Khóa luận Ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân nhanh phôi vô tính lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

KHOA SINH HỌC

-------------------

TRỊNH THỊ HƢƠNG

ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TỚI

QUÁ TRÌNH NHÂN NHANH PHÔI VÔ TÍNH

LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC KHÓA 29

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà lạt, 5/2009

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

KHOA SINH HỌC

-------------------

ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TỚI

QUÁ TRÌNH NHÂN NHANH PHÔI VÔ TÍNH

LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.)

Cán bộ hƣớng dẫn:

TS. Dƣơng Tấn Nhựt

ThS. Vũ Quốc Luận

Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Hƣơng

Đà lạt, 5/2009

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Những kết quả và số liệu

trong khóa luận này chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Đây là một

phần nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu qui trình tạo phôi vô tính và nhân

nhanh cây lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.)” do TS. Dương Tấn Nhựt chủ trì, Sở

Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng cấp kinh phí.

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này.

Đà lạt, 24/05/2009

Tác giả

Trịnh Thị Hương

3

Lời cảm ơn

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các

thầy cô, các anh chị, các bạn và gia đình. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt và các phòng ban đã tạo điều kiện tốt cho

em hoàn thành chương trình học của mình ở trường.

Quý Thầy Cô khoa Sinh học trường Đại học Đà Lạt đã truyền đạt cho em những

kiến thức và kinh nghiệm quý báu.

Thầy Dương Tấn Nhựt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

Thầy, người đã trực tiếp gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn chu đáo, truyền đạt những

kinh nghiệm quý báu, hết lòng sửa chữa những sai sót giúp em hoàn thành trọn vẹn đề

tài này và cũng là người dìu dắt em trong bước đi đầu tiên để tiếp cận đến với chân

trời của khoa học rộng lớn. Không chỉ là truyền đạt kiến thức, Thầy còn dạy cho em lối

sống, cách làm người. Thầy cũng là một tấm gương về lòng nhiệt huyết, cống hiến hết

mình cho sự nghiệp của khoa học, để chúng em học hỏi, noi theo.

Em cũng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Quốc Luận, người trực tiếp hướng

dẫn, chỉ bảo tận tình cũng như luôn tạo mọi điều kiện cho em trong những ngày đầu

̣ ̣

tiên thực tập tai viên và trong suốt qua trinh tiến hành các thí nghiệm của đề tài.

́

̀

Cô Hoàng Thị Sâm đã định hướng cũng như luôn chia sẻ những kiến thức, kinh

nghiệm và chỉ bảo cho em rất nhiều điều trong cuộc sống.

Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong

suốt thời gian thực tập và làm đề tài tại viện.

Các anh chị trong phòng Sinh học phân tử & Chọn tạo giống cây trồng (viện Sinh

học Tây Nguyên): anh Bình, anh Nam, chị Hiền, chị Thu Ba, chị Phượng, chị Hằng.

Em cảm ơn các anh chị đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập

cũng như tiến hành các thí nghiệm của đề tài.

Ngoài ra bên cạnh em còn có các anh chị, các bạn của trường ĐH Bách Khoa

TP.HCM, ĐH Bách Khoa Đà Nẵng, ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM, ĐH Nha

Trang, ĐH Đà Lạt, ĐH Yersin. Cảm ơn anh Nam, bạn Thu, bạn Thương, Thành,

Cương đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm. Xin cảm ơn

sự nhiệt tình của các anh chị và các bạn.

Cảm ơn anh Thắng, Na, Dung, các thành viên của gia đình 1/29b và tất cả những

người bạn thân đã luôn bên tôi, cùng tôi chia sẻ những niềm vui và ca những khó khăn.

̉

Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ và động viên con trong mọi sự

lựa chọn của mình. Đặc biệt là mẹ, người đã luôn tin tưởng, cho con nghị lực và sức

mạnh những khi con gặp khó khăn nhất để vươn lên trong cuộc sống.

Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

4

Lời mở đầu

Thiên nhiên tươi đẹp đã ban tặng cho cuộc sống rất nhiều món quà. Và sự xuất

hiện của các loài hoa chính là món quà tuyệt vời nhất của tạo hóa. Cùng với sự phát

triển của xã hội, con người ngày càng hướng tới cái đẹp thì hoa tươi đã trở thành món

ăn tinh thần không thể thiếu được. Trong đó, hoa lan được mệnh danh là loài hoa

“vương giả” đã dần dần len lỏi xuất hiện ở mọi nơi, như một điều kỳ diệu mà thiên

nhiên đã ban tặng cho con người. Có lẽ hiếm có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp

quanh mình nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ, mê

hoặc con người một cách vô điều kiện như loài hoa này. Trong không gian lung linh

màu sắc và hương thơm quyến rũ đó, chúng ta phải kể tới sự hiện diện của

Phalaenopsis. Từ rất lâu, loài hoa này đã xuất hiện trong các khu vườn làm cảnh cũng

như trong trang hoàng nhà cửa, văn phòng. Phalaenopsis không chỉ mang một vẻ đẹp

đài các, sang trọng, ấm áp, gần gũi mà nó còn chất chứa trong mình những giá trị tiềm

ẩn, luôn mới lạ, luôn hấp dẫn và mời gọi lòng say mê, khám phá của những ai trót

nặng lòng với loài hoa vương giả này.

