Báo cáo tóm tắt Đề tài Xây dựng quy trình sản xuất cây giống in vitro hai loài phong lan có giá trị cao: Cẩm báo (Hyglohilus parishii Pfitz.) và Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe)
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN
VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
TT
1
Họ và tên
Đơn vị công tác
Thành viên
ThS.TRẦN QUANG Khoa Sinh-Môi trường, trường ĐHSP-
DẦN ĐHĐN
2
3
4
TS. VÕ CHÂU TUẤN Khoa Sinh-Môi trường, trường ĐHSP-
ĐHĐN
TS. NGUYỄN MINH Khoa Sinh-Môi trường, trường ĐHSP-
LÝ
ĐHĐN
LÊ THỊ TRINH
Khoa Sinh-Môi trường, trường ĐHSP-
ĐHĐN
Đơn vị phối hợp chính
Trung tâm Công nghệ sinh học - Sở khoa học Công nghệ Đà Nẵng
5
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...................................................................................................... 7
1. Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................... 7
2. Mục tiêu đề tài...................................................................................... 8
Cẩm báo.................................................................................................. 25
4.1. Kết luận ........................................................................................... 27
4.2. Đề nghị............................................................................................ 27
i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D
BE
PE
: Diclorophenoxyacetic acid
: Dịch chiết chuối (Banana extract)
: Dịch chiết khoai tây (Potato
extract)
AC
BA
: Than hoạt tính (Active carbon)
: 6 - benzyl adenine
BAP
B5
: 6 - benzyl amino purine
: Gamborg (1968)
CW
IBA
KC
: Nước dừa (coconut water)
: Indole 3 - butyric acid
: Knudson C (1965)
KIN
IAA
ĐHST
M
: Kinetin
: Indole-3-acetic acid
: Điều hòa sinh trưởng
: Mitra et al.
MKC
MS
NAA
PM
: Modified Knudson ‘C’
: Murashige và Skoog (1962)
: α-naphthalen acetic acid
: Phytamax
RE
SH
VW
AC
PLB
: Robert Ernst (1979)
: Schenk và Hildebrandt (1972)
: Vacin và Went (1949)
: Than hoạt tính (active charcoal)
: Protocorm
ctv
: Cộng tác viên
ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Đơn vị: ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung
- Tên đề tài: Xây dựng quy trình sản xuất cây giống in vitro hai
loài phong lan có giá trị cao: Cẩm báo (Hyglohilus parishii Pfitz.) và
Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe).
- Mã số: B2016-DNA-35-TT
- Chủ nhiệm: ThS. Trần Quang Dần
- Cơ quan chủ trì: Đại học Đà Nẵng
- Thời gian thực hiện: 12/2016 – 11/2018
2. Mục tiêu đề tài
Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định các điều kiện tốt nhất cho
mỗi giai đoạn nuôi cấy, từ đó xây dựng quy trình nhân giống in vitro của hai
loài lan: Cẩm báo và Huyết nhung trơn.
3. Tính mới và tính sáng tạo
Nghiên cứu này đã khảo sát bổ sung ảnh hưởng của những điều kiện
nuôi cấy khác nhau (chưa được đề cập trong các nghiên cứu trước đó) đến
quá trình nhân giống in vitro của hai loài lan nghiên cứu. Thông qua đó,
những quy trình nhân giống in vitro hoàn chỉnh có hiệu quả đã được thiết
lập.
4. Kết quả nghiên cứu
Căn cứ vào kết quả thu được, quy trình nhân giống đối với mỗi loài
lan thu được như sau:
Đối với Huyết nhung trơn:
Quả lan 4 - 5 tháng sau khi ra hoa đã được khử trùng hiệu quả bằng sự
kết hợp cồn 70% trong 30 giây, HgCl2 0,1% trong 5 phút, và NaOCl 5%
trong 15 phút. Hạt nảy mầm với tỉ lệ cao nhất trên môi trường cơ bản MS.
Các PLB có khả năng nhân nhanh tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường cơ
bản có bổ sung 15% CW, 1,0 mg/L KIN, và 0,5 mg/L NAA. Các chồi hình
thành từ PLB và nhân nhanh tốt nhất, với hệ số nhân đạt 15,33 chồi/mẫu PLB
sau 12 tuần, trên môi trường cơ bản có bổ sung 15% CW và 1,5 mg/L KIN.
Khả năng tăng trưởng chiều cao của chồi tốt nhất, đạt 1,07 cm sau 8 tuần,
khi nuôi cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung 15% CW, 2,0 mg/L BA, và
0,25 mg/L NAA. Sự cảm ứng rễ tốt nhất, với 2,4 rễ/chồi và chiều dài rễ đạt
1,74 cm sau 8 tuần, khi nuôi cấy chồi trên môi trường cơ bản có bổ sung 15%
ii
CW và 1,0 mg/L NAA. Cây con đã thể hiện sự thích nghi tốt ở điều kiện
vườn ươm có nhiệt độ trung bình 28 ± 5oC, độ ẩm 80 - 90%, và ánh sáng tự
nhiên, khi trồng trên giá thể dớn + than (tỉ lệ 1:1), với tỉ lệ sống sót 91,6%.
