Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Nanomelanin trên mô hình chuột mang khối ung thư được xạ trị

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA NANOMELANIN

TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI UNG THƯ ĐƯỢC XẠ TRỊ

Nguyễn Thị Lê Na¹, Nguyễn Lê Minh Trí¹, Ngạc Hoàng Dũng¹, Bùi Thị Vân Khánh¹

Từ Quang⁴, Nguyễn Thị Hiền³, Nguyễn Đình Thắng¹, Hồ Anh Sơn²

TÓM TẮT

Mục tiêu: Đánh giá khả n ăng bảo vệ t ế bào gan của nanomelanin ở m ức liều điều trị

40 mg/kg thể trọng trên mô hình chuột mang khối ung thư được xạ trị. Vật liệu và phương pháp:

Nghiên cứu thực nghiệm, hạt nanomelanin kích thước 80 - 200 nm; phương pháp phân tích mô

học, phân tích chỉ tiêu hóa sinh, sử dụng kỹ thuật RT-PCR để đánh giá mức độ biểu hiện gen

mã hóa CAT, GPx ở mô gan. Kết quả và kết luận: Nanomelanin mức liều điều trị 40 mg/kg thể

trọng làm giảm tình trạng viêm mô gan. Kích thước khối ung thư giảm 80% so với nhóm chứng

sau đợt điều trị (p < 0,01). Chỉ tiêu enzyme chức năng gan (AST) tăng nhẹ (p < 0,05), đồng thời

mức độ biểu hiện gen mã hóa các enzyme CAT, GPx tăng tương ứng 1,86 và 1,5 lần ở mô gan

sau xạ trị.

* Từ khóa: Nanomelanin; Melanin; Xạ trị ung thư.

Evaluation of the Ability of Nanomelanin to Protect Liver Cells on

Tumor-Bearing Mice Irradiated with X-ray

Summary

Objectives: To evaluate the ability of nanomelanin (40 mg/kg) to protect liver cells on tumor-

bearing mice irradiated with X-ray. Materials and methods: Experimental method, histological,

biochemical criteria, RT-PCR technique to evaluate the expression level of genes coding CAT

and Gpx in liver tissue. Results and conclusion: Nanomelanin with a dose of 40 mg/kg

reduces inflammation in liver tissue. Nanomelanin reduced 80% of tumor volume (p < 0.01) and

increased slightly AST level in blood (p < 0.05). The transcription levels of CAT and GPx were

increased 1.86 and 1.5 times, respectively, during radiation therapy.

* Keywords: Nanomelanin; Melanin; Radiation therapy.

¹Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

²Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y

³Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông

⁴Bộ môn - Khoa Tai Mũi Họng, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y

Người phản hồi: Hồ Anh Sơn ([email protected])

Ngày nhận bài: 16/4/2021

Ngày bài báo được đăng: 01/6/2021

25

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

ĐẶT VẤN ĐỀ

đồng thời quá trình trao đổi chất bình

thường trong gan sẽ bị ảnh hưởng [5].

Hiện nay, trong điều trị bệnh ung thư,

xạ trị và hóa trị là 2 ph ương pháp chính

được sử dụng. Tuy nhiên, tác dụng phụ

của 2 phương pháp này ảnh hưởng đến

tế bào thường, làm chết tế bào và tăng

sinh mô. Xạ trị có th ể gây ra các phản

ứng phụ cấp tính cũng như mạn tính và

có thể gây ra một loại ung thư khác (ung

thư thứ phát) cho bệnh nhân. Xạ trị hay

hóa trị thường trực tiếp phá hủy DNA và

sinh ra các gốc oxy hóa có hoạt tính cao

(ROS). Nồng độ c ủa ROS t ăng tiếp tục

phá hủy DNA làm thay đổi quá trình trao

đổi chất bình thường của tế bào, dẫn đến

làm chết tế bào và các mô bình thường

[1, 2].