Ngày nay, nhu cầu hoa tươi nói chung, hoa lan nói riêng trong nước và trên thế

giới ngày càng tăng, xu hướng chơi lan cũng ngày càng lan rộng. Hoa lan không chỉ

mang giá trị cao về mặt tinh thần, thẩm mỹ mà còn có giá trị cao về mặt kinh tế. Việt

Nam là nước có điều kiện khí hậu thuận lợi để phát triển ngành trồng lan. Tuy nhiên,

chúng ta vẫn phải phụ thuộc nguồn giống từ Thái Lan, Đài Loan… Đây là một điều bất

cập trong tiềm năng nhân giống, lai tạo ra các giống lan độc đáo quý hiếm, mang nét

đặc trưng của Việt Nam phục vụ thị trường nội địa cũng như cho xuất khẩu.

Năm 2005, Tp.HCM khẳng định hoa lan (lan cắt cành như Dendrobium, Mokara,

Oncicidium…) sẽ trở thành cây giống chủ lực của thành phố trong vòng 5 năm tới.

Chương trình phát triển hoa 2004 – 2010 đã được sở Nông nghiệp - Phát triển nông

thôn Tp.HCM thông qua với mục tiêu Tp.HCM phấn đấu đạt kim ngạch xuất khẩu hoa

kiểng là 10 triệu USD vào năm 2005 và 15 triệu USD vào 2010.

Để có thể phát triển được ngành trồng hoa lan, trước mắt chúng ta cần phải chủ động

được nguồn giống, dần dần không phải nhập giống, lai tạo ra một số giống có chất

lượng cao để cung cấp cho thị trường trong nước và sau đó xuất khẩu. Ngoài ra, kỹ

thuật nhân nhanh bằng nuôi cấy mô đang là công cụ đắc lực để giúp chúng ta có thể có

đủ giống trong một thời gian ngắn. Như vậy, trong nước chúng ta cần phải có thêm

nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô có quy mô lớn, chất lượng cao để có thể đáp ứng

được nhu cầu nhân giống.

5

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Giới thiệu về Phalaenopsis

1.1. Nguồn gốc và phân bố

Lan Hồ điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được Rumphius xác định

dưới tên là Angraecum. Đến năm 1753, Linne đổi lại là Epidendrum. Chi

Phalaenopsis do C.L Blume phát hiện vào năm 1825. Phalaenopsis hay còn gọi là

lan Hồ điệp. Tên Phalaenopsis xuất hiện từ tiếng Hy Lạp: “Phalama” (con bướm

đêm) và “opsis” (trông giống như) nghĩa là loài hoa có hình dạng như bươm bướm.

Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng, sống ở bán đảo Mã

Lai, Indonesia, Philippin, các tỉnh ở phía đông Ấn Độ và Châu Úc. Chúng sống trên

cây hoặc trên đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao trên 2000m (Dương Công Kiên,

2006).

Ở Việt Nam có khoảng 5 - 6 loài Hồ điệp thuần chủng bao gồm: Phalaenopsis.

gibbosa Sweet, Phalaenopsis. mannii Rchob.f, Phalaenopsis. braceana (Hook.f),

Christenson, Phalaenopsis. Lobbii (Rchob.f), Phalaenopsis. fuscata Rchob.f. Hầu

hết đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc sặc sỡ và hương thơm độc đáo. Bên cạnh những

loài lan Hồ điệp thuần chủng, những người yêu thích loài hoa này không ngừng sưu

tầm, nhập và thuần dưỡng các giống ngoại khiến chủng loại, màu sắc của lan Hồ

điệp ở nước ta ngày càng đa dạng.

1.2. Vị trí phân loại

Giới

Ngành

Lớp

Plantae

Thực vật

Ngọc lan

Hành

Magnoliophyta

Liliopsida

Lilidae

Phân lớp

Bộ

Hành

Orchidales

Orchidaceae

Phalaenopsis

Lan

Họ

Lan

Chi

Lan Hồ điệp

Loài

Phalaenopsis amabilis Lan Hồ điệp trắng

6

Hình 1: Sự đa dạng về màu sắc và hình dáng của Phalaenopsis sp.

7

1.3. Đặc điểm thực vật

1.3.1. Cơ quan sinh dƣỡng

1.3.1.1. Thân

Cây đơn thân, không có giả hành. Các đốt thân rất ngắn và thường được bao

bọc bởi hai hàng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân.

