Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen

ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

Triệu Tiến Sang¹, Trần Văn Khoa¹, Nguyễn Thanh Tùng²

Lê Thị Thu Hiền³, Hoàng Xuân Cường⁴, Trần Ngọc Thảo My⁵

¹BM Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y

²Viện Mô phôi và lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y

³Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội

⁴Phòng Khoa học Quân sự, Học viện Quân y

⁵Khoa Khoa học và Kỹ thuật, Trường Đại học Sorbonne, Pháp

TÓM TẮT

được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1

Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận liên quan đến bệnh. Sau đó, chúng tôi ứng dụng quy

(X-ALD) là một bệnh lí di truyền lặn liên kết giới trình này cho các mẫu tế bào phôi sinh thiết của gia

tính hiếm gặp làm rối loạn chức năng tuyến thượng đình có tiền sử mắc bệnh nhằm sàng lọc các phôi

thận, dây thần kinh tủy sống và chất trắng của hệ không mang alen gây bệnh loạn dưỡng não chất

thần kinh. eo các thống kê về dịch tễ học, bệnh trắng. Kết quả của nghiên cứu cho thấy đã có thể

lí này gây ảnh hưởng đến 1 trên 15000 người, tuy phát hiện được alen đột biến ở 5/8 phôi (62,5%) và

nhiên, tỷ lệ mắc bệnh trong thực tế được ước tính là 3 phôi còn lại (37,5%) không mang alen đột biến

cao hơn nhiều nhờ vào việc áp dụng kết hợp các kĩ nên 3 phôi này tiếp tục được sử dụng trong các bước

thuật hiện đại giúp chẩn đoán sớm bệnh. Khả năng sàng lọc tiền làm tổ tiếp theo trong quá trình thụ

phát hiện ra bệnh ở thời điểm càng sớm sẽ giúp các tinh nhân tạo.

gia đình có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất

trắng xây dựng những phương án sinh con cũng ĐẶT VẤN ĐỀ

như chữa trị triệu chứng bệnh một cách chủ động

Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận

và an toàn. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi (X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD (MIM

xây dựng quy trình chẩn đoán sớm đột biến gây #300100)), là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc

bệnh ở giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ những thể X liên quan tới rối loạn quá trình β-oxi hóa tại

gia đình có tiền sử mắc bệnh nhưng mong muốn peroxisome. Bệnh do đột biến trên gen ABCD1 mã

sinh con khỏe mạnh. Bằng việc kết hợp sử dụng các hóa cho protein xuyên màng của peroxisome gây ra

phương pháp giải trình tự, đặc biệt là giải trình tự dẫn tới sự tích tụ quá mức những chuỗi axit béo rất

theo nguyên lí Sanger với việc thực hiện các phản dài (VLCFA - very long-chain faty acid; ≥ C22) ở

ứng PCR đơn cặp mồi, chúng tôi đã có thể xây dựng trong huyết tương và mô, bao gồm phần chất trắng

Ngày nhận bài: 19/10/2020

Ngày phản biện: 20/11/2020

Ngày chấp nhận đăng: 09/12/2020

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

0

17

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

ở não, tủy sống và vỏ thượng thận [2, 4]. Cho đến ảnh MRI não, xét nghiệm sinh hóa và phân tích di

thời điểm hiện tại, thế giới đã ghi nhận nhiều ca mắc truyền đều tồn tại một nhược điểm chung là đều

bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận xuất phát hiện ra người bệnh ở giai đoạn khá muộn [10].

hiện với tần suất tương tự giữa các quốc gia. Với tỷ Do vậy, hướng nghiên cứu nhằm xây dựng một quy

lệ mắc bệnh là khoảng 1 trên 14,700 trẻ sơ sinh (cả trình giúp chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm, đặc biệt

nam lẫn nữ), đây chính là hội chứng rối loạn liên ở giai đoạn tiền làm tổ, có thể giúp những gia đình

quan đến peroxisome phổ biến nhất từng gặp [9]. có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng có

Tuy nhiên, tỷ lệ thực tế của căn bệnh này chưa được cơ hội sinh con không mang gen gây bệnh và sinh ra

ước tính chính xác bởi hầu hết các khảo sát liên quan thế hệ sau một cách chủ động và an toàn.