Melanin là một hợp chất polymer tự

nhiên được tìm thấy trong hầu hết các

sinh vật sống, có hoạt tính kháng oxy hóa

và khả năng hấp phụ tia UV c ũng như tia

xạ mạnh. Tuy nhiên, đây là m ột polymer

sinh học có độ tan rất thấp, hoàn toàn

không tan trong nước và các loại dung

môi hữu cơ hay acid đặc, chỉ tan một

phần rất nhỏ trong môi trường kiềm [6].

Ở nghiên cứu trước, chúng tôi đã

thành công trong việc đưa melanin về

dạng hạt nano với kích th ước 80 - 200

nm để tăng tính tan và hoạt tính sinh học

[6]. Trong nghiên cứu này, trên mô hình

chuột bị ung thư được chiếu xạ, chúng tôi

bước đầu đánh giá ảnh hưởng của

nanomelanin lên các tế bào gan thông

qua các chỉ tiêu về mô học, hóa sinh và

sử d ụng kỹ thuật RT-PCR để kiểm tra

mức độ biểu hiện của gen mã hóa

enzyme GP-x, CAT trong mô gan. Đây là

2 enzyme đóng vai trò quan trọng trong

quá trình tiêu thụ các gốc tự do nội sinh

hay ngoại sinh. Mục tiêu c ủa nghiên cứu

nhằm: Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào

gan của nanomelanin trên mô hình chuột

mang khối ung thư được xạ trị.

DNA bị phá hủy và sinh ra ROS d ẫn

tới kích hoạt chuỗi các tương tác sinh học

thông qua sự hoạt hóa của nhiều nhân tố

phiên mã, các cytokine tiền viêm hay các

enzyme như NF-κB, IL-1 β, IL-6, TNFα,

SOD [3]. Việc sinh ra các cytokine tiền

viêm hay các nhân tố phiên mã này làm

tăng tiết enzyme, phân hủy chất nền

ngoại bào metalloprotease, đồng thời các

cytokine viêm có mặt trong sự phát triển

và di căn của tế bào ung thư [4]. Vì v ậy,

loại bỏ ROS sinh ra trong quá trình hóa trị

và xạ trị là m ột trong những yếu tố góp

phần làm giảm tác dụng phụ c ủa xạ trị.

Gan là một trong những cơ quan quan

trọng nhất, đóng vai trò sống còn trong cơ

thể, có chức năng loại bỏ chất độc ra khỏi

máu, đồng thời là nơi dự trữ năng lượng,

các enzyme và hormon quan trọng trong

cơ thể. Trong liệu pháp chiếu xạ đối với

bệnh nhân ung thư, gan là một trong

những cơ quan chịu ảnh hưởng mạnh

của tia xạ. Đặc biệt, khi chiếu xạ liều cao

sẽ gây hiện tượng xơ gan, viêm gan,

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu nghiên cứu

Động vật thí nghiệm và tế bào:

- Tế bào ung thư biểu mô liên kết

sarcoma 180 nuôi cấy trong môi trường

RPMI-1640 được bổ sung 10% huyết

thanh (FBS) và 1% penicillin/streptomycin

ở 37°C đặt trong tủ ấm 5% CO₂.

- Chuột Swiss 5 tuần tuổi (Viện Vệ sinh

Dịch tễ Trung ương cung cấp) được chia

26

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

thành 4 nhóm, mỗi nhóm 5 con: Nhóm 1 gây u được tiêm dung dịch nanomelanin

đối chứng sinh học (NIL); nhóm 2 gây u, (40 mg/kg thể trọng) trước khi chiếu xạ tia

không được điều trị (NC); nhóm 3 có gây X cường độ 6 Gy. Sau đó, tiêm thêm

u, được chiếu xạ (IR); nhóm 4 có gây u, 2 liều nanomelanin bổ sung sau chiếu xạ

được chiếu xạ, điều trị bằng nanomelanin 3 và 6 ngày với liều lượng không đổi.

