Luận văn Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN
HÀ THỊ THỦY
CHẨN ĐOÁN VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
BEGOMOVIRUS HẠI ỚT
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VN
HÀ THỊ THỦY
CHẨN ĐOÁN VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
BEGOMOVIRUS HẠI ỚT
Ngành
: Bảo vệ thực vật
: 8.62.01.12
Mã số
Người hướng dẫn khoa học : PGS. TS. Hà Viết Cường
HÀ NỘI - 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố
trong bất kỳ công trình khoa học nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích
dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả
Hà Thị Thủy
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân em đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân.
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Hà
Viết Cường, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, khuyến khích em nỗ lực trong suốt
quá trình thực hiện luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ công nhân viên thuộc Trung
tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nông nghiệp Việt Nam, đã nhiệt
tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực tập tại Trung tâm.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích
lệ, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả
Hà Thị Thủy
ii
MỤC LỤC
Lời cam đoan......................................................................................................................i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ii
Mục lục.............................................................................................................................iii
Danh mục từ viết tắt .........................................................................................................vi
Danh mục bảng ..............................................................................................................viii
Danh mục hình ..................................................................................................................x
Trích yếu luận văn............................................................................................................xi
Thesis abstract................................................................................................................xiii
Phần 1. Mở đầu................................................................................................................1
1.1.
1.2.
Giới thiệu...............................................................................................................1
Mục tiêu nghiên cứu..............................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu.................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu..................................................................................................................2
1.3.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn..........................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học...................................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................................3
Phần 2. Tổng quan tài liệu..............................................................................................4
2.1.
Khái quát chung về ớt............................................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc .............................................................................................................4
2.1.2. Phân loại................................................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm thực vật học...........................................................................................5
2.1.4. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới.........................................................................5
2.1.5. Tình hình sản xuất ớt tại Việt Nam .......................................................................7
2.1.6. Lợi ích đối với sức khỏe........................................................................................7
2.2.
Những nghiên cứu trong nước và thế giới.............................................................8
2.2.1. Một số nghiên cứu về virus hại ớt .........................................................................8
2.2.2. Một số begomovirus hại cà chua.........................................................................10
2.2.3. Một số begomovirus hại ớt..................................................................................11
2.3.
Đặc điểm chung của Begomovirus......................................................................13
iii
2.3.2. Đặc điểm hình thái...............................................................................................14
2.3.3. Cấu trúc genome của begomovirus .....................................................................14
2.3.4. Cấu trúc của phân tử DNA-A..............................................................................15
2.3.5. Cấu trúc của phân tử DNA-B ..............................................................................16
2.3.6. Đặc điểm của vùng IR.........................................................................................17
2.3.7. Phân loại các begomovirus..................................................................................17
2.3.8. Tái sinh của begomovirus....................................................................................18
2.3.9. Tương tác và tái tổ hơp của begomovirus ...........................................................19
2.3.10. Triệu chứng bệnh do begomovirus......................................................................20
2.3.11. Môi giới truyền bệnh và sự lan truyền ................................................................20
2.3.12. Thiệt hại kinh tế do begomovirus gây ra.............................................................21
2.3.13. Phòng chống........................................................................................................22
2.4.
2.5.
Kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR.............................................................................22
Kĩ thuật Agroinoculation.....................................................................................23
Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.............................................................25
3.1.
3.2.
3.3.
Địa điểm nghiên cứu ...........................................................................................25
Thời gian nghiên cứu...........................................................................................25
Đối tượng, vật liệu nghiên cứu............................................................................25
3.3.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................25
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................25
3.4.
3.5.
Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................27
Phương pháp........................................................................................................28
3.5.1. Điều tra đồng ruộng.............................................................................................28
3.5.2. Thu mẫu...............................................................................................................28
3.5.3. Chiết DNA tổng số..............................................................................................28
3.5.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) .....................................................29
3.5.5. Điện di sản phẩm PCR ........................................................................................29
3.5.7. Chuẩn bị E.coli chủng X1 Blue khả biến ............................................................30
3.5.8. Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn E.coli khả biến bằng
phương pháp xung điện .......................................................................................30
3.5.9. Lây nhiễm nhân tạo sử dụng kỹ thuật agroinoculation .......................................31
iv
3.5.10. Lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn ......................................................................32
3.5.11. Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng Elisa...............................................................33
3.5.12. Giải trình tự .........................................................................................................35
Phần 4. Kết quả và thảo luận .......................................................................................36
4.1.
Điều tra bệnh hại ớt tại Hà Nội và phụ cận .........................................................36
4.1.1. Triệu chứng bệnh virus trên ớt ............................................................................36
4.2.
