Tổng hợp vật liệu in dấu phân tử chọn lọc cho Rhodamine B, ứng dụng phân tích Rhodamine B trong thực phẩm

Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Số 44, 2020

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

VAN-TRONG NGUYEN, THANH-KHUE VAN, THANHTHUY TRAN, MINH-TU NGUYEN

Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

nguyenvantrong@iuh.edu.vn

Tóm tắt. Vật liệu polymer in dấu phân tử (MIP) chọn lọc cho rhodamine B (RhB) đã được tổng hợp bằng

phản ứng đồng trùng hợp giữa acrylamide (AM) và ethylenglycol dimethacrylate (EGDMA), với chất

khơi mào azobisisobutyronitrile (AIBN). Khả năng hấp thụ tối đa RhB đạt được là 8,7 mg/0,1g vật liệu

MIP. Tính chọn lọc của vật liệu MIP đối với RhB là 92,03 %, cao hơn so với tính chọn lọc trên phẩm màu

rhodamine 6G, sudan I, sudan II (lần lượt là 57,4 %, 6,55 % và 3,36 %). Qui trình phân tích RhB đã được

hiệu lực hóa trên nền mẫu thực phẩm nước ngọt, siro và bột ớt. Hiệu suất thu hồi đạt được từ 86,5 –

95,6 % cho mẫu nước ngọt, 81,8 – 95,6 % và 80,8 – 94,7 % cho mẫu bột ớt. Giới hạn phát hiện (LOD) và

giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 10 µg/L và 33 µg/L. Cuối cùng chúng tôi ứng dụng phân tích RhB

trong nền mẫu nước ngọt, siro và bột ớt, cả hai mẫu này đều không phát hiện RhB.

Từ khóa: Rhodamine B, MIP, HPLC.

SYNTHESIS OF MIP MATERIAL FOR RHODAMINE B SELECTION AND ITS

APPLICATION FOR RHODAMINE B ANALYSIS IN FOOD SAMPLES

Abstract. Molecularity imprinted polymer (MIP) selected for rhodamine B (RhB) was synthesized by the

co-polymerization reaction between acrylamide (AM) and ethylenglycol dimethacrylate (EGDMA) with

an initiator azobisisobutyronitrile (AIBN). The maximum absorbance of RhB on MIP is 0.87 mg/ 0.1 g

with the selectivity of 92.03%, which was higher than the Rhb absorbance on Rhodamine 6G, sudan I,

sudan II (57.4 %, 6.55 %, and 3.36 % respectively). This procedure for RhB analysis was implemented on

a number of food samples such as drinking water and chilli powder, with sample preparation by MIP and

sample analysis employing HPLC. Recovery yield was found to be 86.5-95.6% for a drinking water

sample and 80.8-94.7 % for chilli powder sample. The method detection limit (MDL) and method

quantitative limit (MQL) were 10 ppb và 33 ppb respectively.

Keyword. Rhodamine B, MIP, HPLC.

1 GIỚI THIỆU

Rhodamine B được biết đến là một thuốc nhuộm tổng hợp có màu hồng, được sử dụng chủ yếu trong lĩnh

vực nhuộm vải sợi.Thuốc nhuộm rhodamine B phát huỳnh quang, do đó có thể phát hiện dễ dành

bằng huỳnh quang kế, nó được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghệ sinh học như kính hiển vi

huỳnh quang, quang phổ huỳnh quang tương quan, phân tích dòng chảy tế bào và ELISA [1]. Trước sự

phát triển ngày càng cao, nhu cầu đời sống của con người, ngoài ăn no mặc ấm thì nhu cầu ăn ngon mặc

đẹp ngày càng được người ta chú trọng và quan tâm nhiều. Nắm bắt được thị hiếu đó của người tiêu dùng,

các cơ sở chế biến thức ăn đã sản xuất ra nhiều thực phẩm màu sắc sặc sỡ, bắt mắt và rất thu hút. Đi kèm

theo màu sắc sặc sỡ ấy là hiểm hoạ rủi ro tiềm ẩn đối với sức khoẻ người tiêu dùng. Để sản xuất ra nhiều

sản phẩm bắt mắt đó các cơ sở sản xuất sử dụng nhiều loại phẩm màu công nghiệp, các phẩm màu này