đến bệnh đều được thực hiện ở Mỹ hoặc các nước

châu Âu, rất ít khảo sát được thực hiện tại châu Phi mang đột biến trên gen ABCD1 [8]. Đây là bệnh di

và châu Á, đặc biệt là vùng Trung Đông [1].

truyền do alen lặn trên nhiễm sắc thể X qui định và

Tất cả những bệnh nhân mắc chứng ALD đều

Loạn dưỡng não chất trắng thường được phân cho tới thời điểm này chỉ xác định được khoảng 5%

loại thành ba kiểu bệnh chính: X-ALD não, bệnh ca bệnh gây ra bởi các đột biến de novo. Gen ABCD1

lý thượng thận – tủy – rễ thần kinh (AMN), kiểu nằm ở gần cuối cánh dài của nhiễm sắc thế X: vị trí

chỉ có bệnh Addison [3]. Đây đều là những thể Xq2.8vàcóđộdài19.9kb baogồm10exon. ABCD1

bệnh với những triệu chứng có ảnh hưởng nặng nề mã hóa cho một loại protein xuyên màng cấu tạo từ

tới người mắc bệnh, đặc biệt là ở nam giới. Một số 745 amino axit được gọi là adrenoleukodystrophy

triệu chứng lâm sàng chung giữa ba thể bệnh này protein, hay ALDP (protein ALD). Protein này nằm

bao gồm thoái hóa hệ thần kinh (vận động, thị xuyên màng peroxisome thực hiện chức năng vận

giác,…) và suy giảm tuyến thượng thận khiến cho chuyển VLCFA-CoA từ tế bào chất qua màng vào

loạn dưỡng não chất trắng trở thành một căn bệnh bên trong bào quan để tham gia vào quá trình β-oxi

phát triển nhanh chóng, nghiêm trọng và chưa thể hóa. Những đột biến trên gen ABCD1 sẽ gây ảnh

xác định được một phác đồ điều trị dứt điểm thực hưởng trực tiếp tới protein ALD khiến cho protein

sự hiệu quả [2].

bị thay đổi về mặt cấu trúc cũng như số lượng khiến

Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán cho nó không thể thực hiện chức năng vận chuyển

bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận, bao từ đó gây tích tụ các chuỗi axit béo rất dài trong tế

gồm phương pháp chẩn đoán trước sinh và chẩn bào chất. Sự tích tụ này để lại ảnh hưởng tiêu cực tới

đoán sau sinh. Đối với phương pháp chẩn đoán tế bào, đặc biệt là các tế bào hệ thần kinh [3]. Chính

trước sinh, việc chọc dịch ối sau đó thực hiện một vì vậy, nghiên cứu tập trung vào phát hiện đột biến

số xét nghiệm di truyền có thể đưa ra chẩn đoán về trên gen ABCD1 nhằm chẩn đoán bệnh loạn dưỡng

tình trạng mắc bệnh của thai nhi, tuy nhiên đây là não chất trắng. Quy trình được xây dựng nhằm ứng

phương pháp xâm lấn gây ảnh hưởng tiêu cực đến dụng lên các mẫu phôi sinh thiết của những gia đình

sức khỏe người mẹ đồng thời phát hiện bệnh ở giai có tiền sử mắc bệnh X-ALD.

đoạn muộn [5, 6]. Ngoài ra, một số phương pháp

chẩn đoán sau sinh bao gồm việc sàng lọc ở trẻ sơ ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

sinh sử dụng kĩ thuật quang phổ khối kế tiếp (MS/ NGHIÊN CỨU

MS) để đo nồng độ 26:0-lyso-PC hay các kĩ thuật Đối tượng nghiên cứu

chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng như chụp

Mẫu máu của một cặp vợ chồng (vợ: N.T.T. –

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

18

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

26 tuổi; chồng: V.Đ.H. – 28 tuổi) có tiền sử gia biến dị hợp tử c.854G>C (p.Arg285Pro) trên exon