Đối với lan Cẩm báo:
Hiệu quả khử trùng và nảy mầm của hạt tốt nhất với các điều kiện
tương tự như lan Huyết nhung trơn. Các PLB nhân nhanh tốt nhất khi nuôi
cấy trên môi trường cơ bản có bổ sung 0,5 mg/L BA và 0,25 mg/L IBA. Chồi
hình thành từ PLB và có khả năng nhân nhanh tốt nhất khi nuôi cấy trên môi
trường cơ bản có bổ sung 1,5 mg/L BA, với hệ số nhân đạt 2,17 chồi/mẫu
PLB sau 8 tuần. Sự tăng trưởng chiều cao chồi tốt nhất khi nuôi cấy trên môi
trường cơ bản có bổ sung 0,5 g/L AC và 3,0 mg/L BA, với chiều cao 1,1 cm
sau 8 tuần nuôi cấy. Rễ được hình thành với tỉ lệ cao nhất, 2,6 rễ/chồi sau 8
tuần, khi nuôi cấy chồi trên môi trường cơ bản có bổ sung 0,5 g/L AC và 1,5
mg/L NAA. Cây con được trồng trên giá thể dớn có khả năng thích nghi và
sinh trưởng tốt ở điều kiện vườn ươm với cường độ chiếu sáng 50% so với
ánh sáng tự nhiên, chế độ tưới nước 2 lần/ngày và 0,5 L/m2, và chu kì bón
dinh dưỡng khoáng (phân bón Đầu trâu NPK 30-15-10) 10 ngày/lần.
5. Sản phẩm
- Sản phẩm khoa học:
+ 01 bài báo đăng trên tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng:
Trần Quang Dần, Nguyễn Minh Lꢀ, Vꢁ Châu Tuấn (2018). Nhân giống in
vitro loài hoa lan quꢀ hiếm Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana
Rolfe). Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 3(124): 89-93.
- Sản phẩm đào tạo:
+ 01 Học viên bảo vệ thành công luận văn thạc sĩ theo đề tài: Nghiên cứu
ảnh hưởng của một số nhân tố sinh thái đến khả năng sinh trưởng của hai
loài cây lan Cẩm báo (Hygrochilus parishii) và Thạch học tía (Dendrobium
officinale Kimura et Migo) trong giai đoạn vườn ươm.
- Sản phẩm ứng dụng:
+ 02 quy trình nhân giống in vitro của hai loài lan Cẩm báo và Huyết nhung
trơn.
+ 200 cây giống in vitro của hai loài lan Cẩm báo và Huyết nhung trơn được
duy trì trong phòng thí nghiệm.
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng
ứng dụng
6.1. Hiệu quả giáo dục và đào tạo
Đề tài nghiên cứu đã đóng góp một phần vào việc đào tạo kiến thức
chuyên ngành và kĩ năng nghiên cứu khoa học cho sinh viên, học viên tham
iii
INFORMATION OF RESEARCH RESULTS
1. General information
- Project title: The establishment of in vitro propagation procedures
of two high value orchids, Hyglohilus parishii Pfitz. and Renanthera
imschootiana Rolfe
- Code number: B2016-DNA-35-TT
- Implementing Institution: The University of Da Nang
2. Objective
- The objective of research is to establish the best suitable conditions
for each the step of in vitro propagation of two orchids, Hyglohilus parishii
Pfitz. and Renanthera imschootiana Rolfe
3. Creativeness and innovativeness
- This research investigated the effects of different culture
conditions, which have not been mentioned in previous reports, on each the
step of in vitro propagation of H. parishii Pfitz. and R. imschootiana Rolfe.
From the findings, the procedures of in vitro propagation of two orchids
examined were established.
4. Research results
The in vitro propagation procedures of two orchids examined were
established as follows:
For R. imschootiana Rolfe in vitro propagation:
Four to five-month-old fruits were effectively disinfected by
detergents: EtOH 70% for 30 s, HgCl2 0.1% for 5 min, and NaOCl 5% for
15 min. Seeds were germinated in culture medium containing the full
strength MS salts (included vitamins). The PLBs were proliferated rapidly in
the MS medium contained 15% CW, 1.0 mg/L KIN, and 0.5 mg/L NAA.
The highest shoot generation and proliferation were obtained in the MS
medium contained 15% CW and 1.5 mg/L KIN, which formed 15.33
shoots/PLB sample after 12 weeks of the culture. The shoot elongation,
which the shoot height reached to 1.07 cm after 8 weeks of the culture, was
obtained in the MS medium contained 15% CW, 2.0 mg/L BA, and 0.25
mg/L NAA. The rooting was induced with addition of 1.0 mg/L NAA and
15% CW to the MS medium, which formed 2.4 roots/shoot and 1.74 cm root
iv
length at 8 weeks after the culture. The transplanted plantlets were
acclimated in nursery condition with 28 ± 5oC temperature, 80 - 90%
humidity and natural light. The survival plantlet rate was 91.6% in potting
mixture containing sphagnum moss and charcoal with 1:1 ratio.