4.2.1. Phát hiện Potyvirus trên ớt bằng DAS-ELISA....................................................39
4.3.
4.4.
4.4.1. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV được bằng lây nhiềm nhân tạo
dùng kĩ thuật Agroinoculation.............................................................................73
4.4.2. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
bọ phấn ................................................................................................................77
4.5
Phần 5. Kết luận và kiến nghị ......................................................................................86
5.1.
5.2.
Kết luận ...............................................................................................................86
Kiến nghị .............................................................................................................87
Tài liệu tham khảo...........................................................................................................88
v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
A. tumefaciens
AS
Từ viết tắt
Agrobacterium tumefaciens
Acetosyringone
ATP
Adenosine triphosphate
Base pair
Bb
CP
Capsid protein
CTAB
ddNTP
DNA
Dntp
Cetryl Ammonium Bromide
Dideoxynucleoside triphosphate
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleoside triphosphate
Double strand DNA
dsDNA
E. coli
EDTA
ICTV
IR
Escherichia coli
Ethylene diamine tetra acetic acid
International Committee on Taxonomy of Viruses
Itergenic region
Kb
Kilo base
LB
Luria and Bertani
ORF
Open reading frame
PCR
Polymerase Chain Reaction
Rolling circle amplification
Restriction enzyme
RCA
RE
Rep
Replication protein
RNA
Rnase
SDS
Ribonucleic acid
Ribonuclease
Sodium Dodecyl Sulphate
Singe strand DNA
SsDNA
TAE
Tris – acetate – EDTA
Thermus aquatic
Taq
Vir
Virulence region
β- ME
Beta- Mercaptoethanol
ChiVMV
CMV
Chilli veinal mottle virus
Cucumber mosaic virus
Pepper mild mottle virus
Pepper mottle virus
Pepper veinal mottle virus
Pepper yellow mottle virus
Tobacco mosaic virus
PMMoV
PepMoV
PVMV
PepYMV
TMV
vi
TYLCTHV
TYLCVs
Tomato yellow leaf curl Thailand virus
Tomato yellow leaf curl viruses
vii
đặc hiệu TYKa-A–F1/R1 ............................................................................70
benthamiana ..............................................................................................75
benthamiana...............................................................................................76
số cây chỉ thị ..............................................................................................77
xung điện ...................................................................................................78
ix
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Hà Thị Thủy
Tên Luận văn: Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt
Ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã số: 8.62.01.12
Tên cơ sở đào tạo: Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam; Học viện Nông nghiệp Việt
Nam.
Mục đích nghiên cứu
Xác định sự có mặt của Begomovirus trên các mẫu ớt thu thập tại miền Bắc, xác
định đặc điểm sinh học và đánh giá tính gây bệnh của virus.
Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh virus hại ớt được thu thập tại các vùng trồng ớt
tại Hà Nội, sau đó được làm khô bằng hạt silicagelkít. Các mẫu được kiểm tra ELISA
phát hiện virus bằng các kit ELISA do Viện DSMZ của Đức cung cấp. Các mẫu có triệu
chứng đặc trưng được kiểm tra PCR. Sử dụng cặp mồi chung BegoA Rev/For phát hiện
begomovirus. Sử dụng cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/VNP1500-A-R1 và VNP1500-B-
F1/VNP1500-B-R2 để phát hiện đặc hiệu PepYLCVN. Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo
dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinoculation) và lây nhiễm bằng bọ phấn
nhằm đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVN trên cà chua và một số cây chỉ thị.
Kết quả chính và kết luận
1. Đã điều tra và thu thập các mẫu bệnh begomovirus trên ớt tại Hà Nội năm 2017
với các loại hình triệu chứng . Dạng triệu chứng điển hình là triệu chứng khảm lá. Tỉ lệ
nhiễm virus cao nhất tại huyện Thạch Thất trong giai đoạn quả chín đạt 43,2%.
2. Đã kiểm tra ELISA trên 81 mẫu ớt thu thập khắp cả nước, phát hiện 2 mẫu
phản ứng dương tính ChiVMV, 5 mẫu phản ứng dương tính PMMoV, 1 mẫu phản ứng
dương tính PepMoV, 1 mẫu phản ứng dương tính PepYMV và 1 mẫu phản ứng dương
tính TYLCVs.
3. Kiểm tra PCR phát hiện begomovirus bằng cặp mồi chung BegoA-F1 và
BegoA-R1 trên 14 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 6 mẫu ớt và 4 mẫu
cà chua có phản ứng dương.