đình phía vợ có người mắc bệnh loạn dưỡng não 1 của gen ABCD1. Đồng thời, thực hiện quy trình

chất trắng. Tám mẫu phôi thụ tinh nhân tạo của xác nhận lại đột biến bằng cách khảo sát đột biến

cặp vợ chồng đó được nuôi cấy rồi sinh thiết, trên exon 1 gen ABCD1 trên hệ thống ABI 3500

trong đó 7 mẫu (TR1 – TR7) được sinh thiết vào Genetic Analyzer và đều cho kết quả giống với giải

ngày 5, 1 mẫu (TR8) được sinh thiết vào ngày 6. trình tự thế hệ mới. Đây là một đột biến lặn nên thể

Các mẫu được sinh thiết từ 3 đến 5 tế bào phôi đồng hợp tử mang 2 alen đột biến sẽ gây bệnh loạn

ngày 5 hoặc ngày 6, rửa phôi bằng dung dịch PBS dưỡng não chất trắng. Ngoài ra, theo thống kê trên

1X + 1% PVP, lấy tế bào phôi vào ống PCR 0,2 ml. ngân hàng dữ liệu đột biến gen ABCD1, đột biến

Tổng toàn bộ dung dịch cả tế bào và dung dịch c.854G>C chỉ được ghi nhận 2 lần trong quá khứ

môi trường là 4 µl.

nên đột biến được xác định ở bệnh nhân này có thể

Các loại mẫu sử dụng trong nghiên cứu đều được coi là xuất hiện lần thứ 3 trong lịch sử nghiên

được bảo quản ở nhiệt độ âm. Toàn bộ cam kết liên cứu về bệnh [7].

quan đến mẫu bệnh phẩm và mẫu tế bào phôi sinh

iết kế cặp mồi cho phản ứng PCR: Dựa vào kết

thiết cũng như hồ sơ, mô tả chi tiết về nghiên cứu đã quả giải trình tự của bệnh nhân N.T.T. cùng với trình

được xét duyệt và thông qua bởi Hội đồng đạo đức tự gen ABCD1 được tham khảo trên ngân hàng trình

trong nghiên cứu Y sinh học, Học viện Quân y.

Vật liệu

tự gen quốc tế GenBank, chúng tôi tiến hành thiết

kế cặp mồi đặc hiệu sử dụng công cụ NCBI Primer-

Hóa chất và trang thiết bị: bộ kit tách chiết BLAST và đặt tổng hợp cặp mồi tại hãng Integrated

G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON DNA Technologies (IDT), Hoa Kỳ. Cặp mồi nhận

Biotechnology – Hàn Quốc); bộ kit REPLI-g® được ở dạng bột đông khô, vì vậy khi sử dụng, mồi

Single Cell (QIAGEN – Đức); GoTaq Green sẽ được pha loãng bằng nước khử ion đến nồng độ

Mastermix 2X (dNTPs, Taq polymerase, MgCl₂, hoạt động là 10 µM.

buﬀer) (Promega – Hoa Kỳ); Agarose, TBE 1X,

Tách chiết ADN từ máu toàn phần: ADN

ethidium bromide, thang chuẩn ADN (100 bp – được tách chiết sử dụng bộ kit G-spinTM Total

1000 bp và 100 bp – 1500 bp) (Cleaver Scientiﬁc Extraction của iNtRON Biotechnology: 200 μl

– Anh); hệ thống trang thiết bị và máy móc đạt yêu máu toàn phần được cho vào ống ly tâm 1,5 ml;

cầu về kỹ thuật và an toàn phòng thí nghiệm tại thêm 200 μl BL Buﬀer, 20 μl Proteinase K, 5 μl

Labo thuộc Bộ môn Sinh học và Di truyền y học, RNase, trộn đều, ủ ở 56°C trong thời gian 15

Học viện Quân y.