For H. parishii Pfitz. in vitro propagation:
Effectiveness of the seed disinfection and germination were obtained
in the conditions similar with that of R. imschootiana Rolfe. The PLBs were
proliferated rapidly in the MS medium contained 0.5 mg/L BA and 0.25
mg/L IBA. The highest shoot generation and proliferation were obtained in
the MS medium contained 1.5 mg/L BA, which formed 2.17 shoots/PLB
sample at 8 weeks after the culture. The shoot elongation, which the shoot
height reached to 1.1 cm at 8 weeks after the culture, was occured in the MS
medium contained 0.5 g/L AC and 3.0 mg/L BA. The rooting was induced
with addition of 1.5 mg/L NAA and 0.5 g/L AC to the MS medium, which
formed 2.6 roots/shoot and 2.3 cm root length at 8 weeks after the culture.
The transplanted plantlets were acclimated in the nursery condition with
83.3% of survival plantlet rate in potting mixture containing sphagnum moss.
The plantlets also grown well under conditions with the 50% natural light,
0.5 L/m2 of watering and 2 times/day, and 10 days/times of fertilization (Đầu
trâu NPK 30-15-10).
5. Products
- Scientific publication:
+ A research paper was published in Journal of Science and Technology, The
University of Da Nang: Tran Quan Dan, Nguyen Minh Ly, Vo Chau Tuan
(2018) In vitro propagation ò a precious orchid species renanthera
imschootiana Rolfe. Journal of Science and Technology, The University of
Da Nang, 3(124): 89-93.
- Student Training:
+ A graduated student of the Master degree with thesis topic: Influence of
some ecological factors on the growth ability of two orchid species
Hygrochilus parishii and Dendrobium officinale Kimura et Migo) in the
nursery stage.
- Others:
+ 02 the procedures of in vitro propagation with the detailed information of
two orchids Hygrochilus parishii and Dendrobium officinale Kimura et Migo
+ 200 in vitro regenerated plantlets of two orchids Hygrochilus parishii and
Dendrobium officinale Kimura et Migo are maintaining in laboratory.
6. Effectiveness of research results, and their transfer and applicability
v
6.1. Education and training effectiveness
This research supported for tranining advanced acknowledges and
research skills to participants who are undergraduated/graduated students
following the disciplines of Ecology and Biotechnology at The College of
Education, The University of Da Nang. Moreover, information from research
results are vauable reference materials for training and educating related
courses.
6.2. Socio-economic effectiveness
The research results supply a potential solution for conservation of
H. parishii Pfitz. and R. imschootiana Rolfe from threaten extinct in Viet
Nam. Moreover, the procedures of in vitro propagation (if applied) would
supply the in vitro plantlets that can deal with demands of domestic orchid
production as well as of exports, which contribute to socio-economic
development.
6.3. Transfer and applicability
The research results (02 the procedures of in vitro propagation) with
different forms are able to transfer to the Centers, Institutes, and others
where/who relate to plant production field for producing plantlets and
studying in advance of the production.
vi
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam được biết đến như một quốc gia có sự đa dạng và nhiều loài
hoa lan quꢀ hiếm. Theo đánh giá sơ bộ của Averʹjanov và ctv (2003), Việt
Nam có khoảng 152 chi với 2.500 loài hoa lan, phân bố rộng rãi trong các
điều kiện môi trường tự nhiên khác nhau. Hiện nay, nhiều loài hoa lan đã
được khai thác, trồng và sử dụng tương đối phổ biến ở Việt Nam và nhiều
quốc gia trên thế giới, với mục đích trang trí ở dạng hoa chậu, hoa cắt cành,
hay dùng làm hương liệu và dược liệu (Chen, 2011; Mudalige và ctv, 2004).
Một số loài hoa lan đã trở thành cây trồng quan trọng, có đóng góp đáng kể
vào sự phát triển kinh tế nông nghiệp tại nhiều địa phương; tuy nhiên, thị
trường và sự sản xuất hoa lan ở quy mô thương mại vẫn còn hạn chế và chưa
đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng từ người tiêu dùng. Nguồn cung cấp hoa lan
chủ yếu vẫn là cây khai thác từ tự nhiên, và đa số các loài có giá trị kinh tế
cao chưa được ứng dụng vào sản xuất do thiếu nguồn giống (Huỳnh Văn
Thới, 2006). Ngoài ra, nhiều loài hoa lan quꢀ và đặc hữu của Việt Nam ở
trong tự nhiên đang có xu hướng tuyệt chủng do nạn khai thác bừa bãi, nạn
phá rừng và những thay đổi bất lợi của môi trường sống, trong khi đó tốc độ
tái sinh tự nhiên của phần lớn các loài hoa lan là tương đối chậm (Averʹjanov
và ctv, 2003; Chen, 2011; Hossain và ctv, 2010; Phạm Hoàng Hộ, 2000). Do
đó, việc bảo tồn và khai thác bền vững các loài hoa lan có giá trị là rất cần
thiết (Arditti, 2009).