(IR + MEL).

* Phương pháp phân tích mô học:

2. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp tạo dung dịch

nanomelanin:

Các mẫu mô gan chuột được lưu giữ

trong dung dịch formalin 10%, sau đó loại

canxi bằng acid formic và cố định trong

paraffin. Tiếp theo, các mô gan trong

paraffin được cắt lát mỏng cố định trên

lam kính tạo thành các tiêu bản. Sau đó,

nhuộm các mẫu mô bằng hematoxylin và

eosin trước khi quan sát dưới kính hiển vi.

*

Bột melanin (CAS Number: 8049-97-6;

hãng Sigma Aldrich, Mỹ) được hòa tan

trong dung dịch NaOH. Nanomelanin kích

thước 80 - 100 nm được tạo ra trong

nghiên cứu đã được công bố [6].

* Phương pháp RT-PCR:

* Phương pháp tạo khối u dưới da:

ARN tổng số được tách t ừ m ẫu mô

gan chuột thí nghiệm bằng kít tách ARN

(hãng Thermo Fisher Scientific, Mỹ) theo

hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó,

cDNA được tổng hợp từ ARN tổng số

bằng bộ kít tổng hợp cDNA (hãng Thermo

Fisher Scientific, Singapore). Phản ứng

RT-PCR đo bằng hệ thống LightCycler 96

(hãng Roche Diagnostics GmbH, Đức).

Các bản sao của gen mã hóa GPx và

CAT được định lượng bằng phản ứng

RT-PCR qua so sánh với số l ượng bản

sao của gen nội chứng GAPDH.

Được mô t ả trong nghiên cứu trước

[6]: Tạo khối u d ưới da b ằng cách tiêm

dưới da chuột dung dịch mang tế bào

sarcoma 180 ở n ồng độ 1,5 × 10⁶/ml.

Quan sát sự hình thành khối u. Khi kích

thước khối u khoảng 7 cm, tiến hành

chiếu xạ trong điều kiện có hoặc không

điều trị bằng dung dịch nanomelanin.

* Phương pháp chiếu xạ điều trị khối u

trên chuột:

Phát triển dựa theo nghiên cứu của

Agnieszka MP và CS (2019) [9]: Chuột đã

Bảng 1: Trình tự các cặp mồi của gen mã hóa các enzyme.

Tên Gen

Mouse GAPDH (F)

Trình tự (5’- 3’)

CCCATCACCATCTTCCAGGAGC

CCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC

AAGAAATCAAGGAGTTTGCAGG-

ATCCATTTCCACAGTGGGTG

AGGCGGGAACCCAATAG

Mouse GAPDH (R)

Mouse GP-x (F)

Mouse GP-x (R)

Mouse CAT (F)

Mouse CAT (R)

TTTTGCGTGTACCACTCTC

* Xử lý số liệu: Bằng phần mềm Student’s t-test.

27

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

1. Kết quả mô học và hình thái gan chuột

Bảng 2: Mức độ viêm gan của các nhóm chuột.

Mức độ viêm gan (%)

Nhóm chuột

Vừa

-

Nhẹ

-

Thoái hóa nhẹ tế bào gan

Không

NIL

NC

IR

-

60

20

-

40

60

-

20

-

IR + MEL

20

Không quan sát thấy khác biệt về mặt hình thái của gan giữa các nhóm chuột được

điều trị và không được điều trị nanomelanin. Phân tích đánh giá mô học của các mẫu

gan ở các nhóm chuột thấy có sự khác biệt giữa các nhóm được điều trị và không được

điều trị nanomelanin. Ở nhóm chuột được chiếu xạ (IR) mức liều 6 Gy, số lượng mẫu

xuất hiện viêm gan mức độ vừa chiếm 20%, mức độ nhẹ và có sung huyết là 80%.