được mua dễ dàng, giá rẻ so với phẩm màu tự nhiên được sử dụng trong thực phẩm. Trong nhiều phẩm

màu công nghiệp thì phẩm màu rhodamine B thường được sử dụng do có màu sắc thoả mãn các tiêu chí

như màu bắt mắt, sặc sỡ cho các sản phẩm như hạt dưa, bột ớt, ruốc, tương ớt…. Phẩm màu công nghiệp

nói chung, rhodamine B nói riêng gây độc hại đối với con người và không có tên trong danh mục phụ gia

thực phẩm do Bộ y tế ban hành [2-3]. Rhodamine B tích luỹ trong cơ thể con người sẽ gây ra tác hại cho

gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như gây ra bệnh ung thư [4]. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy

rằng khi thử nghiệm trên chuột và rhodamine B được kết luận là nguyên nhân gây ung thư [1, 5]. Gần

đây, báo đài liên tục phát hiện các cơ sở sản xuất ở TP.HCM sử dụng phẩm màu công nghiệp cho gia vị,

6

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

thực phẩm và các loại thuốc đông y… có những thời điểm 80% mẫu bột ớt bị nhiễm rhodamine B ở các

tỉnh trên cả nước, cá biệt có những tỉnh bị nhiễm 100% [6].

Trước thực trạng đó thì yêu cầu về xử lý mẫu để xác định hàm lượng rhodamine B trong mẫu thực phẩm

đang được quan tâm. Hiện tại cách xử lý mẫu đang được sử dụng rộng rãi là chiết mẫu với dung môi

methanol sau đó lọc dịch chiết nhưng cách xử lý này không loại bỏ được nền mẫu phức tạp. Hay người ta

còn dùng kỹ thuật chiết pha rắn SPE, QuEChERS, MSPE … tuy có thể loại được một phần nền mẫu

nhưng độ chọn lọc không cao [7-8]. Để hạn chế các nhược điểm của các phương pháp trên thì kỹ thuật

chế tạo vật liệu in dấu phân tử MIP (Molecularly Imprinted Polymers) là kỹ thuật mới nổi thu hút được sự

quan tâm của các nhà nghiên cứu bởi độ chọn lọc cao với một nhóm hợp chất góp phần rút ngắn thời gian

xử lý mẫu đồng thời giảm thiểu được ảnh hưởng của nền mẫu đặc biệt với các nền mẫu phức tạp. Gần

đây, có nhiều nghiên cứu đã tổng hợp thành công vật liệu MIP để ứng dụng phân tích rhodamine trong

nền mẫu bột ớt [2], trong nền mẫu thực phẩm [4]. Những nghiên cứu trên đã có kết quả nghiên cứu với độ

tin cậy cao đáng khích lệ, tuy nhiên vẫn chưa ứng dụng vật liệu để phân tích rhodamine B cho nhiều nền

mẫu khác nhau.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp vật liệu MIP chọn lọc cho rohdamine B. Vật liệu này được

đánh giá các đặc tính như khả năng hấp phụ của vật liệu, tính chọn lọc... và được áp dụng để xử lý trên

mẫu thực phẩm nước ngọt, siro và bột ớt.

2 THỰC NGHIỆM

2.1 Thiết bị và hóa chất



Các hóa chất rhodamine B, rhodamine 6G ≥ 99.0 %, acrylamide, ethylene glycol dimethacrylate,

sodium 1-heptanesulfonate và 2,2′-azobis(2-methylpropionitrile) được mua của Sigma-Aldrich.

Dung môi methanol (MeOH), ethanol, n-hexane, acetone và acetic acid băng loại chuẩn sử dụng

cho HPLC của hãng Merck. Các hóa chất khác được sử dụng đều đạt chuẩn phân tích. Nước cất

được sử dụng là loại không ion và có điện trở lớn hơn 18.5 MΩ.

Máy HPLC của Agilent Technologies 1260 Infinity. Với cột tách RP-C18 (5μm, 4,60 mm × 250

mm) và đầu dò DAD.



Máy đo quang Thermo Scientific Evolution 600 UV-VIS.

Máy đánh siêu âm.

Cân phân tích Sartorius TE214S

Hệ thống chiết Soxhlet.

Tủ sấy tủ sấy Shellab.

Máy cất nước không ion Thermo Scientific Barnstead Easypure II.

Các dụng cụ thủy tinh khác.