Cẩm báo (Hygrochilus parishii) và Huyết nhung trơn (Renanthera
imschootiana Rolfe) là hai loài hoa lan quꢀ và có giá trị kinh tế, phân bố tự
nhiên tại một số khu rừng nguyên sinh (ở độ cao 1.000 - 1.500 m) ở một số
quốc gia như Việt Nam, Trung Quốc, Indonesia, Ấn Độ và Myanmar. Ở Việt
Nam, hai loài lan này có phạm vi phân bố hẹp, chủ yếu tại một số khu vực
miền núi thuộc các tỉnh ở khu vực Tây Nguyên và Tây Bắc (Phạm Hoàng
Hộ, 2000). Đây là những loài phong lan đơn thân, sống phụ sinh trên thân
các cây gỗ mục, và sinh sản tự nhiên chủ yếu bằng hạt. Với cấu trúc hoa độc
đáo, đẹp, lâu tàn, và thích nghi tốt với nhiệt độ 20 - 32oC, nên ở nhiều nơi
chúng được trồng cho mục đích trang trí và rất được ưa chuộng (Phạm Hoàng
Hộ, 2000). Tuy nhiên, hiện nay nguồn cung cấp của hai loài hoa này chủ yếu
từ rừng tự nhiên, và việc trồng ở quy mô sản xuất vẫn chưa được đề cập vì
thiếu nguồn cây giống (Wu và ctv, 2014). Hiệp hội Thương mại Động - Thực
7
vật hoang dã CITES (2013) đã liệt kê Cẩm báo và Huyết nhung trơn vào
danh mục thực vật bị đe dọa, và cần được bảo vệ vì những lo ngại trước sự
khai thác quá mức từ tự nhiên.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là phương pháp hữu hiệu trong
việc nhân giống và góp phần bảo tồn in vitro nhiều loài hoa lan khác nhau.
Cây con đã được tái sinh thông qua các con đường cảm ứng bởi các điều kiện
nuôi cấy khác nhau, như: nuôi cấy từ hạt, chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng, phát
sinh phôi trực tiếp và giản tiếp (Arditti, 2009). Đối với lan Huyết nhung trơn,
Seeni và ctv (1992) lần đầu tiên đề cập về sự cảm ứng chồi trực tiếp từ cuống
lá non sau 20 tuần cấy trên môi trường Mitra có bổ sung kết hợp BA và NAA.
Sau đó, Wu và ctv (2014) đã khảo sát điều kiện nảy mầm hạt và nhân nhanh
PLB với hệ số nhân 2,88 PLBs/mẫu trên các môi trường khác nhau. Cây con
tái sinh đã cho thấy sự thích nghi ở cả điều kiện vườn ươm và môi trường
sống tự nhiên của nó. Các nghiên cứu này đã bước đầu thiết lập được các
điều kiện cơ bản cho việc nuôi cấy in vitro lan Huyết nhung trơn, tuy nhiên,
các thông tin cụ thể cho một quy trình nhân giống in vitro hoàn chỉnh vẫn
chưa được đề cập đến. Điều kiện nhân nhanh chồi từ PLB, một bước rất quan
trọng để nâng cao hiệu quả nhân giống, vẫn chưa được khảo sát. Ngoài ra,
môi trường nuôi cấy còn phức tạp với nhiều thành phần khác nhau (Wu và
ctv, 2014), điều này có khả năng làm hạn chế tính hiệu quả của việc ứng
dụng các kết quả thu được vào sản xuất thực tế. Đối với lan Cẩm báo,
Shadang và ctv (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường nuôi
cấy cơ bản đến sự nảy mầm hạt và hình thành PLB. Ngoài ra, Choopeng và
ctv (2011) cũng đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của CW và các chất ĐHST
(BA, NAA và paclobutrazol) đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi.
Tương tự như lan Huyết nhung trơn, một quy trình nhân giống in vitro của
lan Cẩm báo vẫn cần được thiết lập (Choopeng và ctv, 2011). Ở Việt Nam
chưa có một công trình nghiên cứu nào được công bố đề cập đến việc nhân
giống in vitro hai loài lan này.
Xuất phát từ các cơ sở trên chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng
quy trình sản xuất cây giống in vitro hai loài phong lan có giá trị cao: Cẩm
báo (Hygrochilus parishii Pfitz.) và Huyết nhung trơn (Renanthera
imschootiana Rolfe)”.
2. Mục tiêu đề tài
8
Mục tiêu chính của nghiên cứu này là xây dựng quy trình sản xuất cây
giống in vitro của hai loài lan: Cẩm báo và Huyết nhung trơn, bằng kỹ thuật
nuôi cấy mô tế bào.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
a. Ý nghĩa khoa học:
Đề tài nghiên cứu cung cấp thông tin mới, bổ sung về sự ảnh hưởng
của các điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành, nhân nhanh và tái sinh cây con
in vitro của hai loài lan Huyết nhung trơn và Cẩm báo.
b. Ý nghĩa thực tiễn:
Kết qủa thu được từ đề tài đã được xây dựng thành những quy trình
nhân giống in vitro của Huyết nhung trơn và Cẩm báo. Các quy trình này có
thể được ứng dụng vào sản xuất cây giống in vitro góp phần tạo ra nguồn
giống sản xuất và bảo tồn hai loài lan này.