Ở nhóm được tiêm nanomelanin mức liều 40 mg/kg thể trọng, mức độ viêm gan giảm

rõ rệt, chuột chỉ bị viêm gan mức độ nhẹ, các tế bào gan xuất hiện thoái hóa, số lượng

mẫu không bị viêm gan chiếm 20%. Trong khi đó, ở nhóm không được chiếu xạ,

chỉ gây u (NC), 100% chuột bị viêm gan mức độ vừa và nặng. Điều này cho thấy

nanomelanin mức liều điều trị 40 mg/kg thể trọng có tác dụng hạn chế tình trạng viêm gan.

2. Thay đổi trọng lượng, thể tích khối u trong quá trình điều trị

Hình 1: Chuột được gây u bằng sarcoma 180 ở lưng (A, B); Trọng lượng chuột thay

đổi theo thời gian trong quá trình điều trị (C); Thể tích khối u trong quá trình điều trị (D).

28

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

Theo dõi cân nặng và s ự phát triển này tương tự nghiên cứu trước đây của

của khối u trong 25 ngày điều trị

(hình 1C, D): Trọng lượng chuột tăng dần

cho đến sau ngày thứ 10, chuột được

chiếu xạ m ức liều 6 Gy. Sau chiếu xạ,

trọng lượng chuột ở nhóm IR và IR +

MEL giảm. Đến ngày thứ 15, trọng lượng

chuột tăng trở l ại. Kích thước khối u ở

nhóm NC tăng dần theo thời gian (hình 1D).

Kích thước khối u ở các nhóm chuột

chúng tôi khi sử d ụng nanomelanin trên

mô hình chuột gây khối ung thư phổi [6].

3. Kết quả phân tích các enzyme

chức năng gan

Đánh giá, phân tích và định lượng mẫu

máu của các nhóm chuột theo 2 chỉ s ố

men aspartate aminotransferase (AST)

hay còn gọi là glutamic-oxaloacetic

được chiếu xạ (IR và IR + MEL) đều giảm transaminase (GOT) và men alanine

so với nhóm NC.

aminotransferase (ALT) hay còn gọi là

glutamic-pyruvic transaminase (GPT).

Nồng độ AST và ALT được xem là dấu ấn

sinh học dễ nhận thấy trong việc đánh giá

chức năng sinh học của gan và tham gia

vào quá trình trao đổi chuyển hóa các

nhóm amino acid [7].

Sau ngày thứ 25, kích thước khối u ở

nhóm IR + MEL gi ảm 80% so với nhóm

NC (p < 0,01) và gi ảm 45% so với nhóm

IR (p < 0,05). Điều này cho thấy,

nanomelanin có tác dụng ức chế sự phát

triển của khối u sarcoma 180. Kết quả

Bảng 2: Chỉ số AST và ALT của các nhóm chuột.

Nhóm chuột

Enzyme

Đơn vị

NIL

NC

IR

IR + MEL

206,4 21,5

56,4 12,2

AST (GOT)

ALT (GPT)

U/l

253,1 20,2

66,6 12,3

175,6 24,3

41,8 10,3

163 45,6

49,3 7,4

Chỉ số AST ở nhóm NC, IR và IR + MEL đề u giảm so với nhóm NIL (p < 0,05), do

đây là các nhóm chuột đã bị gây u. Nhóm NC có chỉ số AST và ALT r ất thấp. Sau xạ

trị, nồng độ AST ở các nhóm IR và IR + MEL đều tăng so với nhóm NC (p < 0,05), tuy

nhiên nồng độ ALT không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm NC.

4. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện gen mã hóa các enzyme CAT, GPx ở

mô gan

Các mẫu gan ở các nhóm chuột được tách ARN, tổng hợp cDNA và s ử dụng kỹ

thuật RT-PCR để đánh giá ảnh hưởng của nanomelanin đến mức độ biểu hiện gen mã

hóa các enzyme CAT và GPx. Enzyme CAT (Catalase) là một protein có kích thước

240 kDa với 4 tiểu phần đơn vị bằng nhau, mỗi tiểu phần có kích thước 60 kDa. CAT

là một enzyme đóng vai trò kháng oxy hóa và có mặt ở mọi cơ quan của cơ thể sống.

Enzyme sử dụng sắt hoặc đồng như là m ột cofactor và xúc tác quá trình phân hủy

H₂O₂thành phân tử nước và oxy. Đây là một cơ chế quan trọng trong hàng rào bảo vệ

cơ thể sống chống lại các gốc tự do. GPx là m ột enzyme nội bào có khả năng phân

29

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

hủy H₂O₂và lipid peroxides thành các gốc rượu tương ứng ở ty thể, đôi khi ở cytosol.

CAT và GPx là 2 enzyme có vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cơ thể trước ảnh

hưởng của các gốc tự do nội sinh hay ngoại sinh [8, 9].

Hình 2: Ảnh hưởng của nanomelanin đến tăng mức độ

biểu hiện gen của CAT và GPx ở các mẫu gan.

hóa trong cơ thể chuột sau quá trình

chiếu xạ.

Sau quá trình chiếu xạ, các gen mã

hóa 2 enzyme CAT và GPx đều tăng

đáng kể so v ới nhóm chứng (p < 0,01),

nguyên nhân do quá trình chiếu xạ phá

hủy DNA của tế bào tạo nên rất nhiều gốc

tự do (ROS). Các gen mã hóa những

enzyme này tăng lên cho thấy cơ thể

đang phản ứng lại với việc tăng đột ngột

các gốc tự do sau chiếu xạ. Các enzyme

CAT và GPx được tổng hợp sẽ t ăng

cường các phản ứng tự bảo vệ cơ thể để

giảm thiểu tình trạng căng thẳng gây nên

bởi nồng độ ROS v ượt quá ngưỡng cân

bằng [10].

Trong những năm gần đây, vai trò của

melanin được nghiên cứu ở nhiều khía

cạnh. Các tiềm năng của melanin như

khả năng kháng oxy hóa, chống tan máu,

kháng ung thư có thể ứng dụng trong

dược phẩm [11]. Vai trò giảm tình trạng

viêm gan khi kết hợp với hạt nano vàng là

một tác dụng khác của melanin [12].

Kết quả nghiên cứu ban đầu đã chỉ ra

nanomelanin có khả năng làm giảm tình

trạng viêm gan và sự phát triển kích

thước khối u sarcoma 180 trên mô hình

chuột mang khối ung thư được xạ trị.

Tăng mức độ biểu hiện của các enzyme

CAT và GPx sau khi chiếu xạ có th ể là

một trong những lý do giúp cải thiện tình

trạng viêm gan ở các nhóm chuột được

điều trị bằng nanomelanin.

Ở nhóm IR + MEL, mức độ biểu hiện

gen mã hóa enzyme CAT và GPx tăng

tương ứng 1,89 và 1,5 lần so với nhóm IR

(p < 0,05). Điều này cho thấy nanomelanin

có khả năng bảo vệ các tế bào gan thông

qua việc làm tăng mức độ biểu hiện gen

mã hóa các enzyme có vai trò kháng oxy

30

Nguyen Thi Van Anh, Nguyen Dinh Thang.

Nanomelanin potentially protects the spleen

from radiotherapy-associated damage and

enhances immunoactivity in tumor-bearing

mice. Materials 2019; 12(10):1725.

KẾT LUẬN

Nghiên cứu bước đầu thử nghiệm khả

năng bảo vệ mô gan của hạt nanomelanin

kích thước 80 - 200 nm trên mô hình xạ

trị ung th

ư

ở

chuột nhắt trắng.

