Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử sắc ký miễn dịch nano từ tính tự tạo trong phát hiện nhanh kháng nguyên NS1 của virus Dengue

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA QUE THỬ SẮC KÝ

MIỄN DỊCH NANO TỪ TÍNH TỰ TẠO TRONG PHÁT HIỆN NHANH

KHÁNG NGUYÊN NS1 CỦA VIRUS DENGUE

Đỗ Như Bình^1,2, Lê Văn Nam¹

TÓM TẮT

Mục tiêu: Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử sắc ký miễn dịch sử dụng hạt nano

từ tính tự tạo phát hiện kháng nguyên NS1 của virus Dengue. Đối tượng và phương pháp: Sử

dụng hạt nano từ tính gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên NS1 kết hợp hiện màu

enzyme để chế tạo que thử sắc ký mi ễn dịch từ tính, áp dụng phát hiện NS1 trong các mẫu

nhiễm chủ động và huyết thanh của bệnh nhân để xác định ngưỡng phát hiện, độ nhạy, độ đặc

hiệu. Kết quả: Que thử có khả năng phát hiện NS1 từ mức 0,025 ng/ml đối với týp 1 và týp 3;

0,01 ng/ml đối với týp 2 và 0,1 ng/ml đối với týp 4. Độ nhạy và độ đặc hiệu đều đạt 100%, cao

hơn so với que thử thương mại Dengue Ag Rapid Test CE (CTK Biotech, Mỹ) và không có

phản ứng chéo với kháng nguyên NS1 của virus zika cũng như virus Chikungunya, viêm não

Nhật Bản, HBV và HCV. Kết luận: Que thử nano từ tính có khả năng xác định nhanh NS1

trong huyết thanh bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue.

Từ khóa: Sốt xuất huyết Dengue; Hạt nano từ tính; Que thử sắc ký miễn dịch từ tính.

Evaluate the Sensitivity and Specificity of Home-Made Magnetic

Immunochromatographic Test Strip Using Magnetic Nanoparticle for

Rapid Detection of Dengue NS1 Antigen

Summary

Objectives: To evaluate the sensitivity and specificity of immunochromatographic test strips

using nanoparticles from the detection of NS1 antigen of Dengue virus. Subjects and

methods: Using magnetic nanoparticles with NS1 antigen-specific monoclonal antibodies

combined with a reporter enzyme to make magnetic immunochromatographic test strips,

applying NS1 detection in actively NS1 spiked samples and patient serum to determine

threshold, sensitivity and specificity. Results: The threshold comes up with a limit of detection of

spiked NS1 for 4 serotypes are 0.025 ng/mL of DENV-1 and DENV-3; 0.01 ng/mL of DENV-2

and 0.1 ng/mL DENV-4. The sensitivity and specificity of nanomagnetic ICT were 100%, higher

than the commercial Dengue Ag Rapid Test CE (CTK Biotech, USA) and there is no cross-

reactivity with the recombinant NS1 antigen of Zika, Chikungunya, Japanese Encephalitis, HBV

and HCV. Conclusion: The magnetic nanoparticle strip test holds a great potential to be

applied to NS1 detection in the sera of Dengue haemorrhagic fever patients.

* Keywords: Dengue haemorrhagic fever; Magnetic nanoparticle; Immunochromatographic

strip test.

¹Bộ môn - Khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y

²Ban Khoa học Quân sự, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y

Người phản hồi: Đỗ Như Bình (nhubinh.do@vmmu.edu.vn)

Ngày nhận bài: 05/5/2021

Ngày bài báo 26/5/2021

40

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

cơ bản của kỹ thuật này so v ới các kỹ

thuật chẩn đoán khác như ELISA, RT-

PCR là có độ nhạy thấp [2, 3, 4, 6].