1.3.1.2. Lá

Lá đơn nguyên dày, mọng nước, không cuống và có bẹ ôm lấy thân. Lá có

hình elip thuôn hay hình lưỡi mác. Lá mang đặc tính của thực vật CAM.

1.3.1.3. Rễ

Rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá. Rễ phát triển mạnh,

màu lục, xung quanh rễ có một màng xốp bao bọc (velamen). Lớp mô xốp này dễ

dàng hút nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cho cây đồng thời đóng vai trò

đặc biệt quan trọng trong việc giữ nước. Số lượng rễ khá nhiều, rễ to và hơi dẹp.

1.3.2. Cơ quan sinh sản

1.3.2.1. Hoa

Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa). Hoa mọc thành cụm,

lưỡng tính, đối xứng hai bên. Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba

mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có hình dạng và màu

sắc khác hẳn gọi là cánh môi. Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật. Nhị

và nhụy dính liền thành một cột nhị nhụy. Hạt phấn thường dính lại thành khối

phấn, có chuôi và gót nằm ở phía dưới. Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới.

Bộ nhụy gồm ba lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang nhiều noãn (Hoàng Thị

Sản, 2003).

1.3.2.2. Quả

Quả của lan Hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai

bên đường của gió noãn. Quả lan chứa rất nhiều hạt, số lượng tùy vào từng loài.

Theo Bernard (1909), hạt lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại

nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào.

8

1.3.2.3. Keiki

Keiki theo tiếng Indonesia có nghĩa là “bé con” là một cây con mọc ra từ một

mắt trên thân hay cuống hoa. Hiện tượng này được Williams mô tả đầu tiên vào

năm 1894. Các cây Phalaenopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo

ra keiki trên cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ.

Người ta có thể tách cây con này để nhân giống và cho tỷ lệ sống sót rất cao.

2. Một số yếu tố cần thiết trong nuôi cấy mô lan

2.1. Các chất hấp phụ phenol

Vấn đề thường gặp nhất khi nuôi cấy để nhân giống Phalaenopsis là hàm

lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol khuếch tán vào môi trường làm

oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là làm mẫu

cấy hóa nâu hoặc đen và chết (Morel, 1974; Flamee và Boesman, 1997; Fast, 1979).

Hiện nay có rất nhiều phương pháp để loại trừ hoặc làm giảm nồng độ của các

chất tiết này, chẳng hạn như dùng các chất chống oxy hóa, enzyme ức chế phenol,

polyvinylprolidone, than hoạt tính và nhiều loại chất khác. Hầu hết các phương

pháp này thường đi kèm với việc cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới sau một

thời gian nuôi cấy.

Ngày nay than hoạt tính (AC – Activated Charcoal) được sử dụng phổ biến

trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung AC ở nồng độ thích hợp vào môi

trường nuôi cấy mô Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ bị loại

bỏ giúp mô sinh trưởng tốt (Arditi và Ernst, 1993, 2000).

AC được thêm vào môi trường dinh dưỡng ở các giai đoạn nuôi cấy khác

nhau. Chồi của nhiều loài cây hình thành rễ dễ dàng hơn khi trong môi trường có bổ

sung thêm AC. Không phải là chất điều hòa sinh trưởng nhưng AC đặc biệt có thể

làm thay đổi thành phần của môi trường, hấp thụ nhiều cơ chất khác nhau, mà các

cơ chất này có thể hình thành trong quá trình hấp môi trường ở nhiệt độ cao, một số

chất có thể tiết ra từ các vết thương khi tách mẫu cấy cũng như các chất điều hòa

sinh trưởng khi bổ sung vào môi trường, các hợp chất có gốc phenol (Fridborg và

9

cộng sự, 1978; Ammirato, 1983; Ebert và cộng sự, 2000; Geogre, 1993; Pan và

Staden, 1999; Wann và cộng sự, 1997).

Ngoài ra, AC khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ hấp thu những chất làm

kìm hãm, đặc biệt là do các hợp chất có bản chất phenol tiết ra làm môi trường hóa

nâu, gây độc cho mẫu cấy. Biện pháp bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy đặc biệt

có hiệu quả trên các loài Phalaenopsis, Cattleya, Aerides. AC cũng ảnh hưởng đến

pH của môi trường nuôi cấy. Nhiều báo cáo thí nghiệm cho thấy AC còn tỏ ra thích

hợp cho sự hình thành rễ chồi nuôi cấy trong môi trường in vitro (Duma và cộng sự,

1995; Geogre và Sherriington, 1984; Nguyễn Văn Kết và cộng sự, 2004).

2.2. Các chất điều hòa sinh trƣởng (Phytohormone)

Đây là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy. Chất điều hòa

sinh trưởng là hormone thực vật bao gồm các hợp chất hữu cơ có bản chất khác

nhau dùng để điều hòa các hoạt động sinh lý, quá trình sinh trưởng và phát triển,

được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong cây.