4. Các nội dung nghiên cứu của đề tài
Để xây dựng quy trình nhân giống in vitro của hai loài lan Cẩm báo
và Huyết nhung trơn, chúng tôi đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau đối
với mỗi loài lan: (1) Nghiên cứu hiệu quả và khả năng khử trùng hạt (quả)
bằng các tác nhân khử trùng khác nhau; (2) Nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố (môi trường nuôi cấy) đến khả năng nảy mầm của hạt và tái sinh
PLB; (3) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (môi trường nuôi cấy)
đến khả năng nhân nhanh PLB; (4) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố
(môi trường nuôi cấy) đến khả năng nhân nhanh chồi từ PLB; (5) Nghiên
cứu ảnh hưởng của một số yếu tố (môi trường nuôi cấy) đến khả năng tang
trưởng chiều cao (kéo dài) chồi; (6) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu
tố (môi trường nuôi cấy) đến khả năng tạo rễ; (7)- Nghiên cứu ảnh hưởng
của một số yếu tố đến khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây con ở điều
kiện vườn ươm.
9
CHƯƠNG 1. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và phương pháp khử trùng mẫu
Quả lan Huyết nhung trơn và Cẩm báo sau khi ra hoa 4 - 5 tháng được
ngâm trong nước xà phòng loãng 10 - 15 phút, sau đó rửa sạch dưới vòi nước
chảy, và tiếp tục ngâm quả vào dung dịch thuốc diệt nấm trong 5 - 10 phút
rồi rửa sạch lại bằng nước cất khử trùng. Mẫu sau khi khử trùng sơ bộ bên
ngoài, quả được chuyển vào tủ cấy, và khử trùng bằng cồn 70% trong 30
giây, và sau đó khử trùng bề mặt quả bằng các dung dịch HgCl2 0,1% và
NaOCl 0,5%, với thời gian khác nhau: HgCl2 0,1% trong 3 phút và NaOCl
5% trong 10 phút; HgCl2 0,1% trong 5 phút và NaOCl 0,5% trong 15 phút;
và HgCl2 0,1% trong 10 phút và NaOCl 0,5% trong 15 phút. Quả sau khi rửa
sạch bằng nước cất vô trùng đã được cắt đôi dọc bằng dao nhọn. Hạt được
tách ra và gieo trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 30
g/L sucrose và 8,0 g/L agar.
2.2. Phương pháp nhân giống in vitro lan Huyết Nhung trơn
2.2.1. Nảy mầm hạt in vitro
Hạt từ quả lan Huyết nhung trơn sau khi khử trùng với quy trình tối ưu
đã khảo sát ở mục 2.1 (cồn 70% trong 30 giây + HgCl2 0,1% trong 5 phút +
NaOCl 0,5% trong 15 phút) được gieo trên môi trường MS có bổ sung 30
g/L sucrose, 8,0 g/L agar, và 0,5 - 2,0 mg/L BA. Thời gian bắt đầu nảy mầm
(ngày) được xác định dựa vào sự hình thành cấu trúc PLB; tỷ lệ hạt nảy mầm
và đặc điểm sinh trưởng PLB được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy.
Các PLB hình thành trên môi trường nảy mầm (sau 8 tuần) được cấy
chuyển qua môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L KIN kết hợp với 0,25 - 1,0
mg/L NAA. Ngoài ra, 15% CW (sau khi lọc bằng giấy lọc) cũng được bổ
sung vào các môi trường nuôi cấy để khảo sát ảnh hưởng của CW đến khả
năng nhân nhanh PLB. Khả năng nhân nhanh PLB sau 8 tuần nuôi cấy được
đánh giá thông qua tỉ lệ mẫu cấy phát sinh PLB mới (%), khả năng nhân
nhanh, và đặc điểm sinh trưởng của PLB.
2.2.3. Tái sinh và nhân nhanh chồi
Các PLB sau giai đoạn nhân nhanh được tách thành từng khối có đường
kính khoảng 5 mm và cấy chuyển trên môi trường MS có bổ sung 0,5 - 2,0
mg/L KIN riêng lẻ hoặc kết hợp với 0,3 mg/L NAA. Khả năng nhân nhanh
từ PLB được đánh giá thông qua số chồi/mẫu PLB, tỉ lệ PLB tái sinh chồi
(%), và đặc điểm sinh trưởng của chồi sau 12 tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm
thức cấy 15 mẫu PLB, lặp lại 3 lần.
2.2.4. Tăng trưởng chiều cao chồi (kéo dài chồi)
10
Các chồi phát sinh từ PLB có chiều cao khoảng 0,3 cm được nuôi cấy
trên các môi trường MS có bổ sung 15% CW, và 1,0-2,0 mg/L BA kết hợp
với 0,25 - 1,0 mg/L NAA. Khả năng sinh trưởng của chồi được đánh giá sau
8 tuần nuôi cấy thông qua số lá/chồi, chiều cao chồi (cm), đặc điểm sinh
trưởng của chồi. Mỗi nghiệp thức cấy 15 mẫu chồi, lặp lại 3 lần.