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là một

bệnh truyền nhiễm lây truyền qua muỗi

gây ra bởi virus Dengue, bao gồm

4 týp DENV-1, DENV-2, DENV-3 và

DENV-4; trong đó, DENV-2 là týp thường

hay gây ra các biến chứng nguy hiểm cho

người bệnh [1, 7]. Đây được coi là m ột

trong mười nguyên nhân hàng đầu về tỷ

lệ mắc bệnh, tử vong trên toàn thế giới.

Theo ước tính của WHO, có khoảng 3 -

3,9 tỷ người đang sống trên 128 quốc gia

có nguy cơ nhiễm virus Dengue. Bệnh

ảnh hưởng đến khoảng 100 triệu người

mỗi năm, trong số này có khoảng 500.000

người phát triển thành thể nặng và có >

25.000 người, chủ yếu là trẻ em tử vong

trên toàn thế giới [8].

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy

khi sử dụng hạt nano/bi từ sẽ cho phép

định lượng được cường độ tín hiệu trong

toàn bộ lớp nitrocellulose tại vị trí vạch tín

hiệu [5, 8]. Ngoài ra, sắc ký miễn dịch sử

dụng hạt nano/bi từ còn có ưu điểm nâng

cao độ nhạy phát hiện lên hàng chục lần

nhờ khả năng làm giàu mẫu bằng công

nghệ phân tách từ tính [5]. Trong nghiên

cứu này, chúng tôi kết hợp giữa hạt nano

từ tính với kháng thể đơn dòng đặc hiệu

kháng nguyên NS1 kết hợp khuếch đại tín

hiệu bằng hiện màu enzyme để tạo que

thử nano từ tính nhằm: Đánh giá độ nhạy

và độ đặc hiệu của que thử sắc ký miễn

dịch nano từ tính tự t ạo trong phát hiện

nhanh kháng nguyên NS1, giúp chẩn

đoán nhanh bệnh SXHD.

Tại Việt Nam, SXHD đã trở thành dịch

hàng năm và c ả 4 týp virus Dengue đã

được xác định đang lưu hành, phân bố

khắp cả n ước. Biểu hiện lâm sàng chủ

yếu của bệnh là sốt cấp diễn và xuất

huyết với nhiều dạng khác nhau, đặc biệt

có thể d ẫn đến tử vong do giảm lượng

máu lưu hành dẫn đến tình trạng sốc [1].

Việc chẩn đoán xác định nhanh tình trạng

sốt có phải do virus Dengue hay không

ngay từ những ngày đầu là một nhu cầu

cấp thiết, đặc biệt với týp virus nguy hiểm

như DENV-2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu, hóa chất và thi ết bị

nghiên cứu

* Vật liệu:

- Mẫu huyết thanh: Các mẫu bệnh

phẩm, trong đó có 50 mẫu của người

khỏe mạnh và 70 mẫu dương tính với

Dengue đã kiểm chứng bằng RT-qPCR,

thu thập tại Khoa Truyền nhiễm, Bệnh

viện Quân y 103.

Hiện nay, chẩn đoán SXHD bằng que

thử s ắc ký miễn dịch phát hiện kháng

nguyên NS1 được ưu tiên nghiên cứu do

thời gian trả k ết quả nhanh và dễ thực

hiện. Đa số nghiên cứu đều sử dụng hạt

nano vàng làm chất đánh dấu tạo cộng

hợp chế tạo que thử. Tuy nhiên, hạn chế

- Que thử sắc ký miễn dịch nano từ tính:

Que thử (do nhóm nghiên cứu tự chế tạo)

có cấu tạo gồm cặp kháng thể kháng NS1

có mã hiệu lần lượt là HM164 và HM026

(East Coast Bio, Mỹ), trong đó HM164 là

41

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

kháng thể b ắt giữ g ắn trên que thử

(1,5 µg/cm trên màng nitrocellulose

HF120) ở vị trí vạch thử nghiệm và HM026

là kháng thể phát hiện gắn hạt nano từ

(kích thước = 100 nm và lượng sử dụng

là 0,5 µl/phản ứng) và đã được biotin

hóa. Vạch kiểm chứng là kháng thể đa

dòng kháng IgG chuột. Que thử hoạt

động theo nguyên lý Sandwich, kết quả

dương tính sẽ cho hai vạch màu vàng

(màu hạt nano từ), hiện màu enzyme sẽ

cho hai vạch màu xanh (phản ứng cơ

chất TMB với Biotin-Streptavidin gắn HRP).