2.2 Tổng hợp vật liệu MIP và NIP

2.2.1 Quy trình tổng hợp

Quá trình tổng hợp vật liệu MIP bằng phản ứng giữa phân tử mẫu Rhodamine B (140 mg) và monomer

chức năng AM (857 mg) trong 30 mL dung môi acetonitrile, đánh siêu âm trong 15 phút. Sau đó, thêm

o

1784 mg EGDMA, 1mL AIBN và 70mL ACN thực hiện phản ứng polymer hóa ở 70 C trong 10 giờ

trong bếp cách thủy, suốt quá trình này khí N₂được thổi liên tục. Sản phẩm được lọc, rửa qua với nước và

o

methanol (1:1), sấy khô ở 60 C trong 4 giờ. Cuối cùng đem nghiền và rây với kích thước 100 µm. Vật

liệu không in dấu (NIP) được thực hiện theo quy trình tương tự nhưng không sử dụng phân tử mẫu

Rhodamine B.

2.2.2 Loại bỏ phân tử mẫu

Sau khi tổng hợp MIP và NIP, các thành phần còn dư sau phản ứng và phân tử mẫu đã in được loại bỏ

hoàn toàn bằng chiết Soxhlet với dung môi methanol trong 12 giờ, quá trình này được thực hiện đến khi

chiết hết phân tử mẫu ra khỏi MIP, sử dụng thiết bị UV-VIS ở bước sóng 400 – 600 nm để kiểm soát quá

trình. Cuối cùng đem sấy khô ở nhiệt độ 60⁰C trong tủ sấy.

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

7

2.2.3 Đánh giá tính chất của vật liệu

Để chứng minh hình thái và cấu trúc của vật liệu đã tổng hợp thành công, mẫu vật liệu được đo phổ hồng

ngoại và chụp ảnh SEM.

0

Đo phổ hồng ngoại (FT-IR): Vật liệu MIP và NIP được sấy ở 60 C trong 4 giờ, sau đó trộn với KBr rắn

đã sấy khô ở 120 ⁰C trong 4 giờ và ép thành viên có đường kính 10 mm, bề dày từ 1÷2 mm.

Đo kích thước hạt (SEM): Mẫu MIP và NIP được chụp tại Viện công nghệ Hóa học - VAST bằng thiết bị

kính hiển vi điện tử quét (SEM) để đánh giá hình dạng và kích thước hạt của vật liệu.

2.2.4 Đánh giá khả năng hấp phụ của vật liệu đối với phân tử mẫu

Cân chính xác 0,1 g vật liệu MIP và NIP sau khi đã loại bỏ hoàn toàn phân tử mẫu vào 2 ống SPE loại

dung tích 3 mL. Rửa cột bằng nước rồi bằng MeOH, cho dung dịch chứa rhodamine B với 3 nồng độ khác

nhau 0,6 mg/L; 1,0 mg/L và 1,4 mg/L. Sau đó rửa tạp chất bằng 10 mL nước cất và rửa giải bằng MeOH,

dung dịch thu được định mức tới 50 mL đo quang tại 550 nm.

Tiến hành lập đường chuẩn của rhodamine B với nồng độ 0,2 mg/L; 0,4 mg/L; 0,8 mg/L; 1,2 mg/L; 1,6

mg/L; và 2,0 mg/L đo trên máy Thermo Scientific Evolution 600 UV-VIS ở 550 nm.

2.2.5 Đánh giá khả năng chọn lọc của MIP đối với phân tử mẫu

Cân chính xác 0,1 g vật liệu MIP và NIP sau khi đã loại bỏ hoàn toàn phân tử mẫu vào 2 ống SPE loại

dung tích 3 mL. Rửa cột bằng nước rồi bằng MeOH, cho dung dịch chứa rhodamine 6G; sudan I và sudan

II với 3 nồng độ khác nhau 0,5 mg/L; 1,0 mg/L và 2,0 mg/L. Sau đó rửa tạp bằng 10 mL nước cất và rửa

giải bằng MeOH, dung dịch thu được định mức tới 50 mL đo quang tại 550 nm. Tiến hành lập đường

chuẩn của rhodamine 6G với nồng độ 0,2 mg/L; 0,4 mg/L; 1,0 mg/L; 1,4 mg/L; và 2,0 mg/L đo ở 527 nm,

của sudan I với nồng độ 0,5 mg/L; 1,0 mg/L; 1,5 mg/L; 2,0 mg/L và 2,5 mg/L đo ở 494 nm, của sudan II

là 0,2 mg/L; 0,4 mg/L; 1,0 mg/L; 1,4 mg/L; và 2,0 mg/L đo ở 494 nm.

