40

97,84

45,40

C_c(ppm)

(ASP)

C_m(ppm)

(ASP)

18,96

14,36

43,79

6,43

19,06

6,05

11,42

17,93

15,03

C_m+c(ppm)

(ASP)

62,77

96,5

59,19

98,75

86,55

94,18

48,00

91,58

59,98

90,14

50,01

96,84

53,21

91,85

62,35

97,85

57,90

94,43

% ReV

Từ các kết quả phân tích cho thấy độ thu hồi

của phương pháp phân tích đối với các mãu

phân tích đềulớn hơn 90%. Điều đó chứng tỏ

phương pháp có độ đúng tốt.

99,12%; vitamin B12 có độ thu hồi từ 90,45%

đến 99,15%. Các kết quả xác định cho thấy

hàm lượng SCR và ASP trong một số mẫu đồ

uống đáp ứng tốt tiêu chuẩn Việt Nam [6].

TÀI LIỆU THAM KHẢO

4. KẾT LUẬN

Đã khảo sát và lựa chọn được điều kiện tối ưu

cho phép xác định SCR và ASP bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao; Các kết quả

xác định đồng thời SCR và ASP trong 09 mẫu

có sai số đối với ASP ≤2,486%, độ thu hồi từ

90,14% đến 98,75%; sai số của phép xác định

SCR ≤1,653% và độ thu hồi từ 90,44% đến

[1]. Ana Beatriz Bergamo, José Alberto

Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus

(2011), “Simultaneous determination of

aspartam, cyclamate, SCR and acesulfame – K

in soft drinks and tabletop sweetener

formulations by capillary electrophoresis with

capacitively coupled contractless conductivity

212

detection”, Food Chemistry, 124, pages 1714-

1717.

[2]. Agata Zygler, Andrzej Wasik, Agata Kot-

Wasik,

Jacek

Namieśnik

(2011),

“Determination

of

nine high-intensity

sweeteners in various foods by high-

performance liquid chromatography with mass

spectrometric detection”, Anal Bioanal Chem,

400:2159–2172.

[3]. Chui-Shiang Chang , Tai Sheng Yeh

(2014), “Detection of 10 sweeteners in various

foods by liquid chromatography/tandem mass

spectrometry”, Journal of food and drug

analysis , 22 (3) , 318 -328

[4]. Maja SERDAR, Zorka KNEŽEVIĆ

(2011), “Determination of artificial sweeteners

in beverages and special nutritional products

using

high

performance

liquid

chromatography”, Arh Hig Rada Toksikol, 62,

pages 169-173.

[5]. Shah, Romina and de Jager, Lowri S.

(2017), "Recent Analytical Methods for the

Analysis of Sweeteners in Food: A Regulatory

Perspective", Food and Drug Administration,

Papers. 5.

[6]. TCVN 10993 (2015), Thực phẩm-xác định

đồng thời chín chất tạo ngọt bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao sử dụng detector tán xạ bay hơi.

213