7. Sookoian S, Pirola CJ. Liver enzymes,

metabolomics and genome-wide association

studies: From systems biology to the

personalized medicine. World J Gastroenterol

2015; 21:711-725.

Nanomelanin mức liều 40 mg/kg thể trọng

có tác dụng giảm nhẹ mức độ tổn thương

của các tế bào gan. Đồng thời, khi chuột

được điều trị b ằng nanomelanin giúp

phục hồi nhẹ men gan AST (p < 0,05) và

tăng mức độ biểu hiện gen CAT, GPx

tương ứng 1,89 và 1,5 lần trong các tế

bào mô gan.

8. OM Ighodaroab, OA Akinloyeb. First line

defence antioxidants-superoxide dismutase

(SOD), catalase (CAT) and glutathione

peroxidase (GPx): Their fundamental role in

the entire antioxidant defence grid. Alexandria

Journal of Medicine. 2019; 54(4):287-293.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

9. Agnieszka Małgorzata Pudlarz, Ewa

Czechowska, Michał S Karbownik, Katarzyna

Ranoszek-Soliwoda, Emilia Tomaszewska,

Grzegorz Celichowski, Jarosław Grobelny,

Ewa Chabielska, Anna Gromotowicz-Popławska,

Janusz Szemraj. The effect of immobilized

antioxidant enzymes on the oxidative stress in

UV-irradiated rat skin. Nanomedicine. 2019;

15(1):166.

1. Travis LB, Hodgson D, Allan JM, Van

Leeuwen FE. Second Cancers. In: DeVita VT

Jr, Lawrence TS, Rosenberg SA, editors.

Cancer: Principles and practice of oncology.

8^thedition. Philadelphia: Lippincott Williams

and Wilkins4. Conklin KA. Chemotherapy-

associated oxidative stress: Impact on

chemotherapeutic effectiveness. Integr Cancer

Ther 2004; 3(4):294-300.

10. Úrsula Muñoz Morón, Inma Castilla-

Cortázar. Protection against oxidative stress

and IGF-I deficiency conditions. Antioxidant

Enzyme. Mohammed Amr El-Missiry,

IntechOpen 2012. DOI: 10.5772/51047.

2. Ewald JA, Desotelle JA, Wilding G,

Jarrard DF. Therapy-induced senescence in

cancer. J Natl Cancer Inst 2010; 102(20):

1536-1546.

3. Sonis ST. The pathobiology of mucositis.

Nat Rev Cancer 2004; 4(4):277-284.

11. Noura El-Ahmady El-Naggar, Sara M

El-Ewasy. Bioproduction, characterization,

anticancer and antioxidant activities of

extracellular melanin pigment produced by

newly isolated microbial cell factories

4. Pico JL, Avila-Garavito A, Naccache P.

Mucositis: Its occurrence, consequences, and

treatment in the oncology setting. Oncologist

1998; 3(6):446-451.

Streptomyces

glaucescens

NEAE-H.

5. Tetsuo Nakajima, Yasuharu Ninomiya,

Mitsuru Nenoi. Radiation-induced reactions in

the liver-modulation of radiation effects by

lifestyle-related factors. International Journal

of Molecular Science 2018; 19(12):3855.

Scientific Reports 2017; 7:42129. DOI:

10.1038/srep42129.

12. Mohamed Anwar K Abdelhalim, Sherif

A Abdelmottaleb Moussa, Huda AY Qaid,

Mohammed Suliman Al-Ayed. Effect of melanin

on gold nanoparticle-induced hepatotoxicity

6. Nguyen Thi Le Na, Sai Duc Loc, Nguyen

Le Minh Tri, Nguyen Thi Bich Loan, Ho Anh

Son, Nguyen Linh Toan, Ha Phuong Thu,

Hoang Thi My Nhung, Nguyen Lai Thanh,

and lipid peroxidation in rats. Int

Nanomedicine 2018; 13:5207-5213.

J

31