2.3 Ứng dụng vật liệu MIP xử lý mẫu, phân tích bằng HPLC

2.3.1 Lập đường chuẩn Rhodamine B bằng HPLC

Đường chuẩn rhodamine B được lập trong khoảng 0,1 đến 3,0 ppm với điều kiện cho HPLC như sau:



Cột RP- C18 (5ꢀm×4,6mm ×250mm)

Nhiệt độ cột tách 30 ⁰C

Bước sóng hấp thu 550 nm

Thể tích mẫu 20 ꢀꢁ.

Pha động gồm 85 % ACN; 15 % nước với 0,005M sodium 1-heptanesulfonate, được điều chỉnh

pH tới 3,5 bằng acid H₃PO₄.

2.3.2 Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu nước ngọt hương dâu, bột ớt và siro dâu là 3 loại mẫu thực phẩm sẵn có trên thị trường được chọn.

Cả 3 mẫu được xử lý bằng cách chiết rhodamine B có trong mẫu với dung môi MeOH, sau đó đun cách

thủy đến cạn rồi hòa tan bằng nước sau đó chiết SPE với vật liệu MIP. Rửa giải rhodamine B trong cột

chiết bằng MeOH định mức tới 50 ml bằng MeOH. Lọc qua màng lọc 0,45ꢀꢂ, sau đó dung dịch mẫu sẽ

được chuyển vào bộ phận mẫu của HPLC để tiến hành quá trình sắc ký. Mỗi mẫu được tiến hành thêm

rhodamine B chuẩn với 3 nồng độ khác nhau 0,2 mg/L; 0,8 mg/L và 2,2 mg/L.

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tổng hợp vật liệu MIP và NIP

Cơ chế tổng hợp MIP và NIP thông qua 3 giai đoạn, giai đoạn 1 xảy ra phản ứng liên kết giữa monomer

chức năng AM và phân tử mẫu rhodamine B, đây là giai đoạn đánh dấu các vị trí liên kết cho việc bắt các

phân tử mẫu. Các liên kết hình thành chủ yếu là N:H – N, và O – H:O, đây là loại liên kết kém bền nên dễ

dàng có thể rửa giải phân tử mẫu. Giai đoạn 2, khi chất khơi mào quá trình polymer hóa AIBN và chất tạo

8

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

liên kết chéo EGDMA được thêm vào, dưới tác dụng của nhiệt độ thì AIBN phân hủy thành các gốc tự do

chúng tấn công và các liên kết đôi C=C của AM và EGDMA. Trong giai đoạn này oxy không khí đã được

đuổi đi bằng khí nitơ vì oxy cũng có khả năng tạo gốc tự do. Giai đoạn 3, gốc tự do hình thành từ AIBN

lan truyền trên mạch phản ứng và trở thành tâm phản ứng, chúng kích thích vào AM và EGDMA phản

ứng tiếp diễn trong 10h đến khi phản ứng kết thúc (không còn gốc tự do) sẽ tạo thành khối polymer. Đồng

thời trong quá trình tổng hợp dung môi ACN cũng bay hơi. Tất cả các giai đoạn này được thể hiện trong

hình minh họa (hình 1).

Hình 1. Hình minh họa in dấu phân tử Rrhodamine B

3.2 Đánh giá tính chất của vật liệu

3.2.1 Phân tích phổ FT-IR

Hình 2. Phổ FT – IR của vật liệu tổng hợp NIP (2A) và MIP (2B)

Kết quả phân tích vật liệu được thể hiện trong hình 2, với hình 2A là vật liệu không in dấu NIP, hình 2B

là vật liệu đã được in dấu MIP, trong đó có thể thấy được sự tương đồng của các tín hiệu đặc trưng của

vật liệu. Cụ thể, tín hiệu đôi là vân phổ hấp thụ đặc trưng dao động giãn bất đối xứng của liên kết N-H khi

có kể đến liên kết hydro ở ν = 3501 cm^-1(Hình 2A) và 3479 cm^-1(Hình 2B), tín hiệu này cũng có thể kể

đến dao động của nhóm -OH đã được cộng hưởng chồng lên phổ. Tín hiệu ở ν = 2971 cm^-1là dao động

đặc trưng cho liên kết C-H của gốc methyl trong phân tử EGDMA. Liên kết đôi C = C trong phân tử AM

chưa được rửa sạch nên vẫn còn xuất hiện trong phổ đồ ở ν = 1650 cm^-1và cũng phải kể đến liên kết uốn

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

9

N-H cũng có thể quan sát tại tần số sóng này. Liên kết C=O trong công thức của AM và EGDMA xuất

hiện với tín hiệu ở ν = 1713 cm^-1.

