Tổng hợp và biểu hiện protein Cas9 tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

TỔNG HỢP VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN CAS9 TÁI TỔ HỢP

TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

Hoàng Xuân Cường¹, Đỗ Như Bình²

TÓM TẮT

Mục tiêu: Tổng hợp nhân tạo gen mã hóa Cas9 bằng công nghệ Golden gate và biểu hiện

protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu thực

nghiệm, gen mã hóa protein Cas9 được tổng hợp bằng phương pháp Golden gate, biến nạp

vào vector pET52b và biểu hiện ở tế bào E. coli. Tinh sạch protein bằng sắc ký ái l ực Ni-NTA.

Kết quả: Tạo thành công dòng tế bào E. coli BL21(DE3) mang vector pET52b-Cas9 có khả

năng biểu hiện protein Cas9 tái tổ hợp ở pha tan. Thu nhận được protein Cas9 tái tổ hợp với

nồng độ 4,1 mg/ml và độ tinh sạch kiểm tra bằng SDS-PAGE đạt ≥ 98%. Kết luận: Đã tạo được

nguồn cung cấp protein Cas9 tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu trong lĩnh vực chỉnh sửa gen.

* Từ khóa: Protein Cas9 tái tổ hợp; Chỉnh sửa gen; Biểu hiện.

Synthesis and Expression of Recombinant Cas9 Protei n in

Escherichia Coli

Summary

Objectives: To artificially synthesize Cas9-encoding gene by Golden gate technology and to

express a recombinant protein in E. coli bacteria cells. Subjects and methods: An

experimental study, the gene encoding Cas9 protein was synthesized by Golden gate method,

transformed into pET52b vector, and expressed in E. coli cells. Purify proteins by Ni-NTA affinity

chromatography. Results: Successfully constructed E. coli BL21(DE3) cell line carrying

pET52b-Cas9 vector with a capable of expressing recombinant Cas9 protein insoluble phase.

Recombinant Cas9 protein was obtained at a concentration of 4.1 mg/mL, and the purity was

above 98% that verified by SDS-PAGE. Conclusion: Self-production and provided an abundant

source of recombinant Cas9 protein for research in the field of gene editing.

* Keywords: Recombinant Cas9 protein; Gene editing; Expression.

¹Học viện Quân y

²Ban Khoa học Quân sự, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y

Người phản hồi: Hoàng Xuân Cường ([email protected])

Ngày nhận bài: 05/5/2021

Ngày bài báo được đăng: 26/5/2021

17

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

SF370 được ứng dụng nhiều để điều

chỉnh chức năng gen, sửa chữa những

sai sót trong bộ gen của vi sinh vật [5, 7],

như làm đảo đoạn hoặc chuyển vị trí, tác

động đến vùng protein nhằm điều hòa

quá trình phiên mã, biến đổi di truyền

ngoại gen và hiển thị các locut gen mong

muốn… Trong nghiên cứu này, chúng tôi

tiến hành tổng hợp nhân tạo gen mã hóa

protein Cas9, biểu hiện trong tế bào vi

khuẩn E. coli và tinh sạch protein Cas9 tái

tổ h ợp, định hướng sử d ụng trong thiết

lập hệ thống CRISPR/Cas9 ứng dụng

trong lĩnh vực chỉnh sửa gen điều trị bệnh

lý di truyền.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong suốt thập kỷ qua, các kỹ thuật