4. Kiểm tra PCR phát hiện TYLCKaV bằng cặp mồi đặc hiệu TYKa-A–F1/R1 trên
5 ớt và 4 mẫu cà chua. Kết quả kiểm tra cho thấy có 1 mẫu cà chua có phản ứng dương.
xi
5. Kiểm tra PCR phát hiện PepYLCVNV bằng cặp mồi đặc hiệu VNP93–A-
F1/VNP1500–A-R1 và cặp mồi 1500–B–F1/R2 trên 9 mẫu (5 ớt và 4 mẫu cà chua).
Kết quả kiểm tra cho thấy có 4 mẫu ớt và 4 mẫu cà chua có phản ứng dương với cả
DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV.
6. Đã giải trình tự bổ sung và nhận được trình tự đầy đủ bộ gen mẫu
PepYLCVNV VNP1500 từ 2 cấu trúc xâm nhiễm. Phân tích bộ gen cho thấy bộ gen của
virus trên cấu trúc xâm nhiễm là hoàn chỉnh, đảm bảo sự xâm nhiễm hệ thống của virus
trong cây. Kết hợp kết quả lây nhiễm nhân tạo và phân tích trình tự đã gợi ý có lẽ xuất
hiện đột biến của virus trên cấu trúc xâm nhiễm liên quan cảm ứng triệu chứng.
xii
THESIS ABSTRACT
Master candidate: Ha Thi Thuy
Thesis title: Diagnosis and Biological Characteristics of Pepper Begomovirus
Major: Plant Protection Code: 60.62.01.12
Educational organization: Vietnam Academy of Agriculture Sciences (VAAS);
Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives:
Materials and Methods: The viral symptomatic samples were collected on the
pepper fields in Ha Noi, then were dried by silicagel. The samples were tested for
the presence of viruses by ELISA using kits provided by the DSMZ Institute
(Germany). PCR tests to detect begomovirus were carried out using universal
and specific primers. An agro-inoculation method using Agrobacterium
tumerfaciens cells harboring infectious structures and infected with Bemisia
tabaci of PepYLCVNV were used to investigate the pathogenicity of these two
geminivirses on pepper.
Main findings and conclusions:
1. Investigated and collected begomovirus-infected samples of peppers in
Hanoi in 2017 with different types of symptoms. The most typical symptom was
leaf mosaic. The highest infection rate in Thach That district during ripening was
43.2%.
2. ELISA tests on 81 symptomatic pepper samples showed 2 samples
positive to ChiVMV, 5 samples positive to PMMoV infection, 1 samples positive
to PepMoV infection, 1 samples positive to PepYMV, 1 samples positive to
PepYMV and 1 samples positive to TYLCVs.
3. PCR detection of begomovirus was carried out with begoA-F1 and
BegoA-R1 primers on 14 peppers and 4 tomato samples. The results showed that
there were 6 samples of pepper and 4 samples of tomato were positive to
begomovirus.
4. PCR detection of TYLCKaV by specific primers TYKa-A-F1/R1 on 5
samples of pepper and 4 tomato samples. The results showed that there were 1
tomato sample were positive to TYLCKaV.
5. PCR detection of PepYLCVNV with specific primers VNP93-A-
F1/VNP1500-A-R1 and 1500-B-F1/R2 primers on 9 samples (5 chili and 4
xiii
tomato samples). Four samples of pepper and 4 tomato samples showed that
positive results for both DNA-A and B-DNA of PepYLCVNV.
6. Extra sequencing and complete sequencing of the PepYLCVNV
VNP1500 genome from two infecting structures were performed. Genome
analysis reveals that the viral genome on the infectious structure is complete,
ensuring systematic viral infection in the plant. Incorporation of the results of
infection and sequencing suggested the emergence of mutations in the invasive
structure associated with symptomatic induction.
xiv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. GIỚI THIỆU
Họ Geminiviridae là họ virus thực vật lớn nhất, có khoảng 200 loài
(Fauquet and Stanley, 2005). Trong đó begomovirus là chi lớn nhất và quan
trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số lượng loài và bệnh do chúng gây ra
với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) có hình
thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vòng đơn, kích
thước khoảng 2,7 kb (Fauquet and Stanley, 2005). Các begomovirus không
truyền qua hạt giống nhưng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia
tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn (Picó at al., 1996).
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do begomovirus
gây ra như bệnh xoăn vàng lá cà chua–một bệnh được xem là nguy hiểm nhất
trên cà chua khắp thế giới. Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng
giống nhau, điển hình là: cuốn lá (cong lá hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non)
biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh
tính virus chỉ có thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử (Moriones and
Navas-Castillo, 2000).
Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của
begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt
Nam vẫn còn ít chỉ gồm 19 loài được phân lập từ nhiều loài cây, trong đó có
Trên cây họ cà, đã có 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá
cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa có công bố nào cho thấy sự có
mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu
chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Học viện nông
nghiệp Việt Nam) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus
phân lập đầu tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một
loài begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl
Vietnam virus (PepYLCVNV).
Do begomovirus hại ớt là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm
sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu.
1
Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài:“Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt ”
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.2.1. Mục tiêu
(i) Xác định được sự có mặt của begomovirus trên các mẫu ớt thu thập
được tại Hà Nội;
(ii) Đánh giá được tính gây bệnh của một begomovirus mới phân lập từ ớt
và cà chua là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) bằng lây
nhiễm nhân tạo.
1.2.2. Yêu cầu
1. Điều tra đồng ruộng bệnh virus trên ớt
- Điều tra bệnh; thu thập mới các mẫu cây ớt biểu hiện triệu chứng.
2. Phát hiện các virus trên ớt bằng ELISA
3. Phát hiện các begomovirus và PepYLCVNV bằng PCR
- Phát hiện begomovirus bằng PCR dùng mồi chung
- Phát hiện TYLCKaV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu
- Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu
4. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
agroinoculation sử dụng cấu trúc xâm nhiễm đã được xây dựng từ trước và bọ
phấn
5. Đặc trưng phân tử của PepYLCVNV
- Hoàn thiện giải trình tự bộ gen mẫu virus PepYLCVNV VNP1500 được
xây dựng trên cấu trúc xâm nhiễm
1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Đã xác định được thành phần virus nói chung và begomovirus nói riêng
trên số lượng lớn mẫu ớt thu thập tại miền Bắc.
- Đã cung cấp thông tin và định hướng nghiên cứu tiếp về tính gây bệnh của
một begomovirus phân lập từ ớt và cà chua là Pepper yellow leaf curl VietNam
virus (PepYLCVNV).
2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xác định sự phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ
của begomovirus đã xác định được.
- Góp phần đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh do begomovirus hại ớt một
cách hợp lý, an toàn với con người và môi trường.
- Cung cấp dẫn liệu cho đào tạo và giảng dạy về phân bố cũng như đặc điểm
sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của PepYLCVNV.
3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ỚT
2.1.1. Nguồn gốc
Ớt đã là một phần trong ẩm thực của loài người ít nhất là 7500 năm trước
Công nguyên. Có những bằng chứng khảo cổ ở các khu vực ở tây nam Ecuador
cho thấy ớt đã được thuần hóa hơn 6000 năm về trước (Perry et al., 2007), và là
một trong những loại cây trồng đầu tiên ở châu Mỹ.
Người ta cho rằng ớt đã được thuần hóa ít nhất năm lần bởi những cư dân
tiền sử ở các khu vực khác nhau của Nam và Bắc Mỹ, từ Peru ở phía nam đến
Mexico ở phía bắc và một số vùng của các bang Colorado và New Mexico bởi
các dân tộc Pueblo Cổ đại (Bosland, 1996).
Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO, 2012) cây ớt được xem là một
trong những cây trồng quan trọng của vùng nhiệt đới. Diện tích trồng ớt thế giới
vào khoảng 1.914.685 ha cho mục đích lấy quả tươi với sản lượng 31.171.567
tấn. Các nước nhập khẩu và xuất khẩu quan trọng nhất bao gồm: Ấn Độ, Mexico,
được du nhập từ Trung Quốc, Ấn Độ. Diện tích phân bố khá rộng rãi, tập trung ở
miền Bắc và miền Trung, ở miền Nam diện tích trồng ớt còn phân tán.
2.1.2. Phân loại
Chi Capsicum có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Hoa Kỳ và đã có mặt khắp
thế giới bao gồm các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, và các vùng khí hậu ôn đới
(Pickersgill, 1997).
Theo Bosland and Votava (2000) cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), chi
Capsicum. Hiện nay có ít nhất 25 loài hoang dại được biết đến và 5 loài được
thuần hóa bao gồm:
- Capsicum frutescens, bao gồm cả ớt Tabasco
- Capsicum chinense, bao gồm cả loài ớt cay nhất như naga, habanero và
Scotch bonnet
- Capsicum pubescens, bao gồm cả ớt rocoto Nam Mỹ
4
Tải về để xem bản đầy đủ
111 trang
18400
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Chẩn đoán và đặc điểm sinh học của Begomovirus hại ớt", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_van_chan_doan_va_dac_diem_sinh_hoc_cua_begomovirus_hai.docx