Các tín hiệu ở ν = 1257 cm^-1, 1389 cm^-11459 cm^-1và 754 cm^-1trong mẫu NIP là các dao động đặc trưng

,

của liên kết uốn bất đối xứng C-H trong nhóm methylene -CH₂. Ở vùng bức xạ này có sự khác biệt về

cường độ giữa MIP và NIP, nguyên do là mẫu MIP có in dấu các phân tử rhodamine B. Việc rửa các phân

tử này ra là không hoàn toàn, nên lượng rhodamine B còn tồn tại và len lỏi trong cấu trúc vật liệu dẫn đến

việc hấp thu lớn, dẫn đến việc chồng lên và che mất các mũi đặc trưng khác. Tại vùng sóng dưới 1000

cm^-1này là dao động của liên kết C=C trong vòng benzen thuộc phân tử rhodamine B [9-10].

3.2.2 Phân tích quét kính hiển vi điện tử SEM

Từ ảnh chụp SEM của vật liệu có thể xác định được kích thước hạt của vật liệu khoảng 0,2 – 0,3 m. Vật

liệu tổng hợp có các lỗ xốp lớn giúp gia tăng khả năng tải dung dịch mẫu qua cột, đặc biệt gia tăng diện

tích bề mặt vật liệu, từ đó có khả năng hấp phụ tốt, hình ảnh của vật liệu được thể hiện trong hình 3.

Hình 3. Ảnh chụp SEM của vật liệu MIP

3.3 Đánh giá khả năng hấp phụ của vật liệu đối với rhodamine B

Do nền mẫu khá đơn giản và phương pháp sử dụng UV-VIS có ưu điểm là nhanh và tiện lợi để định

lượng nên chúng tôi dùng phổ hấp thu UV-VIS để đánh giá khả năng hấp phụ của vật liệu của rhodamine

B. Kết quả trên phổ đồ của vật liệu cho thấy λ_max= 550 nm, và phương trình đường chuẩn ở bước sóng

này với R²= 0.9996 (hình 4) được sử dụng để định lượng rhodamine B.

Hình 4. Phổ hấp thu và đường chuẩn của Rhodamine B

Khả năng hấp phụ của MIP và NIP đối với phân tử mẫu rhodamine B được đánh giá bằng cách cố định

khối lượng MIP và NIP là 0,1 g, sau đó thay đổi hàm lượng rhodamine B tăng dần, các điều kiện khác sẽ

10

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

được duy trì giống nhau giữa các lần thí nghiệm. Kết quả thu được đã thể hiện như hình 5, trong đó đối

với MIP khả năng hấp phụ cực đại là 0,87 mg rhodamine B trên 0,1 g vật liệu, còn đối với NIP thì thấp

hơn nhiều 0,23 mg.

1.5

1.3

1.1

0.9

0.7

MIP

0.5

NIP

0.3

0.1

-0.1

0

0.5

1

1.5

mg Rhb lý thuyết

Hình 5. Khả năng hấp phụ của vật liệu MIP và NIP (mg RhB/0,1g MIP/NIP)

Kết quả cho thấy dung lượng hấp phụ của vật liệu là rất tốt, đặc biệt đối với vật liệu được in dấu phân tử.

Vấn đề này được giải thích là do kích thước hạt nhỏ, vật liệu xốp, nên hấp phụ cao, cấu trúc bền vững của

khung được tạo bởi EGDMA giúp bắt giữ tốt phân tử rhodamine B. Ngoài ra, NIP cũng có khả năng bắt

giữ phân tử rhodamine B vì chúng cũng có thành phần monomer chức năng AM trong cấu tạo. Các phân

tử khi đó có thể bắt giữ rhodamine B trên bề mặt hạt nhờ vào các liên kết hydro yếu. Do không in dấu

phân tử nên mẫu đã không thể len lõi sâu vào cấu trúc vật liệu được, chúng chỉ có thể bị bắt giữ một phần

trên bề mặt làm cho khả năng hấp phụ của vật liệu không cao.Tất cả các dữ liệu trên chứng minh rằng vật

liệu MIP mà chúng tôi tạo ra, có khả năng bắt giữ được phân tử mẫu rhodamine B.