thao tác DNA bộ gen dựa trên hoạt động

của enzyme endonuclease được sử

dụng rộng rãi như Zinc Finger Nucleases

(ZFNs) và Transcription Activator Like

Effector Nuclease (TALEN) [1]. Tuy nhiên,

các phương pháp này có quy trình thiết

kế và việc sử d ụng trong thực tế r ất

phức tạp, do đó tính ứng dụng không

cao, đặc biệt trong lâm sàng. Hiện nay,

nhiều nghiên cứu đã sử dụng thành công

kỹ thuật biến đổi DNA bộ gen dựa trên hệ

thống CRISPR/Cas [2, 3, 4]. Hệ thống

này dựa trên cơ chế “miễn dịch” của vi

khuẩn chống lại sự xâm nhiễm phân tử

DNA ngoại lai từ virus hoặc DNA plasmid

[6, 7]. Khác với hệ thống “miễn dịch” dựa

trên enzyme cắt giới hạn, hệ thống này

dựa trên phân tử RNA để nhận diện và

phá hủy DNA ngoại lai. Để b ảo vệ vi

khuẩn khỏi DNA ngoại lai, vi khuẩn cần

được gắn chèn một đoạn ngắn DNA

ngoại lai vào DNA bộ gen tại vùng trình tự

lặp lại (CRISPR - Clustered Regularly

Interspaced Short Palindromic Repeat)

[5]. Vùng trình tự này được phiên mã và

xử lý thành các đoạn RNA ngắn (gọi là

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu

- Gen mã hóa protein Cas9.

* Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên

cứu:

- Vật liệu: Chủng E. coli Top10 được

dùng để tách dòng gen mã hóa cho Cas9;

hệ vector pJET1.2, pET52b (hãng Thermo

Fisher Scientific, Mỹ) dùng để tách dòng

gen; các cặp mồi và các đoạn oligo để

tổng hợp các mảnh gen mã hóa cho

Cas9; cặp mồi pJET1.2-Forward và

pJET1.2-Reverse dùng để sàng l ọc chọn

dòng và giải trình tự.

crRNA-CRISPR-derived

RNA),

các

crRNA này liên kết với endonuclease Cas

để nhận diện DNA mục tiêu và cắt phân

tử DNA mục tiêu thông qua hoạt động

endonuclease của protein Cas [1, 5].

- Hóa chất: Các kít tinh sạch trực tiếp

sản phẩm PCR (hãng Thermo Fisher

Scientific, Mỹ), kít tinh sạch trên gel sản

phẩm PCR (hãng NEB, M ỹ); hóa chất

điện di EDTA High Ranger 1kb DNA

Gần đây, một công c ụ m ới dựa trên

Cas9 (Protein 9 có hoạt tính nuclease liên

quan đến CRISPR của vi khuẩn) có

nguồn gốc từ Streptococcus pyogenes

18

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

Ladder (hãng Norgen Biotek Corp, tối ưu sẽ chia trình tự gen cần tổng hợp

Canada), ExceLBand 50bp DNA Ladder;

enzyme T4 DNA ligase; hóa chất Western

blot; hóa chất điện di protein SDS-PAGE.

thành 5 vùng gen nhỏ với các điểm cắt

của enzyme giới hạn BsaI ở 2 đầu vùng

gen. Vector biểu hiện được lựa chọn là

pET52b. Trong đó, trình tự gen mã hóa

được chèn vào giữa 2 điểm cắt BamHI và

NotI. Cas9 tái tổ hợp là một protein dung

hợp với đầu N mang đuôi dung hợp Strep

II và đầu C mang đuôi dung hợp (His)10.

Các mảnh gen thành phần được đưa

vào phần mềm trực tuyến DNAWorks

(https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/)

để thiết kế các oligonucleotid thành phần.

- Thiết bị nghiên cứu: Máy chu kỳ nhiệt

96 mẫu (hãng Eppendorf, Đức); máy soi

chụp ảnh gel (hãng Gensnap, Mỹ); bộ

điện di DNA Horrizontal mini (hãng CBS

Scientific, Mỹ); máy quang phổ NanoDrop

2000 (hãng Thermo Fisher Scientific, Mỹ);

máy lắc ổn nhiệt DTU-2C (hãng Taitec,

Nhật Bản); tủ l ạnh sâu -20ºC và -80ºC

(hãng Sanyo, Nhật Bản)…

+ Tổng hợp và sàng l ọc mảnh gen

Cas9 bằng PCR: Các mảnh gen thành

phần tổng hợp từ các oligonucleotid được

thiết kế ở trên bằng kỹ thuật overlap PCR.