Bằng con đường tổng hợp nhân tạo người ta có thể tạo ra các hợp chất có công

thức hóa học tương tự với các chất trong tự nhiên, dùng để kích thích các hoạt động

sinh lý của cây.

Chất điều hòa sinh trưởng được chia làm hai nhóm chính là chất kích thích

sinh trưởng và chất ức chế sinh trưởng. Hai nhóm chất này tuy có tác dụng đối

kháng về mặt sinh lý nhưng chúng luôn tồn tại cùng nhau trong cơ thể thực vật.

Các chất kích thích sinh trưởng chỉ tác động lên mô cấy ở liều lượng thấp, khi

ở liều cao chúng có thể gây độc cho mô cấy, vì vậy mà một vài chất kích thích được

dùng làm thuốc diệt cỏ.

Có hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật nuôi cấy in-vitro

đó là: auxin và cytokinin.

2.2.1. Auxin

Bao gồm một số hợp chất chứa nhân indol trong phân tử như: IBA; NAA;

IAA; 2,4-D. Trong đó IAA và NAA dùng cho quá trình tạo rễ ở đa số loài cây; 2,4-

D sử dụng có hiệu quả cho việc tạo mô sẹo ở nhiều loài thực vật.

10

Trong nuôi cấy mô in vitro, các auxin gây ra hàng loạt các biến đổi như: sinh

trưởng của mẫu qua hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá

trình trao đổi chất, tham gia sự điều chỉnh phân hóa của rễ, chồi… Các auxin đều có

hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích hoạt sự phân hóa rễ,

ngược lại ở nồng độ cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo (Dương Công Kiên,

2003).

Phôi lan có đáp ứng đáng kể đối với auxin. Theo Curtis và Nichol (1984), IAA

có khả năng ức chế sự tăng trưởng của phôi trong các giai đoạn đầu sau khi nảy

mầm. Nhiều tác giả sau này nhận thấy auxin có tác động lên sự tăng trưởng và nảy

mầm của phôi lan ở nhiều giống lan lai khác nhau (Withner, 1953, 1955; Mariat,

1952). Ở một số giống lan biểu sinh, auxin (α-naphthalene acetamide) không ảnh

hưởng lên sự nảy mầm của phôi nhưng có tác động lên sự tăng trưởng của chồi và

rễ (Yates và Curtis, 1949). Một số báo cáo khác cho rằng auxin có hoạt tính khi

được sử dụng cùng với các dịch chiết có hoạt tính kích thích tăng trưởng như: nước

dừa (Hegarty, 1955), nước cà chua (Meyri, 1954) và rất khó có thể quan sát độ ảnh

hưởng riêng rẽ của auxin (Dương Công Kiên, 2000).

2.2.2. Cytokinin

Là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được khám phá do những cố gắng tìm

hiểu yếu tố kích thích sự phân chia tế bào thực vật. Sau zeatin, hơn 30 cytokinin

khác nhau đã được cô lập. Ngày nay cytokinin là tên gọi dùng để chỉ một nhóm chất

thiên nhiên hay nhân tạo có đặc tính gần giống nước dừa hay kinetin.

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng là kinetin, 2iP và BAP. Đối với nuôi cấy

mô lan người ta thường sử dụng BA cho vào môi trường để kích thích tạo sơ khởi

chồi, tạo cụm chồi hay tạo tiền củ lan vì BA có giá thành rẻ và hoạt tính cao.

Cơ quan tổng hợp cytokinin trong cây là hệ thống rễ. Từ rễ, cytokinin được

vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều với auxin nhưng

không có tính phân cực rõ ràng như auxin. Ngoài rễ, một số cơ quan non đang sinh

trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ cytokinin.

11

Đặc tính của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng

đến sự tạo chồi bất định, ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan

của thực vật, đặc biệt là phân hóa chồi, kìm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây

nguyên vẹn, do đó nó được coi là hormone trẻ hóa, kích thích sự nảy mầm của hạt

và của chồi ngủ, giúp gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein.

Trong thân và rễ, cytokinin có vai trò: cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự

tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ); kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá

trưởng thành; kích thích sự hình thành củ và sự phình to của củ. Trong mối tương

tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây. Cytokinin làm yếu

hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều.

Theo Skoog:

 Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ thu được chức năng tạo rễ.

 Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp mô sẽ phát sinh chức năng tạo thân.

 Nếu tỷ lệ này gần 1 đơn vị ta sẽ thu được mô sẹo (Dương Công Kiên, 2006).

Ngoài auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật người ta còn sử

dụng các phytohormone khác như: GA (Gibberellic acid); ABA (Abscissic acid);

Etylen…

2.3. Nƣớc dừa và các dung dịch hữu cơ khác

Nước dừa được sử dụng rộng rãi như là chất kích thích tăng trưởng trong nuôi

cấy phôi.

Từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi phôi của “Datura” và năm

1949 nuôi mô của “Daucus”. Kết quả phân tích thành phần nước dừa từ non đến già

của Tulecke và cộng sự (1961) cho thấy trong nước dừa có:

● Amino acid dạng liên kết có trong protein và lipid.

● Acid hữu cơ.

● Một số loại đường như: glucose, sucrose, fructose…

● Các hợp chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside.

12

Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của các chất có trong nước dừa

nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinin vài năm, nước dừa mới được chứng minh

là có chứa zeatin (Letham, 1974).

Khi nuôi cấy phôi lan nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng

và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961).

Các nhà trồng lan chuyên nghiệp còn sử dụng nhiều loại dịch chiết khác như:

nước chiết cà chua (Meyerm, 1954; Vacin và Went, 1949; Griffith và Link, 1957),

dịch chiết gỗ bulô (Zimmer và Pieper, 1974, 1976), dịch chiết bò, dịch chiết lúa mì,

lúa mạch, cà rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái

khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1974; Mariat, 1952; Withner, 1953).

2.4. Carbohydrate

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên

các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải là do quá trình

quang hợp cung cấp mà chính là do nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới

dạng đường. Hai dạng đường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy in vitro là

glucose và sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Trong một

vài trường hợp fructose cũng được sử dụng. Glucose có hiệu quả tương tự như

sucrose còn fructose ít có hiệu quả hơn. Các nguồn carbohydrate khác cũng được

tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các

carbohydrate này kém hiệu quả hơn sucrose và glucose. Nồng độ sucrose trong nuôi

cấy thường từ 2 – 3%.

Sucrose trong môi trường sẽ dễ dàng bị phân cắt ra thành glucose và fructose.

Glucose được mô sử dụng trước, sau đó mới đến fructose. Sucrose cũng bị thủy giải

một phần trong quá trình hấp tiệt trùng môi trường. Một vài loài thực vật tăng

trưởng tốt trong môi trường có sucrose hấp tiệt trùng so với môi trường có sucrose

lọc vô trùng và người ta cho rằng khi tế bào được nuôi trong môi trường có sucrose

hấp tiệt trùng thì nó vừa được cung cấp glucose vừa sucrose (Nguyễn Đức Lượng,

Lê Thị Thủy Tiên, 2006).

2.5. Ảnh hƣởng của pH

13

Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng,

khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Vì vậy, việc xác định chính xác

và điều chỉnh pH trong môi trường là rất cần thiết. Murashige và Skoog (1962) nhận

thấy rằng độ pH từ 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong

môi trường MS. Nếu như môi trường MS được sử dụng ở dạng lỏng thì có thể chỉnh

pH = 5.

Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH (đôi khi cũng sử

dụng KOH) hoặc HCl sau khi đã pha xong môi trường. Có thể chỉnh pH bằng pH kế

để bàn, pH kế cầm tay hoặc giấy đo pH. Thường thì pH môi trường được điều chỉnh

trước khi hấp tiệt trùng, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính acid của môi trường. Mann và

cộng sự (1982) nhận thấy rằng nếu trước khi hấp tiệt trùng mà chỉnh pH bằng 5,7

thì sau khi hấp tiệt trùng pH sẽ giảm xuống còn 5. Nếu muốn pH từ 5,7 – 5,9 trước

khi cấy thì trước khi hấp tiệt trùng phải điều chỉnh pH = 7. pH của môi trường cũng

sẽ thay đổi trong suốt quá trình nuôi cấy, do đó có nhiều nhà nghiên cứu đã cho vào

một chất có màu sắc thay đổi theo pH để theo dõi sự thay đổi pH trong môi trường.

Chất chỉ thị thường được sử dụng là chlorophenol đỏ 1 – 5 mg/l (Reinert và White,

1956; Risser và White, 1964; Henson, 1979; Binns và Meins, 1980) và

bromocressol đỏ tía. Tuy nhiên, một vài chất chỉ thị có thể gây độc cho mẫu cấy

như BDH 4460 cản trở sự tăng trưởng của tế bào trần Petunia (Roscoe và Bell,

1981).

3. Tổng quan về phôi

3.1. Phôi hữu tính ở thực vật họ lan

Phôi của các loài thực vật họ lan có kích thước rất nhỏ và chưa phân hóa. Quá

trình phát triển ở phôi lan có thể phân biệt với phôi của các loài thực vật có hoa

khác như sau:

+ Phôi ở thực vật hai lá mầm: dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm.

+ Phôi ở thực vật một lá mầm: dạng cầu → dạng khiên → dạng diệp tiêu.

+ Phôi ở thực vật họ lan: dạng cầu → dạng chuyển tiếp → dạng protocorm.