2.2.5. Cảm ứng rễ
Các chồi có chiều cao khoảng 1,0 cm với 2 - 3 lá đã được tách bỏ các rễ
phát sinh trong giai đoạn nhân nhanh (nếu có), sau đó cấy lên môi trường
MS có bổ sung 0,25 - 1,0 mg/L NAA. Thời gian xuất hiện rễ, tỉ lệ chồi phát
sinh rễ (%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (cm) được quan sát sau 8 tuần nuôi cấy.
Mỗi nghiệm thức cấy 15 mẫu chồi, lặp lại 3 lần.
2.2.6. Huấn luyện cây con ở điều kiện vườn ươm
Cây con tái sinh hoàn chỉnh có chiều cao khoảng 1,0 cm với 2 - 3 rễ
được duy trì trong các bình nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng và nhiệt độ phòng
trong khoảng 7 - 10 ngày. Sau đó, cây được chuyển ra khỏi bình nuôi cấy,
rửa sạch môi trường bám trên rễ dưới vòi nước chảy và trồng trên 3 loại giá
thể thương mại dành cho trồng lan với các tỉ lệ phối trộng khác nhau, bao
gồm: dớn, than + dớn (tỉ lệ 1:1), và than + dớn + xơ dừa (tỉ lệ 1:1:1). Cây
được trồng trong các khay nhựa đen, lỗ có đường kính 5 - 7 cm trong điều
kiện vườn ươm (tại Trại thực nghiệm khoa Sinh-Môi trường) có nhiệt độ
trung bình 28 ± 5oC, độ ẩm không khí 80 - 90%, và ánh sáng tự nhiên.
2.3. Phương pháp nhân giống in vitro lan Cẩm báo
2.3.1. Nảy mầm hạt in vitro
Phương pháp thực hiện tương tự như với lan Huyết nhung trơn.
2.3.2. Nhân nhanh PLB
Các PLB hình thành trên môi trường nảy mầm (sau 8 tuần) được cắt
thành khối nhỏ có đường kính 2 - 3 mm và cấy chuyển qua môi trường MS
có bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp với 0,1 - 0,5 mg/L IBA. Khả năng nhân
nhanh PLB sau 4 tuần nuôi cấy được đánh giá thông qua tỉ lệ mẫu cấy phát
sinh PLB mới (%), khả năng nhân nhanh, và đặc điểm sinh trưởng của PLB.
2.3.3. Nhân nhanh chồi
Các PLB sau giai đoạn nhân nhanh được tách thành từng khối có đường
kính khoảng 3 - 5 mm và cấy chuyển trên môi trường MS có bổ sung riêng
lẻ 0,5 - 2,0 mg/L KIN và 0,5 - 2 mg/L BA. Khả năng nhân nhanh từ PLB
được đánh giá thông qua: thời gian xuất hiện chồi (ngày), số chồi/mẫu PLB,
chiều cao chồi, và đặc điểm sinh trưởng của chồi sau 8 tuần nuôi cấy. Mỗi
nghiệm thức cấy 15 chồi, lặp lại 3 lần.
2.3.4. Tăng trưởng chiều cao chồi
11
Các chồi có chiều cao khoảng 0,3 cm được tách ra và cấy trên môi
trường MS có bổ sung 0,5 g/L AC, 2,0 - 3,5 mg/L BA, và 2,5 mg/L BA kết
hợp với 0,5 - 2,0 mg/L NAA. Khả năng sinh trưởng của chồi được đánh giá
sau 8 tuần nuôi cấy thông qua số lá/chồi, chiều cao chồi (cm), đặc điểm sinh
trưởng của chồi. Mỗi nghiệm thức cấy 15 chồi, lặp lại 3 lần.
2.3.5. Cảm ứng rễ
Chồi đạt chiều cao khoảng 1,0 cm được tách ra và cấy vào môi trường
MS + 0,5 g/L AC, và có bổ sung 0,5-2,0 mg/L NAA. Đánh giá khả năng hình
thành rễ sau 8 tuần nuôi cấy với các chỉ tiêu sau: tỉ lệ chồi ra rễ (%), số rễ
(rễ/chồi) và chiều dài rễ (cm). Mỗi nghiệm thức cấy 15 chồi, lặp lại 3 lần.
2.3.6. Huấn luyện cây con ở điều kiện vườn ươm
Cây con tái sinh có chiều cao khoảng 1,0 cm và 2 - 3 rễ được duy trì
trong các bình nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng và nhiệt độ phòng (hoặc vườn
ươm) trong khoảng 7 - 10 ngày. Sau đó, cây được chuyển ra khỏi bình nuôi
cấy, rửa sạch môi trường bám trên rễ dưới vòi nước chảy và trồng trên 5 tổ
hợp giá thể với các tỉ lệ khác nhau, bao gồm: dớn, xơ dừa, dớn + than (tỉ lệ
1:1), dớn + xơ dừa (tỉ lệ 1:1), xơ dừa + than (tỉ lệ 1:1). Khả năng thích nghi
của cây con được đánh giá thông qua tỉ lệ sống sót và tình trạng của cây sau
2 tuần. Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức được lặp lại
3 lần, mỗi lần 15 cây và mỗi lỗ trồng 1 cây.