Sản phẩm PCR được tách dòng bằng

cách nối vào vector pJET1.2 và biến nạp

vào E. coli DH10b. Sau khi sàng lọc bằng

kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng khuẩn

lạc dương tính được nuôi cấy tách chiết

plasmid. Việc giải trình tự các plasmid

giúp lựa chọn được các dòng plasmid

mang trình tự mong muốn.

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công

nghệ Gen, Viện Nghiên cứu Y D ược học

Quân sự, Học viện Quân y.

- Thời gian nghiên cứu: 8/2019 -

9/2020.

2. Phương pháp nghiên cứu

* Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu

thực nghiệm.

* Kỹ thuật sử dụng:

- Tổng hợp gen mã hóa Cas9 bằng

công nghệ Golden gate:

+ Nối các mảnh gen thành phần vào

vector biểu hiện bằng công nghệ Golden

gate. Sản phẩm của phản ứng được biến

nạp vào E. coli BL21(DE3). Sau khi sàng

lọc bằng PCR khuẩn lạc, các dòng khuẩn

lạc được nuôi cấy, tách chiết plasmid

phục vụ việc giải trình tự như trên. Kết

quả giải trình tự cho phép lựa chọn được

dòng khuẩn lạc mang c ấu trúc biểu hiện

mong muốn.

+ Tối ưu trình tự gen: Dựa trên trình tự

gen Cas9 trên GenBank, sử d ụng công

cụ tìm kiếm chuỗi bắt cặp (BLAST) và

công cụ phân tích mã bộ ba hiếm

(GenScript) để tối ưu bộ ba mã hóa cho

chuỗi amino acid.

+ Thiết kế oligonucleotid để tổng hợp

gen nhân tạo: Do gen mã hóa Cas9 có

kích thước khá lớn (4.107 bp) nên sau khi

19

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

- Biểu hiện và tinh sạch protein Cas9 tái tổ hợp:

Hình 1: Sơ đồ thiết kế tối ưu điều kiện biểu hiện và tinh sạch protein Cas9 tái tổ hợp.

* Xử lý số liệu: Bằng các phần mềm Bioedit, Rare codon analysis, Codon optimization.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ

BÀN LUẬN

“Genscript Rare Codon Analysis Tools”.

Kết quả phân tích cho thấy giá trị CAI của

gen này đối với E. coli là 0,65. Như vậy,

có thể thấy trình tự gen mã hóa Cas9 tự

nhiên không thật sự phù hợp để biểu hiện

trong E. coli. Tiến hành tối ưu hóa trình tự

gen mã hóa Cas9 sao cho thích hợp để

biểu hiện trong E. coli t ại địa chỉ

https://eu.idtdna.com/CodonOpt. Sau khi

đã tối ưu hóa codon, trình tự m ới thu

nhận được phân tích lại bằng công cụ

“GenScript Rare Codon Analysis Tool”,

kết quả cho thấy giá trị CAI tăng lên 0,85.

Đồng thời, tỷ lệ sử dụng các codon hiếm

trong gen cũng giảm đáng kể, không còn

1. Kết quả t ổng hợp gen mã hóa

Cas9 bằng công nghệ Golden gate

* Tối ưu và thiết kế oligonucleotid tổng

hợp gen Cas9:

Do gen mã hóa Cas9 có nguồn gốc từ

Streptococcus pyogenes, khi được biểu

hiện trong E. coli có thể xảy ra hiện tượng

các codon hiếm không được dịch mã tốt

trong vật chủ mới. Để kiểm tra, trình tự

gen mã hóa cho Cas9 được lấy từ ngân

hàng GenBank (mã hiệu AAK33936.1)

và phân tích, kiểm tra b ằng công cụ

20

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

các codon có giá trị CFD < 30. Nh ư vậy, được chèn vào giữa 2 điểm cắt BamHI và

trình tự gen sau khi tối ưu phù hợp hơn

để biểu hiện trong tế bào E. coli. Do gen

mã hóa Cas9 có kích thước khá lớn

(4.107 bp) nên chia trình tự gen cần tổng

hợp thành 5 vùng gen nhỏ với các điểm

cắt của enzyme giới hạn BsaI ở 2 đầu

vùng gen.