14

Giai đoạn đầu của phôi ở các loài thực vật họ lan tương tự với những loài thực

vật có hoa khác (Veyret, 1965, 1974). Sự khác biệt giữa phôi của các loài họ lan với

các họ thực vật có hoa khác được nhận thấy rất rõ từ giai đoạn phôi hình cầu. Ở các

thực vật có hoa khác tất cả tế bào của phôi cầu đều thuộc mô phân sinh. Riêng phôi

lan chỉ tế bào đỉnh và tế bào mô phân sinh ngọn mới phân chia để kéo dài, còn các

tế bào khác sẽ không phân chia hay tăng kích thước. Vì vậy, phôi lan có hai vùng

phân chia rõ ràng: cực chồi với tế bào nhỏ và cực đáy với tế bào lớn.

Dựa vào đặc tính phát sinh tử diệp, phôi lan được phân chia làm hai nhóm:

+ Nhóm phôi không mang tử diệp: các phôi này thường có hình bầu dục,

chẳng hạn ở loài Dactylorhiza baltica.

+ Nhóm phôi mang tử diệp: các phôi này thường có hình thuôn dài, chẳng hạn

ở Polystachya microbambusa, Dendrochilum glumaceum.

Cấu trúc dạng lá phát sinh đầu tiên ở protocorm ở cả hai nhóm có thể xem là tử

diệp (Burgeff, 1936; Teryokhin, 1977) hoặc lá (Batygina và Vasilyeva, 1983), một

số nghiên cứu khác còn cho rằng tất cả cấu trúc dạng lá hình thành đầu tiên ở

protocorm đều là tử diệp (Teryokhin, Nikiticheva, 1968). Ở phần cực của protocorm

và phôi là một cực chồi, tại cực này các lá (hoặc tử diệp) phát triển bao quanh cực

chồi (ở Listera ovata) hoặc hình thành dạng lưỡi liềm (ở Dactylorhiza baltica).

Phôi lan bao gồm vỏ phân sinh ngọn, nhu mô và một cực chồi. Mô mạch

không phát triển trong giai đoạn phôi, vì vậy phôi lan không chứa vùng mô phân

sinh rễ. Trong khi đó, phôi các loài thực vật có hoa khác luôn phân rõ hai cực chồi,

rễ. Đây là điểm khác biệt lớn giữa phôi lan với các loài thực vật có hoa khác.

3.2. Phát sinh phôi vô tính

3.2.1. Khái niệm về phôi vô tính

Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng chỉ một

khái niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà

dưới những điều kiện thích hợp có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng

hoàn chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2006).

15

Không như những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào

không chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào sinh dưỡng cũng mang tính

toàn thế. Sự linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa

hoàn toàn vẫn có thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định. Sự

lặp lại toàn bộ chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi

hỏi sự tái thiết lập biểu hiện của những gen cần thiết. Sau khi đã hoàn toàn thoát

khỏi chức năng trước đó của tế bào đã biệt hóa, các tế bào sinh dưỡng mang tính

toàn thế dưới tác động cảm ứng phân chia của tế bào sẽ có trạng thái biến dưỡng

tương tự như tế bào trứng đã thụ tinh (Dénes và cộng sự, 1995).

Williams và Maheswran (1986) đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình

thành từ một tế bào đơn hoặc từ cả một cụm tế bào. Thông qua một quá trình phân

chia có thứ tự, ở phôi sẽ diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây

con. Cây có thể phát triển từ một hoặc từ một cụm tế bào phôi.

Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhưng không có quá

trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh

giữa giao tử đực và giao tử cái. Về nguyên tắc tất cả các cây con tái sinh bằng con

đường này thì đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng cha mẹ, nếu

tế bào này được chuyển gen thì các cây tái sinh là các cây chuyển gen (Nguyễn Văn

Uyển, 1992). Nhân giống thực vật qua con đường phát sinh phôi vô tính cho hệ số

nhân rất cao (Dương Tấn Nhựt, 2006).

3.2.2. Một số khía cạnh giả định trong sự hình thành phôi vô tính

Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền

cần thiết cho việc hình thành nên một cơ thể thực vật hoàn thiện với đầy đủ các

chức năng cần thiết. Trong suốt quá trình phát triển, sự biểu hiện gen ở thực vật

được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa của

rất nhiều cơ quan trong cơ thể. Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết

thúc sự biểu hiện của một gen trong mô thực vật tại thời điểm đó, và thay thế nó

bằng sự biểu hiện của gen sinh phôi. Giả thuyết này được đưa ra lần đầu tiên do

Evans và cộng sự (1981), Sharp và cộng sự (1982). Đây cũng là người đầu tiên đưa

ra một số các thuật ngữ như IEDC – inducec embryogenic determined cell nhằm mô

16

tả những tế bào có khả năng sinh phôi xuất phát ban đầu là những tế bào không sinh

phôi. Những tế bào của phôi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gen

sinh phôi thì được gọi là thuật ngữ PEDC – pre-embryogenic determined cell. Cả

IEDC và PEDC đều có chức năng tương tự nhau là nhằm mục đích tái sinh, và cả

hai có thể được gọi chung bằng thuật ngữ EDC – embryogenic determined cell, hay

gọi đơn giản là EC – embryogenic cell. Thuật ngữ EC được sử dụng nhiều hơn bởi

vì sự hình thành phôi vô tính không phải là một hiện tượng chắc chắn sẽ xảy ra của

các EC, do đó thuật ngữ EC cho thấy các tế bào sinh phôi này có tính mềm dẻo

trong một số trường hợp (Carman, 1990).