Sau khi que thử hút hết dịch, cộng hợp

gắn HRP được pha loãng 200 lần (tương

ứng với nồng độ cộng hợp 0,25 µg/ml) và

tiếp tục nhỏ vào que thử. Sau khi đã hút

hết dịch trong ống, bổ sung thêm 50 µl

đệm chạy để đẩy hết lượng cộng hợp còn

dư trên que thử. Sau khi hút hết đệm, que

thử được hiện màu trong 200 µl cơ chất

TMB. Tiếp tục đọc kết quả trong 10 phút.

Để thử nghiệm phản ứng chéo của

que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát

hiện nhanh NS1, chúng tôi tiến hành phân

tích với protein NS1 tái tổ hợp của virus

Zika, Chikungunya, Viêm não Nhật Bản

với nồng độ 100 ng/ml/que thử. Các mẫu

HBV và HCV được nhiễm chủ động 10⁶

phiên bản thể gen/que thử.

* Hóa chất: Kháng nguyên Dengue

virus NS1 tái tổ hợp serotype 1-4. Cụ thể:

DENV1-NS1 chủng Nauru/Western

Pacific/1974;

DENV2-NS1

chủng

Thailand/16681/84; DENV3-NS1 chủng

Sri Lanka D3/H/IMTSSA-SRI/2000/1266;

DENV4-NS1 chủng Dominica/814669/1981.

Cộng hợp Streptavidin-PolyHRP 80

65R-S118 (Fitzgerald, Mỹ). NHS-Biotin

(Sigma-Aldrich). Đệm PBS pH 7,4 có b ổ

sung thêm 0,5% BSA và 0,01% Tween 20.

* Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của

que thử sắc ký miễn dịch từ tính phát hiện

nhanh NS1 của virus Dengue trong các

mẫu bệnh phẩm:

Để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu

của que thử, 70 mẫu huyết thanh dương

tính và 50 mẫu huyết thanh âm tính với

virus Dengue (đã được kiểm tra bằng RT-

qPCR) được pha loãng 10 lần trong đệm

chạy, sau đó tiến hành phân tích theo quy

trình mục 2.1. Đồng thời, so sánh kết quả

với que thử thương mại Dengue Ag

Rapid Test CE (CTK Biotech, Mỹ).

* Thiết bị: Máy vortex (Labnet); Giá từ

(Invitrogen); Pipet đơn kênh; Một số thiết

bị thông thường khác được trang b ị ở

phòng thí nghiệm.

2. Phương pháp nghiên cứu

* Xác định ngưỡng phát hiện, phản

ứng chéo của que thử sắc ký miễn dịch từ

tính phát hiện nhanh NS1:

* Thời gian và địa điểm nghiên cứu:

- Thời gian: Từ 8/2020 - 3/2021.

Để đánh giá ngưỡng phát hiện của

que thử, 4 týp kháng nguyên NS1 tái tổ

hợp được nhiễm chủ động vào đệm chạy

với các nồng độ biến đổi từ 1 - 0,05

ng/ml/týp, tiến hành cô đặc và nhúng que

thử. Đánh giá kết quả ở nhiệt độ phòng

sau 10 phút.

- Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên

cứu Y D ược học Quân sự, Học viện

Quân y; Khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện

Quân y 103.

* Xử lý s ố liệu: Sử d ụng phần mềm

STATA 14.0.