NotI. Cas9 tái tổ hợp sẽ là một protein

dung hợp với đầu N mang đuôi dung hợp

Strep II và đầu C mang đuôi dung hợp

(His)₁₀. Điều này giúp đơn giản hóa quá

trình tinh sạch Cas9 tái tổ hợp bằng cách

sử dụng liên tiếp 2 loại sắc ký ái lực.

Thêm trình tự ái nhân dẫn đường ở đầu

C giúp protein có khả n ăng định hướng

và hoạt động được trong tế bào động vật.

Vector biểu hiện được lựa chọn là

pET52b, trong đó trình tự gen mã hóa

Hình 2: Trình tự mảnh gen Cas9 lý thuyết sau khi gắn vào vector pET52b.

Sử dụng phần mềm DNAworks thiết kế oligos tổng hợp 5 mảnh gen Cas9, kết quả

thu được: Mảnh Cas9.1 có 42 oligos, mảnh Cas9.2 có 40 oligos, mảnh Cas9.3 có 40

oligos, mảnh Cas9.4 có 40 oligos, mảnh Cas9.5 có 42 oligos. Các đoạn oligos được

đặt tổng hợp từ hãng Macrogen (Hàn Quốc).

21

2. Tổng hợp và sàng lọc mảnh gen Cas9 bằng PCR

Hình 3: Hình ảnh điện di kết quả khuếch đại từng phân đoạn gen Cas9.

M: HighRanger 1kb DNA Ladder (Norgen);

1: PD1; 2: PD2; 3: PD3; 4: PD4; 5: PD5; 6: Âm tính

Hình ảnh điện di xuất hiện 5 băng vạch kích thước 800 - 900 base, tương ứng kích

thước của 5 phân đoạn Cas9 đã thiết kế tổng hợp. Gen Cas9 đã thiết kế tối ưu được

tách dòng vào vector PJET 1.2 blunt. Tiến hành biến nạp vào E. coli DH10b và sàng

lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc.

Hình 4: Kết quả sàng lọc các phân đoạn gen.

A - Kết quả sàng lọc phân đoạn gen Cas9.1; A1: Maker; A22: Âm tính

B - Kết quả sàng lọc phân đoạn gen Cas9.2; B1: Âm tính; B12: Maker

C - Kết quả sàng lọc phân đoạn gen Cas9.3; C1: Âm tính; C12: Maker

D - Kết quả sàng lọc phân đoạn gen Cas9.4; D1: Âm tính; D12: Maker

E - Kết quả sàng lọc phân đoạn gen Cas9.5; E1: Âm tính; E12: Maker

22

Đã sàng lọc được 12 khuẩn lạc mang phân đoạn gen Cas9-1, 9 khuẩn lạc mang

phân đoạn gen Cas9-2, 13 khuẩn lạc mang phân đoạn gen Cas9-3, 13 khuẩn lạc mang

phân đoạn gen Cas9-4 và 12 khuẩn lạc mang phân đoạn gen Cas9-5.

Lựa chọn 2 dòng vector tái tổ hợp mang mỗi phân đoạn gen Cas9, sau tách chiết

được giải trình tự, kết quả: Mảnh 1, 3 và 5 có 2/2 dòng trình tự đúng thiết kế, mảnh 2,

4 có 1/2 dòng trình tự đúng thiết kế (1 dòng thiếu 1 nucleotide ở cuối trình tự).

3. Kết quả nối các mảnh gen thành phần vào vector biểu hiện pET52b bằng

công nghệ Golden gate

Các dòng plasmid mang mảnh gen thành phần và pET52b (đã được mở vòng bằng

BamHI và SacI) sẽ được trộn với nhau trong phản ứng có chứa đồng thời BsaI và T4

DNA ligase để tổng hợp bằng phương pháp Golden gate. Sản phẩm của phản ứng

sau đó được biến nạp vào E. coli BL21(DE3). Tiến hành sàng lọc bằng PCR khuẩn lạc,

khuếch đại với mồi T7 promotor và mồi ngược C9-1R.

Hình 5: Kết quả điện di kiểm tra gen Cas9 được nối từ 5 mảnh.