Phương pháp

phút; thêm 200 μl EtOH 100%, trộn đều; chuyển

800 μl dung dịch từ ống ly tâm 1,5 ml vào cột lọc,

Giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột biến: ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút ở 25°C, đổ

Mẫu bệnh phẩm của người có tiền sử gia đình mắc dịch; chuyển hết toàn bộ dung dịch còn lại trong

bệnh loạn dưỡng não chất trắng (N.T.T.) sẽ được ống vào cột lọc và lặp lại bước trước đó; thêm 700

gửi đi giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột μl Buﬀer WA vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút

biến trên gen ABCD1. Sau khi có kết quả, mẫu sẽ trong 1 phút ở 25°C, đổ dịch; thêm 700 μl Buﬀer

được làm giải trình tự Sanger nhằm xác nhận lại đột WB vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1

biến đã được xác định bằng phương pháp NGS. Kết phút ở 25°C, đổ dịch; ly tâm 13000 vòng/phút

quả giải trình tự thế hệ mới đã phát hiện được đột trong 1 phút ở 25°C làm khô màng lọc, chuyển

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

0

19

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

cột lọc sang một ống ly tâm 1,5 ml mới; thêm 85 µl nước khử ion, 0,5 µl mỗi mồi, 4,0 µl dịch ADN

μl nước khử ion đã được ủ ở 56°C vào cột lọc, ủ tách chiết. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đơn

ở nhiệt độ phòng tối thiểu 5 phút, ly tâm 13000 cặp mồi sẽ được thể hiện ở phần kết quả của quá

vòng/phút trong 1 phút ở 25°C, thu ADN ở ống ly trình tối ưu phản ứng.

tâm 1,5 ml. ADN được đo nồng độ và giá trị A₂₆₀/

A₂₈₀để kiểm tra chất lượng bằng máy SpectraMax PCR và giải trình tự theo phương pháp Sanger: Sau khi

QuickDrop. xác định được nhiệt độ gắn mồi thích hợp, phản ứng

Phát hiện đột biến gen ABCD1 bằng phương pháp

Khuếch đại toàn bộ hệ gen của mẫu tế bào phôi sinh PCR sẽ được tiến hành với cặp mồi đã được thiết

thiết: Pha dung dịch D2 với tỷ lệ 33 µl Buﬀer DLB : 3 kế nhằm khuếch đại đoạn gen mang đột biến. Sản

µl DT 1M; spin nhẹ các ống chứa tế bào phôi sinh phẩm phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di kiểm

thiết và nhỏ lên thành mỗi mỗi ống 3 µl dung dịch tra và tinh sạch nhằm gửi đi giải trình tự Sanger để

º

D2; ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ 65 C trong khảo sát đột biến trên gen ABCD1. Quá trình này

vòng 10 phút; thêm vào mỗi ống 3 µl Stop Solution; đầu tiên sẽ được ứng dụng với mẫu ADN của người

spin nhẹ các ống và ủ tại nhiệt độ 4ºC trong vòng ít mẹ (N.T.T.) đã được làm giải trình tự NGS để so

nhất là 3 phút; chuẩn bị hóa chất khuếch đại hệ gen sánh kết quả, sau đó mới được ứng dụng lên các

theo tỷ lệ thể tích (cho một mẫu) như sau: 9 µl H₂O mẫu tế bào phôi sinh thiết.

sc, 29 µl REPLI-g Reaction Buﬀer, 2 µl REPLI-g sc

DNA Polymerase; thêm vào mỗi ống chứa mẫu tế KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

bào phôi 40 µl hóa chất khuếch đại hệ gen đã chuẩn Trình tự cặp mồi cho phản ứng PCR

bị rồi spin nhẹ, ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ

Chúng tôi thiết kế cặp mồi có độ dài là 18 base –

30ºC trong vòng 2 giờ; bất hoạt enzyme REPLI-g độ dài lí tưởng để sử dụng trong nghiên cứu. Đồng

sc DNA Polymerase bằng cách ủ mẫu tại nhiệt độ thời chúng tôi áp dụng một số tiêu chí để thiết

65ºC trong vòng 3 phút; mẫu ADN sau khi khuếch kế cặp mồi mong muốn như sau: kích thước sản

đại sẽ được pha loãng tới nồng độ hoạt động trong phẩm PCR < 500 bp, nhiệt độ nóng chảy (T_m) của

º

khoảng 2 – 20 ng/µl và kiểm tra nồng độ bằng máy mồi nằm trong khoảng từ 50 - 65 C, tránh lặp lại

SpectraMax QuickDrop. nhiều lần trong trình tự mồi dễ gây bắt cặp nhầm.