42

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Xác định ngưỡng phát hiện, phản ứng chéo của que thử sắc ký miễn dịch

từ tính phát hiện nhanh NS1

* Ngưỡng phát hiện của que thử:

- Trước khi nhỏ cơ chất TMB:

Hình 1: Ngưỡng phát hiện của que thử sắc ký miễn dịch từ tính phát hiện nhanh NS1

khi không hiện màu cộng hợp Streptavidin-PolyHRP80.

Số chỉ trên que thử là các nồng độ kháng nguyên NS1 tái tổ hợp nhiễm chủ động đối

với từng týp; CL: Vạch kiểm chứng; TL: Vạch thử nghiệm.

Kết quả hình 1 cho thấy que thử có thể phát hiện được kháng nguyên NS1 từ mức

nhiễm chủ động là 0,25 ng/ml đối với týp 1 và týp 3; 0,1 ng/ml đố i với týp 2 và 1 ng/ml

đối với týp 4.

- Sau khi nhỏ cơ chất TMB:

Hình 2: Ngưỡng phát hiện của que thử sắc ký miễn dịch từ tính phát hiện nhanh NS1

bằng phản ứng hiện màu cộng hợp Streptavidin-PolyHRP80.

Số chỉ trên que thử là các nồng độ kháng nguyên NS1 tái tổ hợp nhiễm chủ động

đối với từng týp; CL: vạch kiểm chứng; TL: vạch thử nghiệm

Khi tiến hành hiện màu cộng hợp enzyme bằng cơ chất TMB, que thử có thể phát

hiện NS1 từ mức nhiễm chủ động là 0,025 ng/ml đối với týp 1 và týp 3; 0,01 ng/ml đối

với týp 2 và 0,1 ng/ml đối với týp 4.

Như vậy, độ nhạy của que thử đều tăng hơn 10 lần so với phương pháp chạy que

thử thông thường.

43

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

* Phản ứng chéo của que thử:

A. Chưa hiện màu enzyme

B. Đã hiện màu enzyme

Hình 3: Thử nghiệm đánh giá phản ứng chéo của que thử sắc ký miễn dịch từ tính với

NS1 của các virus khác.

(1) NS1 của virus Zika tái tổ hợp (100 ng/ml); (2): Virus Chikungunya; (3): Virus Viêm

não Nhật Bản; (4): HBV; (5): HCV; (6): Mẫu dương tính NS1 (1 ng/ml); TL: Vạch thử

nghiệm; CL: Vạch kiểm chứng.

Kết quả cho th ấy que th ử không có phản ứng chéo với kháng nguyên NS1 tái tổ

hợp của chủng virus Zika, cũng như kháng nguyên NS1 của các Flaviviridae virus khác

được thử nghiệm ở mức nồng độ cao h ơn nhiều lần so v ới thường gặp trên thực tế.

Bên cạnh đó, không có phản ứng chéo với các tác nhân HBV và HCV, là hai virus hay

gặp với tỷ lệ người nhiễm cao ở Việt Nam.

2. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử sắc ký miễn dịch từ tính phát

hiện nhanh NS1 của virus Dengue trong các mẫu bệnh phẩm

Bảng 1: Kết quả thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm của hai loại

que thử phát hiện nhanh NS1.

Kết quả dương tính

Kết quả âm tính

khi phân tích bằng que thử

66

4

Dương tính với

RT-qPCR

Que thử Dengue

Ag Rapid Test

CE (CTK Biotech,

Mỹ)

(PA)

(ND)

Âm tính

0

50

với RT-qPCR

(PD)

(NA)

70

0

Dương tính với

RT-qPCR

Que thử phát

triển trong nghiên

cứu

(PA)

(ND)

Âm tính

0

50

với RT-qPCR

(PD)

(NA)