3.5 Đánh giá khả năng chọn lọc của MIP đối với phân tử mẫu

OH

O

CH₃

O

H₃C

CH₃

N

O

N

CH₃

HCL

Cl^-

H₃C

N

H

O

N

CH₃

Rhodamine B

Rhodamine 6G

CH₃

Sudan I

Sudan II

Hình 6. Công thức cấu tạo của các hoạt chất khảo sát

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

11

Vì rhodamine 6G có công thức cấu tạo tương đồng với rhodamine B, và sudan I; sudan II là những hoạt

chất thường có trong nền mẫu nên chúng được chọn để làm các chất khảo sát đánh giá sự chọn lọc của

MIP và NIP đối với phân tử mẫu. Công thức cấu tạo được thể hiện trong hình 6.

Đối với 3 hoạt chất trên, chúng tôi tiến hành lập đường chuẩn với số liệu được thể hiện trong bảng 1, và

dựa vào các đường chuẩn này để kiểm soát hiệu suất thu hồi sau quá trình hấp phụ của vật liệu.

ꢍ_{ꢎꢏꢐ ꢑꢒꢓ ꢔꢐꢏ ꢕꢖꢗ}

ꢃꢄꢅ ꢆꢇꢈꢉ ꢉꢊꢇ ꢊꢋꢄ ꢌ

ꢛ ꢜꢝꢝ

ꢍ_{ꢗꢘꢙꢚꢕ ꢑꢒꢓ ꢔꢐꢏ ꢕꢖꢗ}

Bảng 1. Thông số phương trình đường chuẩn

Tên hoạt chất

Bước sóng

(nm)

550

Phương trình đường

chuẩn

y = 0,2079x + 0,0045

y = 0,1906x -0,0034

y = 0,0077x + 0,0169

y = 0,0472 – 0,0044

Hệ số tương quan

(R²)

Rhodamine B

Rhodamine 6G

Sudan I

0,9996

0,9999

0,9981

09973

527

494

Sudan II

92.03

MIP NIP

57.4

52.4

31.3

3.36

6.55

5.73

3.15

1

2

3

4

Hình 7. Khả năng chọn lọc của vật liệu MIP:

(1) Rhodamine B; (2) Rhodamine 6G; (3) Sudan I; (4) Sudan II

Sau khi đánh giá tính chọn lọc của MIP đối với hợp chất rhodamine B, rhodamine 6G, sudan I và sudan

II, có thể thấy được vật liệu in dấu MIP chọn lọc cao với chất đã in dấu là rhodamine B, còn các chất lạ

như sudan I và sudan II độ chọn lọc rất thấp. Tuy nhiên, đối với đồng phân như rhodamine 6G vẫn có

được mức chọn lọc trung bình, nguyên nhân có thể lý giải là do sudan I và sudan II là các phân tử lạ, có

cấu trúc phân tử khác biệt hoàn toàn với chất đã in dấu trong khuôn in là rhodamine B. Ở 2 chất này thiếu

đi các vị trí liên kết cần thiết để các tâm liên kết trên khuôn bắt giữ. Nhìn vào công thức cấu tạo thì vị trí

cần để nhận dạng phân tử bắt giữ phải có gốc –COOH và các liên kết hydro N:H – N thì phân tử lạ này

không đáp ứng được điều đó. Bên cạnh đó, khi xét đến tính chọn lọc với đồng phân của nó là rhodamine

6G thì tuy có cùng công thức phân tử nhưng công thức cấu tạo cũng như hình dạng không gian của phân

tử không còn giữ được như mẫu đã in nên việc nhận dạng sẽ bị bỏ sót dẫn đến hiệu suất không cao. Có

thể thấy 3 vị trí liên kết đã xác định, trong công thức cấu tạo rhodamine 6G đã mất đi một vị trí tại gốc –

COOH nhưng vẫn còn 2 vị trí tại N. Điều đó có thể lý giải tại sao MIP đã chọn lọc rhodamine 6G kém

hơn rhodamine B. Kết quả khảo sát trên NIP luôn cho hiệu suất thấp, cũng có thể giải thích như phần

trước đó, do các vị trí liên kết này chỉ có thể bắt giữ trên bề mặt và bắt giữ một số ít liên kết trong phân tử

khảo sát, cấu trúc lỗ trống tạo khuôn in cũng không được hình thành nên chúng không thể bắt giữ một

cách mạnh mẽ được. Các liên kết dùng bắt giữ phân tử khảo sát chỉ là liên kết hydro yếu nên khi trong

môi trường phân cực mạnh như H₂O có thể bị phá vỡ. Đây cũng là lý do vì sao chọn dung môi methanol

12

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

để phá vỡ các liên kết hydro rửa giải các phân tử mẫu ra khỏi khuôn đã in [9-10].