Tối ưu hóa phản ứng PCR: Dựa và nhiệt độ nóng Qua đánh giá các thông số, chúng tôi sàng lọc kết

chảy T_mcủa cặp mồi đã thiết kế, nghiên cứu thiết lập quả trên hệ thống và lựa chọn cặp mồi sao cho hợp

phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi với dải nhiệt lí. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ABCD1

º

độ dao động quanh giá trị T_m5 C với tổng thể tích mong muốn là ABCD1F và ABCD1R chúng tôi

là 25 µl với 12,5 µl GoTaq Green Mastermix 2X, 7,5 thiết kế sẽ được thể hiện ở bảng 1.

Bảng 1. Trình tự cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR dự tính.

Trình tự đoạn mồi

(F – Forward, R – Reverse)

Kích thước sản phẩm

PCR (bp)

Mã mồi

T_m(°C)

ABCD1F

ABCD1R

5’ - GTG TC CTC ACG GCC AAC - 3’

5’ - CTC CCT GCC ACA CGC TC - 3’

56,6

59

199 bp

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

20

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

º

Kết quả tách chiết ADN từ máu toàn phần và kết đến 58 C và từ 59 C đến 64 C, sau đó sản phẩm

quả khuếch đại toàn bộ hệ gen mẫu tế bào phôi PCR sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.

sinh thiết

Kết quả điện di sản phẩm PCR của phản ứng tối

Mẫu bệnh phẩm của người mẹ mang đột biến ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi ABCD1F và

º

(NT-ABCD1) sau khi tách chiết ADN và đo OD ABCD1R với dải gradient nhiệt độ từ 51 C đến

º

đạt nồng độ theo yêu cầu là 10,0 ng/µl với chỉ số 64 C được thể hiện ở hình 1.

A260/A280 là 2,0. Mẫu ADN này hoàn toàn đạt

chất lượng để được sử dụng trong các bước tiếp theo

của quy trình. Tám mẫu tế bào phôi sau khi được

sinh thiết được tiến hành khuếch đại toàn bộ hệ gen

và pha loãng với tỷ lệ thể tích 10 µl ADN : 200 µl

nước khử ion. Kết quả nồng độ ADN các mẫu tế

bào phôi sinh thiết sau khi được khuếch đại và pha

loãng được thể hiện ở bảng 2. Dựa vào bảng kết quả,

các mẫu tế bào phôi sinh thiết đã được khuếch đại

hệ gen thành công và nồng độ ADN đã đạt ngưỡng

phù hợp để được sử dụng cho các bước tiếp theo

trong chu trình.

Bảng 2. Kết quả nồng độ ADN sau khi khuếch đại toàn

bộ hệ gen các mẫu tế bào phôi sinh thiết.

Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của phản

Mã Nồng độ

Mã

mẫu

Nồng độ

(ng/µl)

º

ứng tối ưu với gradient nhiệt độ gắn mồi từ 51 C đến

ST

mẫu

(ng/µl)

º

64 C. M: ang chuẩn marker (100 bp).

1

2

3

4

TR1

23,5

5

6

7

8

TR5

TR6

TR7

TR8

18,5

20,3

21,2

19,4

Phân tích kết quả điện di sản phẩm phản ứng

PCR đơn cặp mồi trên gel agarose 2% (hình 1) cho

thấy chỉ có băng sản phẩm với kích thước như tính

toán xuất hiện tại nhiệt độ gắn mồi từ 59 đến 61ºC

– kích thước khoảng 199 bp. Kết quả điện di thu

được tại nhiệt độ gắn mồi 59ºC cho băng sáng rõ

nhất, không có sản phẩm phụ và chính vì vậy, nhiệt

TR2

TR3

TR4

21,0

21,6

19,7

º

Kết quả phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Quá trình tối ưu phản ứng PCR sử dụng

mẫu ADN của người mang gen gây bệnh (NT-

ABCD1) làm khuôn để khuếch đại đoạn gen

ABCD1. Dựa vào nhiệt độ nóng chảy của mồi

độ 59 C được lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi để

tiến hành phản ứng PCR cho các bước tiếp theo.

Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự kiểm tra

lại đột biến trên mẫu ADN của mẹ

Dựa vào nhiệt độ gắn mồi đã được xác định,

tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên đối tượng

là ADN của người mẹ mang alen đột biến (NT-

º

xuôi và mồi ngược tương ứng là 56,6 C và 59 C,

chúng tôi tiến hành hai phản ứng PCR độc lập với

º

dải gradient nhiệt độ gắn mồi lần lượt từ 51 C

ABCD1) với chu trình nhiệt như sau: 95 C trong

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

0

21

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

º

quả trình tự đoạn mang đột biến giống hệt với kết

quả giải trình tự bằng phương pháp NGS – nghĩa

là đều có thể phát hiện đột biến c.854G>C. Từ

đây chúng tôi kết luận đã xây dựng được quy trình

phát hiện đột biến trên gen ABCD1 liên quan đến

bệnh loạn dưỡng não chất trắng và sẽ ứng dụng

quy trình này lên tám mẫu tế bào phôi sinh thiết

đã có sẵn.

5 phút, 40 chu kỳ với 94 C – 30s, 59 C – 30s, 72 C

º

– 30s, 72 C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được

điện di trên gel agarose 2% trong 25 phút với cường

độ dòng điện trong khoảng 125V và nhuộm với

Ethidium bromide. Kết quả điện di sản phẩm PCR

của phản ứng này được thể hiện ở hình 2 cùng với

kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger.

Kết quả ứng dụng quy trình trên tế bào phôi sinh

thiết

Phản ứng PCR với thành phần và chu trình

nhiệt đã được sử dụng ở bước trước sẽ được áp

dụng cho ADN của 8 mẫu tế bào phôi đã khuếch

đại. Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel

agarose 2% và quan sát dưới ánh đèn tia UV như

hình 3.

Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm sau phản ứng PCR

với ADN của 8 mẫu tế bào phôi. M: ang chuẩn

marker (100 bp); (+): ADN mẫu NT-ABCD1;

TR1 – TR8: sản phẩm ADN sau khuếch đại

Kết quả điện di sản phẩm ADN của 8 mẫu tế bào

phôi sinh thiết nhằm nhân bản đoạn gen ABCD1

cho thấy phản ứng PCR đã khuếch đại thành công

đoạn gen mong muốn. Băng sản phẩm hiện lên sáng

và rõ ràng tại vị trí tương ứng với kích thước thang

chuẩn là khoảng 200 bp, chứng tỏ đoạn nhân lên

có kích thước là 199 bp phù hợp như tính toán ban

đầu. Từ đây, sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và giải

trình tự Sanger nhằm khảo sát đột biến c.854G>C

ở những mẫu phôi sinh thiết. Kết quả giải trình tự

được đọc bằng phần mềm BioEdit và được thể hiện

ở bảng 1.

Hình 2. Hình ảnh ứng dụng quy trình phát hiện đột

biến lên mẫu ADN NT-ABCD1. (A): Hình ảnh điện

di sản phẩm phản ứng PCR, M: ang chuẩn marker

(100 bp); (B): Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen

được khuếch đại bằng cặp mồi ABCD1F và ABCD1R

của mẫu NT-ABCD1

Qua hình ảnh điện di, sản phẩm ADN được

khuếch đại có kích thước đúng như dự kiến và

không xuất hiện băng sản phẩm phụ. Sau đó, sản

phẩm phản ứng PCR được tinh sạch và gửi đi giải

rình tự Sanger với cặp mồi thiết kế, và cho ra kết

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

22

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Bảng 1. Tổng hợp kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger cho ADN của 8 mẫu tế bào phôi TR1 – TR8.