44

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

Kết quả cho thấy, khi phân tích trên khác như Chikungunya, viêm não Nhật

que thử thương mại, trong s ố 70 mẫu Bản, West Nile. Do vậy, chúng tôi đã tiến

bệnh phẩm dương tính chỉ có 66 mẫu hành sử dụng que thử từ tính phát hiện

dương tính thực sự và 4 m ẫu âm tính. NS1 tái tổ hợp của các Flaviviridae virus

Trái lại, với que thử nano từ tính đã phát trên, kết quả cho thấy que thử đã phát

hiện được toàn bộ 70 mẫu bệnh phẩm triển trong nghiên cứu này có tính đặc

dương tính, trong đó 4 m ẫu được phát hiệu rất cao, cho phép chẩn đoán phân

hiện bằng phản ứng hiện màu enzyme biệt được NS1 đi từ các loài Flaviviridae

với cơ chất TMB và đượ c kiểm tra bằng virus khác.

nested RT-PCR.

Độ nhạy và độ đặc hiệu phụ thuộc rất

Như v ậy, trên tập hợp mẫu đã được nhiều vào kháng thể s ử d ụng. Các

phương pháp miễn dịch phát hiện kháng

nguyên NS1 đều dựa trên cấu hình kẹp

đôi vốn yêu cầu một cặp kháng thể có ái

lực cao và có khả năng nhận biết hai yếu

tố quyết định kháng nguyên khác nhau

trên NS1. Do virus Dengue có 4 kiểu

huyết thanh với trình tự acid amin của

NS1 có độ t ương đồng không cao nên

việc lựa chọn được một tổ hợp kháng thể

cho phép phát hiện NS1 đi từ tất cả các

kiểu huyết thanh có ý nghĩa rất quan

trọng, quyết định tính chính xác của

phương pháp phân tích [6]. Cặp kháng

thể đơn dòng kháng NS1 sử dụng trong

que thử s ắc ký miễn dịch từ tính của

chúng tôi hoàn toàn đáp ứng yêu cầu.

thử nghiệm, độ nhạy của que thử sắc ký

miễn dịch từ tính phát hiện nhanh NS1

đạt 100% và độ đặc hiệu đạt 100%, cao

hơn so với que thử thương mại hiện đang

được sử d ụng phổ biến tại Việt Nam là

Dengue Ag Rapid Test CE (CTK Biotech,

Mỹ) với độ nhạy đạt 94,3% và độ đặc

hiệu đạt 100%.

BÀN LUẬN

Theo công bố của một số nhà sản xuất

que thử thương mại hiện đang lưu hành

tại thị trường Việt Nam như que thử

Dengue Ag Rapid Test CE (CTK Biotech,

Mỹ), que thử Panbio® Dengue Early

Rapid (Hàn Quốc) có ng ưỡng phát hiện

với kháng nguyên NS1 tái tổ hợp của các

týp như sau: 0,75 ng/ml đối với týp 1;

0,25 ng/ml đối với týp 2; 3,5 ng/ml đối với

týp 3 và 2,4 ng/ml đối với týp 4 [2, 4]. Như

vậy, với ngưỡng phát hiện NS1 như đã

trình bày ở trên, độ nhạy của que thử

phát triển trong nghiên cứu này cao hơn

rất nhiều, đặc biệt với týp DENV-2, độ

nhạy phát hiện cao gấp 25 lần so với các

que thử thương mại.

Thêm vào đó, các hạt nano từ tính với

kích thước nhỏ có r ất nhiều ưu thế như

diện tích bề mặt lớn, sự ổn định lâu dài và

khả n ăng di chuyển lên màng dễ dàng

hơn hạt nano vàng và tránh khả năng bị

tụ ở dưới màng như hạt nano carbon.