3.6. Ứng dụng phân tích mẫu

3.6.1. Lập đường chuẩn xác định rhodamine B bằng HPLC

Để xây dựng phương pháp xác định rhodamine B trên thiết bị HPLC, chúng tôi tiến hành tối ưu thông số

của phương pháp như thành phần pha động, pH của pha động, LOD, LOQ, RSD và khoảng tuyến tính. Để

khảo sát đối với pha động, 3 hệ khác nhau đã được lựa chọn [5]: pha động thứ nhất gồm 85% ACN -

15% nước với 0,005M sodium 1-heptanesulfonate, được điều chỉnh pH tới 3,5 bằng acid H₃PO_4.; pha

động thứ hai gồm 85% MeOH-15% nước với 0,005M sodium 1-heptanesulfonate, được điều chỉnh pH tới

3,5 bằng acid H₃PO₄; pha động thứ ba gồm 85% ACN - 15% nước với 0,005M triethyl amine, được điều

chỉnh pH tới 3,5 bằng acid H₃PO_4.Kết quả sắc ký đồ nhận đươc thì hệ pha động thứ nhất cho mũi sắc ký

đối xứng và có tín hiệu cao nhất, vì vậy hệ này được chọn cho các bước tiếp theo (hình 8).

Hình 8. Sắc ký đồ của pha động khảo sát

Các giá trị LOD và LOQ tiếp tục được khảo sát thông qua thao tác chạy phân tích 12 lần đường nền và

pha loãng chuẩn đến khi tín hiệu cao gấp 3 lần tín hiệu nền. Kết quả thu được giới hạn phát hiện là 0,01

mg/L (LOD), từ đó giới hạn định lượng được ước tính là 0,033 mg/L (LOQ). Khoảng tuyến tính được

khảo sát trên chất chuẩn từ 0,03 mg/L đến 5,00 mg/L (hình 9), kết quả cho thấy với rhodamine B tuyến

tính trong khoảng 0,033 đến 3 mg/L, với phương trình đường chuẩn là y = 439,86x + 2,2899 (R²=

0,9997), trong đó: x là nồng độ rhodamine B; y là diện tích của mũi sắc ký tương ứng (hình 10). Kết quả

này có LOD và LOQ thấp hơn rất nhiều so với nghiên cứu khác [2].

1400

y = 439.86x + 2.2899

1200

R² = 0.9997

1000

800

600

400

200

0

1

2

3

4

Nồng độ Rhodamine B (mg/L)

Hình 9. Khảo sát khoảng tuyến tính

Hình 10. Đồ thị đường chuẩn của rhodamine B

3.6.2 Ứng dụng phân tích mẫu thực phẩm

Chúng tôi sử dụng 3 loại mẫu thông dụng trên thị trường và có khả năng bị lạm dụng rhodamine B làm

phẩm màu là nước ngọt hương dâu, siro dâu và bột ớt. Tiến hành trích ly rhodamine B bằng dung môi

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

13

MeOH với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, sau đó hỗn hợp được lọc và làm khô trên bếp cách thủy rồi hòa tan

lại bằng nước cất. Cho dung dịch này qua cột chiết SPE có chứa MIP, và tiến hành phân tích trên HPLC

theo điều kiện đã khảo sát ở mục 3.6.1. Kết quả cho thấy cả 3 mẫu trên đều không phát hiện rhodamine B

(hình 11, 12 và 13), sắc ký đồ cũng chỉ ra rằng nền mẫu sau khi xử lý sạch và không còn nhiều tạp chất.

Chúng tôi cũng thực hiện thêm chất chuẩn vào cả 3 nền mẫu trên và kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi nằm

trong khoảng 86,50 % đến 95,40 % (xem trong bảng 2). Điều này chứng tỏ cùng với vật liệu MIP, phương

pháp phân tích mà chúng tôi xây dựng là phù hợp để phân tích rhodamine B trong mẫu thực phẩm.