M: DNA ladder HighRange (Norgen)

Cas9: Sản phẩm PCR khuếch đại gen Cas9 (~4,3kb)

Kết quả điện di thu được 1 b ăng vạch duy nhất kích thước ~4,3kb. Chứng tỏ gen

Cas9 đã được nối thành công vào pET52b và biến nạp thành công vào tế bào vi khuẩn

BL21(DE3).

Lựa chọn 5 dòng pET52b-Cas9 để nhân dòng và gửi giải trình tự. Kết quả giải trình

tự cho thấy cả 5 dòng đều có trình tự đúng thiết kế ban đầu. Như vậy, qua 4 bước đã

tổng hợp thành công gen mã hóa protein Cas9 bằng công nghệ Golden gate mà không

cần thu thập nuôi cấy vi khuẩn Streptococcus pyrogen để phân lập protein Cas9. Đây

là phương pháp mới tạo được gen quan tâm mà không cần sự có mặt của mầm bệnh,

góp phần giảm chi phí nghiên cứu cũng như nguy cơ lây nhiễm mầm bệnh.

4. Kết quả biểu hiện và tinh sạch protein rCas 9 trong vi khuẩn E. coli

Ở điều kiện nuôi biểu hiện bổ sung 0,2 mM IPTG ở 30⁰C, qua đêm, vi khuẩn E. coli

cho hiệu suất sinh tổng hợp protein Cas9 tái tổ hợp cao nhất. Protein Cas9 tái tổ hợp

23

được xác nhận bằng phương pháp Western blot với kháng thể kháng 10xHis, tinh sạch

bằng sắc ký ái lực Ni-NTA và đánh giá độ tinh sạch bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE.

Hình 6: Kết quả tinh sạch protein Cas9 SDS-PAGE (A) và Western blot (B).

M: Ladder Gangnam Stain; 1: Dịch rửa giải sau khi tinh sạch;

2: Dịch trước khi tinh sạch; 3: Dịch sau khi qua cột; 4, 5: Dịch rửa

Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot cho thấy đã biểu hiện thành công cũng

như tinh sạch protein Cas9 tái tổ hợp với kích th ước khoảng 163 KDa (do gắn thêm

đuôi Histag). Lượng protein rCas9 thu được có nồng độ 4,1 mg/µl và độ tinh sạch ≥ 98%.

2. Chen B, et al. Dynamic imaging of

KẾT LUẬN

genomic loci in living human cells by an

Chúng tôi đã cấu trúc thành công

vector tái tổ h ợp mang gen Cas9

(pET52b-Cas9) mã hóa cho protein Cas9

optimized CRISPR/Cas system. Cell 2013;

155:1479-1491.

có nguồn gốc từ Streptococcus pyrogen;

tạo thành công dòng tế bào E. coli

BL21(DE3) mang vector pET52b-Cas 9

có khả năng biểu hiện protein Cas9 tái tổ

hợp ở pha tan và thu nhận được Cas9 tái

tổ h ợp với độ tinh sạch ≥ 98%. Đã tạo

được nguồn cung cấp Cas9 tái tổ h ợp

phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm

đánh giá hoạt tính endonuclease của

protein Cas9, hướng tới việc ứng dụng

phức hợp CRISPR/Cas9 trong y sinh học.

3. Cong L, et al. Multiplex genome

engineering using CRISPR/Cas systems.

Science 2013; 339(6121):819-823.

4. George M Church, et al. CRISPR-Cas9

system: Opportunity and concern. doi:10.1373/

clinchem.2016.263186.

5. Gilbert LA, et al. CRISPR-mediated

modular RNA-guided regulation of transcription

in eukaryotes. Cell 2013; 154:442-451.

6. Harrison MM, et al. A CRISPR view of

development. Genes Dev 2014; 28:1859-1872.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

7. Ran FA, et al. Genome engineering

using the CRISPR-Cas9 system.doi:10.1038/

nprot.2013.143.

1. Jackson Campbell, Rece, Urry, Cain,

Wasserman, Minorsky. Chapter 20: Biotechnology.

BIOLOGY (8^thedition) 2008: 396-425.

24