Các thí nghiệm nhằm hình thành phôi vô tính đều phụ thuộc vào việc mô mẫu

có chứa các PEDC hoặc là EC. Nếu mô cấy chứa các PEDC thì chỉ cần một sự kích

thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi, và quá trình này được gọi là sự hình

thành phôi vô tính trực tiếp bởi vì phôi xuất phát trực tiếp từ mô cấy. Ngược lại, nếu

các mô cấy là những tế bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi thì chúng

cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin

trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con đường sinh phôi (Bùi Trang

Việt, 2002). Các tế bào được sinh ra do nhiều lần nguyên nhiễm được gọi là mô sẹo,

và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính gián tiếp vì phải thông qua

giai đoạn tạo mô sẹo (Merkle và cộng sự, 1995). Sự chuyển vị từ các tế bào mô sẹo

sang trạng thái sinh phôi đi kèm với những thay đổi trong sự sắp xếp của các vi ống

từ định hướng ngẫu nhiên để sắp xếp thành những hàng thẳng song song với nhau

(Wochok, 1973).

Trong thực tế, một mô cấy có thể rơi vào nhiều trạng thái giữa trạng thái có

đặc tính sinh phôi và không sinh phôi, tùy thuộc vào độ tuổi sinh lý của mô cấy đó.

Điều này có thể ảnh hưởng đến việc cảm ứng tạo phôi vô tính. Từ đó có thể giải

thích được tại sao có sự khác biệt về khả năng tạo phôi của các loại mô cấy khác

nhau (Merkle và cộng sự, 1995).

3.2.3. Sự phát sinh phôi từ tế bào soma

Sự phát sinh phôi từ tế bào soma được định nghĩa là một quá trình mà trong đó

một hoặc vài tế bào soma, trong các điều kiện thực nghiệm có thể tham gia vào sự

17

phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hoặc gần

giống như phôi hợp tử.

Giống như các tế bào của mô phân sinh, các tế bào có khả năng sinh phôi có

các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến

dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid ribonucleic cao, thể tích không bào

giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân rất to và đậm màu, đặc biệt là các

tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới

nội chất nhỏ (Ammirato, 1987; Emons, 1994; Thorpe, 1988). Các tế bào có khả

năng sinh phôi được phân biệt rõ ràng với các tế bào không có khả năng sinh phôi

dựa trên những đặc tính trên.

Sự sinh phôi từ tế bào soma trải qua hai giai đoạn:

(1) Mô được nuôi trong môi trường có auxin sẽ tăng sinh nhanh, các tế bào

trong môi trường này sẽ bị khử phân hóa (không còn ở trạng thái phân hóa) và mất

tính hữu cực.

(2) Mô sẹo từ giai đoạn (1) sẽ được chuyển vào môi trường có ít hoặc không

có auxin, trong môi trường này tính hữu cực và sự sinh phôi được cảm ứng với

trạng thái phôi từ hình cầu đến trạng thái hình trái tim và trạng thái hình cá đuối.

3.2.4. Nhân tố tác động đến sự gia tăng số lƣợng phôi

Cho dù nguồn gốc của các tế bào sinh phôi là IEDC hay PEDC thì chức năng

của các tế bào này là như nhau. Tế bào từ cả hai nguồn gốc này đều có thể phát triển

thành phôi vô tính hoặc tham gia vào một chu kỳ mới nhằm sản sinh ra ngày càng

nhiều các tế bào sinh phôi (MeCoy, 1987).

Sự gia tăng các tế bào phôi có nhiều kiểu khác nhau và chịu ảnh hưởng bởi

nhiều nhân tố, một vài nhân tố có thể điều khiển được trong quá trình nuôi cấy và

một số khác thì không. Những nhân tố được nghiên cứu trong việc tăng sinh các tế

bào sinh phôi thì tương tự như những nhân tố tác động trong cảm ứng tạo phôi.

Chẳng hạn như các chất điều hòa sinh trưởng, hàm lượng nitơ, loài thực vật và kiểu

gen của mẫu cấy. Trong trường hợp tăng sinh các tế bào sinh phôi, các nhân tố này

không chỉ quyết định khả năng duy trì và tiếp tục trạng thái sinh phôi mà còn ảnh

18

hưởng đến đặc điểm của chu trình sinh phôi lặp lại. Do đó, các nhân tố này chịu

trách nhiệm kiểm soát những biến đổi trong giai đoạn phát triển của phôi vô tính để

thúc đẩy việc gia tăng các tế bào sinh phôi hoặc kiểm soát những vị trí hay vùng

trên phôi sơ cấp có thể sinh ra các phôi mới (Mekle và cộng sự, 1995).