Bảng 2. Kết quả phân tích mẫu thực phẩm

Hàm lượng

rhodamine B có

trong mẫu thử

(mg/L)

Nồng độ của rhodamine B (mg/L)

Độ lệch

chuẩn

tương đối

RSD (%)

Hiệu suất thu

hồi (%)

Tên mẫu

Hàm lượng

Hàm lượng tìm

thấy

thêm vào

0,1786

0,1762

0,1732

88,40

88,00

86,50

0,2

1,14

Nước ngọt

hương dâu

0,7188

0,7202

0,7243

2,1035

2,0988

2,0868

0,1753

0,1635

0,1683

0,6986

0,7057

0,7116

2,0979

2,0972

2,1043

0,1696

0,1671

0,1617

0,700

90,00

90,50

95,60

95,40

94,80

87,60

81,80

84,10

87,30

88,20

89,00

95,40

95,30

95,60

84,80

83,50

80,80

87,50

87,10

87,90

94,70

94,20

93,80

Không phát hiện

0,8

2,2

0,2

0,8

2,2

0,2

0,8

2,2

0,32

0,44

3,46

0,96

0,16

1,64

0,46

0,48

Siro dâu

Không phát hiện

Bột ớt

Không phát hiện

0,6971

0,7029

2,0829

2,0716

2,0638

14

TỔNG HỢP VẬT LIỆU IN DẤU PHÂN TỬ CHỌN LỌC CHO RHODAMINE B,

ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH RHODAMINE B TRONG THỰC PHẨM

Hình 11. Sắc ký đồ phân tích mẫu siro dâu (1) mẫu thử;

(2) thêm chuẩn 0,2 mg/L; (3) thêm chuẩn 0,8 mg/L; (4) (2) thêm chuẩn 0,2 mg/L; (3) thêm chuẩn 0,8 mg/L; (4)

thêm chuẩn 2,2 mg/L. thêm chuẩn 2,2 mg/L.

Hình 12. Sắc ký đồ phân tích mẫu bột ớt (1) mẫu thử;

4 KẾT LUẬN

Vật liệu in dấu phân tử cho phân tử mẫu rhodamine B đã được chúng tôi tổng hợp thành công. Kết quả

thực nghiệm đã chứng minh vật liệu chế tạo là chọn lọc cao cho rhodamine B và đã được ứng dụng để xử

lý mẫu thực phẩm với hiệu suất thu hồi tốt (>85%). Kết quả thu được đã mở ra hướng ứng dụng vật liệu

in dấu phân tử và phương pháp phân tích chúng tôi đã xây dựng khi phân tích rhodamine B trong các mẫu

thực phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] N. Ozkantar, M. Soylak, M. Tuzen. Spectrophotometric detection of rhodamine B in tap water, lipstick, rouge,

and nail polish samples after supramolecular solvent microextraction. Turkish Journal of Chemistry, 2017, 41, 987 –

994.

[2] X. Liu, X. Zhang, Q. Zhou, B. Bai, and S. Ji. Spectrometric etermination of rhodamine b in chili powder after

molecularly imprinted solid phase extraction. Bull. Korean Chem. Soc., 2013, 34, 3381 – 3386.

[3] Quyết định 3724/2001/QĐ-BYT. Về việc ban hành quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng

trong thực phẩm.

[4] X. Su, X. Li, J. Li, M. Liu, F. Lei, X. Tan, P. Li, and W. Luo. Synthesis and characterization of core–shell

magnetic molecularly imprinted polymers for solid-phase extraction and determination of Rhodamine B in food,

Food Chemistry, 2015, 171, 292-297.

[5] Nguyen, T., Francis, M. B. Practical synthetic route to functionalized rhodamine dyes. Organic Letters, 2003, 5,

3245–3248.

[6] Trần Thanh Nga. Xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử

dụng detector UV, Luận văn cao học, Đại học Khoa học tự nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh, 2011.

[7] X. R. Qing, G. W. Chao, W. X. Bing, L. Q. Yan, and D. F. Yan. Determination of Rhodamine B in Condiment

by HPLC-FLD-DAD, China Condiment, 2013, 08.

[8] A. A. A. A. Bakheet, X. S. Zhu. Determination of Rhodamine B Pigment in Food Samples by Ionic Liquid

Coated Magnetic Core/Shell Fe3O4@SiO2 Nanoparticles Coupled with Fluorescence Spectrophotometry, Science

Journal of Chemistry, 2017, 5(1), 1-7.

Ngày nhận bài: 02/07/2019

Ngày chấp nhận đăng: 11/05/2020