2.3.7. Ảnh hưởng của một số yếu tố ở điều kiện vườn ươm đến sự sinh trưởng
của cây con
Cây con in vitro lan Cẩm báo (tương tự mục 2.3.6) đã được trồng trên
giá thể dớn. Ảnh hưởng của các điều kiện chăm sóc ở vườn ươm đến sự sinh
trưởng của cây đã được khảo sát, bao gồm: Cường độ chiếu sáng, chế độ tưới
nước, chế độ dinh dưỡng khoáng.
2.4. Các điều kiện khác và xử lí thống kê
Toàn bộ các công thức môi trường nuôi cấy được chuẩn bị với đầy đủ
các thành phần hòa tan trong dung dịch, sau đó điều chỉnh pH=5,8 ± 0.1 trước
khi cho agar và/hoặc AC với lượng thích hợp và hấp khử trùng ở điều kiện
121oC, áp suất 1,0 atm, 15 phút. Môi trường sau khi hấp khử trùng xong đã
để nguội đến khoảng 50 - 60oC và phân phối khoảng 50 - 100 mL vào trong
các bình nuôi cấy có thể tích 250 - 500 mL. Mẫu nuôi được duy trong điều
kiện phòng nuôi với nhiệt độ 25oC, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian
chiếu sáng 12 h/ngày đêm. Dữ liệu thu được được phân tích bằng phần mềm
thống kê SAS ver.11 với các thuật toán ANOVA và Ducan’s test để phân
biệt sự sai khác giữa các nghiệm thức với mức ꢀ nghĩa thống kê p<0,05.
12
CHƯƠNG 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hiệu quả khử trùng hạt
Điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quyết định đến sự thành
công của quá trình nuôi cấy in vitro. Hạt lan thường được bao bọc bởi một
lớp vỏ quả dày và nếu vỏ quả không bị tổn thương thì hầu như phần hạt bên
trong là vô trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn những quả lan
sau khi ra hoa 4 - 5 tháng với vỏ quả còn nguyên vẹn, có màu vàng xanh để
tiến hành khử trùng (Wu và ctv, 2014). Kết quả cho thấy, hiệu quả khử trùng
là tương tự với cả hai loài lan với điều kiện khử trùng thích hợp nhất là cồn
70% trong 30 giây + HgCl2 0,1% trong 5 phút + NaOCl 5% trong 15 phút,
với tỉ lệ mẫu hạt sống (chết) đạt 85,71% (14,29%) và 86,71% (13,29%) tương
ứng đối với Cẩm báo và Huyết nhung trơn. Với quy trình khử trùng này,
chúng tôi hầu như không quan sát thấy hiện tượng nhiễm của mẫu sau 2 tuần
nuôi cấy (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các tác nhân khử trùng lên hiệu quả khử trùng
hạt lan Huyết nhung trơn và Cẩm báo
Tác nhân và thời gian khử trùng
Hiệu quả khử trùng
Loài
lan
TLM
sống
(%)
TLM
chết
(%)
Khả
năng
nhiễm*
Cồn
HgCl2
NaOCl
70%(giây) 0,1%(phút) 5%(phút)
30
30
30
30
30
30
3
5
7
3
5
7
10
15
20
10
15
20
77,25 22,75
Có
Cẩm
báo
85,71 14,29 Không
62,50 37,50 Không
78,25 21,75
Có
Huyết
nhung
trơn
86,71 13,29 Không
60,50 39,50 Không
* Khả năng nhiễm được đánh giá dựa vào quan sát mẫu bị nhiễm sau 2
tuần và chia làm 2 mức “Có và Không”.
3.2. Nhân giống in vitro lan Huyết nhung trơn
3.2.1. Sự nảy mầm in vitro của hạt
Hạt được xem là nguồn mẫu vật nuôi cấy thích hợp trong điều kiện
nguồn cây mẫu hạn chế (De Pauw và ctv, 1995). Khả năng nảy mầm được
cải thiện đáng kể khi nuôi cấy in vitro vì sự có mặt đầy đủ các thành phần
13
dinh dưỡng khoáng và vitamin. Ngoài ra, khả năng nảy mầm của hạt còn
được tăng cường bằng cách bổ sung các chất ĐHST thích hợp (Griesbach,
1986). Wu và ctv (2014) đã công bố tỉ lệ nảy mầm và phát triển sau nảy mầm
tốt nhất của hạt lan Huyết nhung trơn đạt 93,1% trên môi trường cơ bản MS
có chứa 0,5 mg/L NAA + 1,0 g/L pepton + 20% CW + 1,0 g/L AC. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS
có bổ sung 0,5 - 2,0 mg/L BA đến khả năng nảy mầm của hạt. Kết quả thu
được ở Bảng 3.2 cho thấy, khả năng nảy mầm hạt tốt hơn trên môi trường
không bổ sung BA, thời gian nảy mầm sau 45 ngày với các PLB có màu xanh
đậm, to khỏe (Bảng 3.2). Sự nảy mầm càng bị hạn chế khi tăng dần nồng độ
BA, với các PLB hình thành có màu xanh nhạt, sức sống yếu sau 8 tuần nuôi
cấy (Bảng 3.2).