3.2.5. Một số vấn đề thƣờng gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính

Trước hết, đó là sự xuất hiện các phôi dị thường. Các lá mầm có thể bị xoắn

lại, mô phân sinh ngọn chồi có thể có hình dạng không bình thường hoặc có thể

thiếu. Những trường hợp này cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất

hiện bình thường và sự phát triển của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến

vừa phải các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường như: acid abscissic hoặc

những cách xử lý thấm lọc cao, hay bằng những phương pháp vật lý khác như sấy

khô (Parrott, 1988).

Những thực vật được tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị

biến dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dưỡng. Tuy nhiên, những trường hợp

đó ít xuất hiện ở những cây được tái sinh bởi sự phát sinh phôi vô tính hơn là những

cây được phát sinh từ tái sinh cơ quan (Ammirato, 1987). Nếu những cây được sử

dụng với mục đích nhân giống, thì việc kiểm tra lại kiểu di truyền là rất quan trọng

bằng cách tiến hành kiểm tra độ hữu thụ và chỉ số di truyền cho những đặc điểm

tiêu biểu. Nếu những cây được sử dụng cho mục đích sản xuất thì những kiểu biến

dị nên loại bỏ.

Một điều đáng lưu ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan là

không loại trừ nhau. Vì vậy, những phương pháp làm phát sinh phôi và tái sinh cơ

quan được kết hợp để tối ưu hóa khả năng tái sinh cây. Một điều thú vị là trên cùng

môi trường thuận lợi cho sự phát sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi

trường thích hợp để tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài.

3.3. Đặc điểm của nuôi cấy phôi vô tính

Phôi vô tính có thể xuất hiện trong điều kiện in vitro từ ba nguồn tế bào lưỡng

bội (2n) nuôi cấy đó là: tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành, các mô tái sinh

19

không phải là hợp tử, các lá mầm và trụ dưới lá mầm của phôi và cây con, không có

bất cứ sự phát triển nào của mô sẹo.

Bản chất các phôi ngẫu nhiên phát triển như thế nào vẫn cần phải nghiên cứu

nhiều hơn nữa. Phát sinh phôi vô tính có thể được khởi đầu theo hai con đường:

phát sinh phôi trực tiếp từ mô nuôi cấy không qua giai đoạn trung gian tạo mô sẹo,

phôi được hình thành từ những tế bào tiền phôi.

Mặc dù các tế bào tiền phôi có khả năng biệt hóa nhưng sự phát triển của

chúng có thể bị ngăn cản do sự mất cân bằng của các chất trong môi trường nuôi

cấy. Sự hình thành các cụm phát triển phôi và sự kết dính phôi có thể xảy ra nếu

môi trường có nồng độ auxin cao sau khi các tế bào phôi đã biệt hóa (Kolenbach,

1978). Hai loại môi trường khác nhau có thể được sử dụng: một môi trường dùng để

tạo các tế bào có khả năng phát sinh phôi và một môi trường khác để cho các tế bào

đó phát triển thành phôi. Môi trường thứ nhất thường phải có auxin, còn môi trường

thứ hai không có auxin hoặc ở nồng độ rất thấp. Đối với một số thực vật các giai

đoạn trên có thể xảy ra ở môi trường thứ nhất, môi trường thứ hai được dùng cho sự

phát triển của cây con (Ammiratom, 1983).

Những thành phần hóa học quan trọng nhất trong môi trường cảm ứng là auxin

và nitơ dạng khử. Lượng nitơ khử cần thiết trong cả môi trường thứ nhất và môi

trường thứ hai (Ammirato, 1983). Trong nuôi cấy Cà rốt dại, việc bổ sung 10mM

NH₄Cl vào môi trường phát triển phôi có chứa 12 – 40mM HNO₃(Wetherell and

Dougall, 1976). Các nguồn nitơ khác không đặc hiệu cho cảm ứng phát sinh phôi

mặc dù ở nồng độ thấp, các dạng nitơ hữu cơ có hiệu quả hơn các dạng nitơ vô cơ.

Vai trò của cytokinin trong quá trình phát sinh phôi không rõ ràng do những

kết quả trái ngược. Ở huyền phù tế bào Cà rốt, khi cấy chuyền sang môi trường

không có auxin nhưng có zeatin ở nồng độ 0,1μM đã kích thích sự phát sinh phôi,

quá trình này bị ức chế khi bổ sung thêm kinetin hoặc BAP vào môi trường nuôi

cấy (Furimura and Komamine, 1975). Tác động ức chế của các cytokinin ngoại sinh

có thể là do làm tăng các cytokinin nội sinh trong quá trình phát triển của phôi (Al-

Abta and Collin, 1979).

20