Mã

mẫu

Kết quả

chẩn đoán

ST

Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger

Bình thường,

không mang gen

gây bệnh

1

TR1

Bình thường,

mang gen gây

bệnh

2

TR2

Bình thường,

mang gen gây

bệnh

3

TR3

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

0

23

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Bình thường,

mang gen gây

bệnh

4

5

6

TR4

TR5

TR6

Bình thường,

không mang gen

gây bệnh

Bị bệnh

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

24

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Bình thường,

không mang gen

gây bệnh

7

TR7

Bình thường,

mang gen gây

bệnh

8

TR8

Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger mang alen đột biến sẽ tiếp tục được làm các xét

cho thấy, trong tổng số 8 phôi sinh thiết sử dụng nghiệm sàng lọc tiền làm tổ (PGS - Preimplanta-

trong nghiên cứu, có 3 phôi (37,5%) không mang tion Genetic Screening) để đánh giá chất lượng

alen đột biến gây bệnh, 4 phôi (50%) mang alen phôi trước khi tiến hành thụ tinh nhân tạo. Đối

đột biến gây bệnh ở thể dị hợp và 1 phôi (12,5%) với mẫu ADN của các phôi TR1, TR5 và TR7

mang alen gây bệnh ở thể bán dị hợp tử. Điều đều có kết quả bình thường và không có alen gây

này đã chứng tỏ, những phôi mang alen gây bệnh bệnh sẽ được thực hiện giải trình tự theo phương

trong quá trình giảm phân hình thành giao tử đã pháp giải trình tự thế hệ mới để sàng lọc các bất

nhận được alen đột biến từ mẹ. Những phôi này thường về nhiễm sắc thể. Kết quả sàng lọc PGS

sẽ được đánh giá là không phù hợp để sử dụng cho 3 phôi không mắc bệnh loạn dưỡng não chất

cho quá trình chuyển phôi và những phôi không trắng được thể hiện ở hình 4.

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

0

25

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

đó ở phôi TR5 không phát hiện bất cứ bất thường

nào trên bộ 24 nhiễm sắc thể. Vì vậy, chúng tôi đưa

ra kết luận phôi TR5 có chất lượng tốt, phù hợp để

tiến hành chuyển phôi vào cơ thể người mẹ trong

quá trình thụ tinh nhân tạo.

KẾT LUẬN

Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen

ABCD1 liên quan đến bệnh loạn dưỡng não chất

trắng và đồng thời ứng dụng được quy trình phát

hiện đột biến gen nhằm chọn được phôi thụ tinh

nhân tạo không mang alen gây bệnh.

Tuy nhiên cần mở rộng thí nghiệm nhằm ứng

dụng quy trình cho các thành viên khác trong đại

gia đình giúp chẩn đoán bệnh cho các phôi của

các cặp vợ chồng khác bởi đột biến này có thể di

truyền cho nhiều thành viên từ đó luôn tồn tại khả

Hình 4. Kết quả giải trình tự thế hệ mới của quá trình

sàng lọc tiền làm tổ bộ nhiễm sắc thể của 3 mẫu tế bào

phôi. (A): Kết quả của mẫu TR1; (B): Kết quả của

mẫu TR5; (C): Kết quả của mẫu TR7

Với kết quả giải trình tự như trên, bằng việc sử năng sinh con mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng

dụng các công cụ tin sinh cũng như thống kê sinh mang đột biến c.854G>C. Cần nghiên cứu mở

học, có thể nhận thấy rằng cả hai phôi TR1 và TR7 rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho các

đều có bất thường về bộ nhiễm sắc thể, cụ thể hơn đột biến khác trên gen ABCD1 và có thể nghiên

phôi TR1 có bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể cứu mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình

số 11, còn phôi TR7 có bất thường về số lượng ở cho các đột biến liên quan đến các bệnh hiếm di

những nhiễm sắc thể 2, 4, 6, 8, 11, 11, 18, trong khi truyền đơn gen khác.