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của BA đến khả năng nảy mầm của hạt lan Huyết
nhung trơn sau 8 tuần gieo hạt
Thời gian nảy
mꢀm (ngày)
Tỷ lệ hạt
nảy mꢀm*
BA (mg/L)
Đặc điểm hình thái của PLB
-
45
+++
PLB to, màu xanh đậm
0,5
50
++
PLB nhỏ, màu xanh nhạt
1,0
2,0
57
65
+
+
PLB nhỏ, sinh trưởng yếu
PLB nhỏ, sinh trưởng yếu
* Tỷ lệ nảy mầm của hạt được ước lượng và thể hiện qua các kí hiệu: +++: cao;
++: khá; +: trung bình.
3.2.2. Khả năng nhân nhanh PLB
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng kết hợp của 1,0
mg/L KIN và 0,25 - 1,0 mg/L NAA đến khả năng nhân nhanh PLB của cây
lan Huyết nhung trơn (Bảng 3.3). Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung
KIN và NAA đã tăng cường khả năng nhân nhanh PLB so với môi trường
không bổ sung ĐHST, khả năng nhân nhanh tốt nhất trên môi trường chứa
1,0 mg/L KIN + 0,5 mg/L NAA với tỉ lệ mẫu PLB nuôi cấy cảm ứng PLB
mới đạt 64,55% và khả năng nhân nhanh đáng kể sau 8 tuần (Bảng 3.3). Việc
tăng hoặc giảm nồng độ NAA đều làm giảm khả năng nhân nhanh PLB. CW
thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự hình thành
PLB; trong nghiên cứu này, việc bổ sung 15% CW vào môi trường nuôi cấy
đã ảnh hưởng tích cực đến khả năng nhân nhanh PLB so với môi trường
không bổ sung CW. Các PLB nhân nhanh tốt nhất trên môi trường chứa 1,0
mg/L KIN + 0,5 mg/L NAA + 15% CW với tỉ lệ mẫu cảm ứng PLB đạt
91,1%. Mặc dù chúng tôi không thể xác định chính xác hệ số nhân nhanh do
14
các PLB tạo thành chồng chéo lẫn nhau, khó tách rời; tuy nhiên, căn cứ vào
việc tăng thể tích mẫu thu được chúng tôi ước lượng hệ số nhân nhanh
khoảng 2 - 3 lần trên môi trường tối ưu.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của chất KIN, NAA, và CW đến khả năng
nhân nhanh PLB lan Huyết nhung trơn sau 8 tuần nuôi cấy.
CW
(%)
Tỉ lệ mẫu phát
sinh PLB (%)
Khả năng
nhân nhanh*
KIN (mg/L) NAA (mg/L)
-
-
-
26,67
35,55
64,45
44,44
46,41
91,10
84,45
+
+
+++
++
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
0,25
0,50
0,75
0,25
0,50
0,75
-
++
15
++++
+++
* Khả năng nhân nhanh PLB được ước lượng và thể hiện qua các kí hiệu,
++++: cao; +++: khá; ++: trung bình; +: yếu.
3.2.3. Tái sinh và nhân nhanh chồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thay thế BE bởi 0,5 – 2,0 mg/L
KIN riêng lẻ, hoặc KIN kết hợp với 0,3 mg/L NAA để đánh giá ảnh hưởng
của chúng đến khả năng nhân nhanh chồi nhằm thay thế chất hữu cơ bổ sung
hữu cơ. Kết quả cho thấy, môi trường có bổ sung chất ĐHST đã ảnh hưởng
tích cực đến sự hình thành chồi so với môi trường không bổ sung chất ĐHST,
và khả năng hình thành chồi cao hơn đáng kể ở môi trường chỉ bổ sung KIN
so với các môi trường bổ sung KIN + NAA (Bảng 3.4). Sự nhân chồi tốt nhất
với tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt 84,44% và số chồi/mẫu PLB đạt 15,33 khi nuôi cấy
trên môi trường bổ sung 1,5 mg/L KIN, chồi cao trung bình khoảng 0,3 - 0,4
cm, với khoảng 2 lá/chồi, chồi khỏe mạnh.
3.2.4. Khả năng tăng trưởng chiều cao chồi
Wu và ctv (2014) đã cấy chuyển chồi lan Huyết nhung trơn trên môi
trường Hyponex N016 có bổ sung 0,5 mg/L NAA + 1,0 g/L pepton + 150
g/L BE + 20% CW cho sự sinh trưởng của cây con, với chiều cao đạt 3,63
cm sau 8 tuần. Mặc dù khả năng nhân nhanh chồi từ PLB thu được trong
nghiên cứu hiện tại là khá cao, nhưng chồi có chiều cao tương đối thấp; vì
vậy, chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA ở các mức
nồng độ khác nhau đến khả năng tăng trưởng của chồi (Bảng 3.5).
15
Tải về để xem bản đầy đủ
32 trang
20660
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Báo cáo tóm tắt Đề tài Xây dựng quy trình sản xuất cây giống in vitro hai loài phong lan có giá trị cao: Cẩm báo (Hyglohilus parishii Pfitz.) và Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- bao_cao_tom_tat_de_tai_xay_dung_quy_trinh_san_xuat_cay_giong.pdf