So với các cách phát hiện dựa trên tín

hiệu quang học (có màu, huỳnh quang)

chỉ cho phép quan sát được tín hiệu trên

bề mặt của màng nitrocellulose, sử dụng

hạt nano từ sẽ cho phép định lượng được

cường độ tín hiệu trong toàn bộ l ớp

nitrocellulose tại vị trí vạch tín hiệu. Do

vậy, ngoài khả n ăng định lượng, sắc ký

Về phản ứng chéo của que thử, do độ

tương đồng về trình tự protein NS1 giữa

chủng virus Dengue và chủng virus Zika

đạt tới 44%, ngoài ra còn một số virus

45

Quyết định số 458/QĐ-BYT ngày 16 tháng 02

năm 2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế 2011.

miễn dịch sử dụng hạt nano từ còn có ưu

điểm nâng cao độ nhạy phát hiện lên

hàng chục lần [5]. Một ưu điểm khác của

việc sử dụng hạt nano từ làm cộng hợp

phát hiện trong kỹ thuật sắc ký miễn dịch

là khả n ăng làm giàu mẫu bằng công

nghệ phân tách từ tính nên có thể dùng

cộng hợp phát hiện với hạt nano từ để cô

đặc mẫu trước khi phân tích bằng que

thử sắc ký miễn dịch [8], cùng với đó việc

sử dụng cộng hợp phát hiện khuếch đại

tín hiệu bằng phức hợp streptavidine gắn

enzyme HRP tương tự như ELISA đã

giúp cho que thử nano từ tính có độ nhạy,

độ đặc hiệu và độ chính xác đạt 100%,

cao hơn các que thử sử d ụng hạt nano

vàng và tương đương với phương pháp

định lượng RT-PCR.

2. Hang VT, Nguyet NM, Trung DT, Tricou V,

Yoksan S, et al. Diagnostic accuracy of NS1

ELISA and lateral flow rapid tests for Dengue

sensitivity, specificity and relationship to

viraemia and antibody responses. PLoS Negl

Trop Dis 2009 Jan; 3(1):e360.

3. Cucunawangsih, Nata Pratama Hardjo

Lugito. Trends of Dengue disease epidemiology.

Virology: Research and treatment. SAGL

Journals 2017; (8):1-6.

4. Dussart P, Petit L, Labeau B, Bremand

L, Leduc A, et al. Evaluation of two new

commercial tests for the diagnosis of acute

dengue virus infection using ns1 antigen

detection in human serum. PLoS Negl Trop

Dis 2008; 2(8): e280.

5. Mingyuan Gao et al. Lateral Flow

Immunochromatographic Assay for sensitive

pesticide detection by using Fe3O4 nanoparticle

aggregates as color reagents. Anal. Chem

2011; 83(17), 6778-6784.

KẾT LUẬN

Que thử nano từ tính phát hiện nhanh

kháng nguyên NS1 theo nguyên lý

Sandwich, có ngưỡng phát hiện NS1 ở

nồng độ thấp (0,1 - 0,01 ng/ml). Không có

phản ứng chéo với các Flaviviridae virus

khác như Zika, Chikungunya hay virus

viêm não Nhật Bản. Que thử có khả năng

chẩn đoán đúng những trường hợp

không có bệnh và những trường hợp mắc

SXHD thực sự là 100%, cao hơn so với

que thử thương mại Dengue Ag Rapid

Test CE (CTK Biotech, Mỹ).

6. Jihoo Lee et al. Development and

clinical evaluation of

a

highly accurate

Dengue NS1 rapid test: From the preparation

of a soluble NS1 antigen to the construction of

an RDT. Diagnostic Microbiology and Infectious

Disease 2015; 82:128-134.

7. World Health Organization. Global

Strategy for Dengue Prevention and Control

2012 - 2020. Geneva, Switzerland: WHO

2012:1-43.

8. Xiaolin Huang, Zoraida P Aguilar,

et al. Membrane-based lateral flow

immunochromatographic strip with nanoparticles

as reporters for detection: A review. Biosensors

and Bioelectronics 2016;75(15): 166-180.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ Y tế. Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị

sốt xuất huyết Dengue. Ban hành kèm theo

46