ABSTRACT

Establishment of the procedure to detect ABCD1 gene mutations related to X-linked

Adrenoleukodystrophy

Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare sex-linked recessive disorder that disrupts adrenal gland

function, the spinal nerves, and the white mater of the nervous system. According to recent epidemiological

statistics, this disease aﬀects 1 in 15,000 people, however, the actual incidence rate is estimated to be much

higher with the combined application of modern genetic techniques used for early diagnosis. e earlier the

diagnose of the disease, the safer and the more active for families with a history of X-ALD to develop plans

for childbirths and treatments of disease's symptoms. erefore, in this study, we developed an early pre-

implantation diagnosis process to help families with the background of having the disease but wish to have

healthy children. By combining the use of sequencing methods, especially Next-Generation Sequencing

(NGS) and Sanger sequencing with other molecular techniques such as PCR, we were able to develop a

procedure to detect mutations on the ABCD1 gene which is involved in the disease. We then applied this

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

26

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

procedure to the family's biopsied embryonic cells with the disease in order to screen for embryos that do

not carry alleles that cause X-ALD. e results of the study showed that we were able to detect mutant alleles

in 5/8 embryos (62.5%) while the remaining 3 embryos (37.5%) did not carry mutant alleles; therefore,

these 3 embryos could further be used in pre-implantation screening tests during in-vitro fertilization.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ashraﬁ M. R., M. Amanat, M. Garshasbi, R. Kameli, Y. Nilipour, M. Heidari, Z. Rezaei and A.

R. Tavasoli (2020), “An update on clinical, pathological, diagnostic, and therapeutic perspectives of

childhood leukodystrophies”, Expert Review of Neurotherapeutics, 20(1), pp. 65-84.

2. Engelen M., S. Kemp, M. De Visser, B. M. van Geel, R. J. Wanders and P. Aubourg (2012), “X-linked

adrenoleukodystrophy (X-ALD): clinical presentation and guidelines for diagnosis, follow-up and

management”, Orphanet journal of rare diseases, 7(1), pp. 51.

3. Kemp S. (2014), Molecular Genetics of X-linked Adrenoleukodystrophy, eLS, pp.

4.KempS.,I.C.Huﬀnagel,G.E.Linthorst,R.J.WandersandM.Engelen(2016),“Adrenoleukodystrophy–

neuroendocrine pathogenesis and redeﬁnition of natural history”, Nature Reviews Endocrinology, 12(10),

pp. 606-615.

5. Lan F., Z. Wang, L. Ke, H. Xie, L. Huang, H. Huang, X. Tu, D. Zheng, J. Zeng and H. Li (2010), “A

rapid and sensitive protocol for prenatal molecular diagnosis of X-linked adrenoleukodystrophy”, Clinica

Chimica Acta, 411(23-24), pp. 1992-1997.

6. Maier E. M., A. A. Roscher, S. Kammerer, K. Mehnert, E. Conzelmann and A. Holzinger (1999),

“Prenatal diagnosis of X‐linked adrenoleukodystrophy combining biochemical, immunocytochemical and

DNA analyses”, Prenatal Diagnosis: Published in Aﬃliation With the International Society for Prenatal Diagnosis

19(4), pp. 364-368.

7. Moser A. B., N. Kreiter, L. Bezman, S. E. Lu, G. V. Raymond, S. Naidu and H. W. Moser (1999),

“Plasma very long chain faty acids in 3,000 peroxisome disease patients and 29,000 controls”, Annals of Neurology:

Oﬃcial Journal of the American Neurological Association the Child Neurology Society, 45(1), pp. 100-110.

8. Mosser J., A.-M. Douart, C.-O. Sarde, P. Kioschisi, R. Feil, H. Moser, A.-M. Poustka, J.-L. Mandel

and P. Aubourgi (1993), “Adrenoleukodystrophy gene shares unexpected homology”, Nature, 361(pp. 25.

9. Turk B. R., C. eda, A. Fatemi and A. B. Moser (2020), “X‐linked adrenoleukodystrophy: Pathology,

pathophysiology,diagnostictesting,newbornscreeningandtherapies”,InternationalJournalofDevelopmental

Neuroscience, 80(1), pp. 52-72.

10. Zhu J., F. Eichler, A. Biﬃ, C. N. Duncan, D. A. Williams and J. A. Majzoub (2020), “e Changing

Face of Adrenoleukodystrophy”, Endocrine Reviews, 41(4), pp. 1-17.

|

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM SỐ 21/2021

0

27