Báo cáo tóm tắt Đề tài Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ rong biển đỏ
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
BÁO CÁO TÓM TẮT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHẤT MÀU
TỰ NHIÊN R-PHYCOERYTHRIN TỪ RONG BIỂN ĐỎ
Mã số: B2018-ĐN06-14
Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN HỮU PHƯỚC TRANG
Đà Nẵng, Tháng 7 năm 2020
BÁO CÁO TÓM TẮT
DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI
STT
1
Họ và tên
Vai trò
Đơn vị công tác
Khoa Công nghệ Hóa
học – Môi trƣờng,
Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ
Thuật- Đại học Đà Nẵng
Khoa Công nghệ Hóa
học – Môi trƣờng,
Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ
Thuật- Đại học Đà Nẵng
Khoa Công nghệ Hóa
học – Môi trƣờng,
Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ
Thuật- Đại học Đà Nẵng
Khoa Công nghệ Hóa
học – Môi trƣờng,
TS. Nguyễn Hữu Phƣớc Trang Chủ nhiệm
2
3
4
ThS. Trần Thị Ngọc Linh
ThS. Huỳnh Ngọc Bích
TS. Lê Thị Diệu Hƣơng
Thành viên
Thành viên
Thƣ ký
khoa học Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ
Thuật- Đại học Đà Nẵng
ii
DANH MỤC HÌNH
SỐ
HIỆU
HÌNH
TÊN HÌNH
TRANG
Hàm lƣợng protein (A), R-PE (B) từ Gracilaria
gracilis
3.1
3.2
8
Biểu đồ bề mặt đáp ứng năng suất R-PE (mg/g
CK) theo thời gian thủy phân, tỷ lệ E/S và nhiệt
độ thủy phân. A: mặt đáp ứng tƣơng tác giữa
thời gian và tỷ lệ E/S; B: mặt đáp ứng tƣơng
tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ E/S; C: mặt đáp ứng
tƣơng tác giữa nhiệt độ và thời gian thủy phân
Sắc ký đồ của dung dịch chiết thô CE1 từ
Gracilaria gracilis trên cột DEAE Sepharose.
Các phân đoạn rửa giải: A: AE-150/AE-
200/AE-1000; B: AE-150/AE-250/AE-1000;
C: AE-150/AE-300/AE-1000
10
12
3.3
Ghi chú: Sắc ký đồ đƣợc theo dõi bằng quang
phổ UV-visible tại 280nm (-------), 565nm (
), nồng độ NaCl (……).
Quang phổ hấp thụ, sắc ký đồ lọc gel tại phân
đoạn AE-200
Điện di đồ các phân đoạn nhận đƣợc sau khi
qua cột sắc ký trao đổi ion
Sơ đồ quy trình công nghệ chiết xuất R-PE
bằng phƣơng pháp ngâm
3.4
3.5
3.6
13
13
14
Sơ đồ quy trình công nghệ chiết xuất R-PE
bằng phƣơng pháp thủy phân
Sơ đồ quy trình công nghệ tinh sạch R-PE
3.7
3.8
14
15
iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU
SỐ
HIỆU
BẢNG
TÊN BẢNG
TRANG
Hàm lƣợng R-PE và chỉ số độ tinh khiết PI tại
các tỷ lệ giữa nguyên liệu/dung môi nƣớc
đƣợc khảo sát
Chất lƣợng R-PE tại các thời điểm đƣợc khảo
sát
Hàm lƣợng R-PE, PI, protein hòa tan của
Gracilaria gracilis sau khi đƣợc chiết xuất từ
các dung môi khác nhau
Ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế
phức hợp trung tâm CCD (n=3).
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
6
6
7
9
Bảng tóm tắt kết quả hàm lƣợng R-PE, chỉ số
độ tinh khiết R-PE thu đƣợc từ rong biển sấy
Gracilaria gracilis
10
Hàm lƣợng R-PE và PI của dịch chiết thô (CE)
của Gracilaria gracilis và các phân đoạn sau
khi tinh sạch
3.6
13
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
R-PE: R-phycoerythrin
G.gracilis: Gracilaria gracilis
G.: Gracilaria
RSM: Response surface methodology
CE: Crude Extract
CEVA: Centre d’Étude et de Valorisation des Algues
FAO: Food and Agriculture Organisation
PI: Purity Index
kDa: Kilo Dalton
AE: Anion exchange
CK: Chất khô
vi
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
Đơn vị: Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật
-------
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-
phycoerythrin từ rong biển đỏ
- Mã số: B2018-ĐN06-14
- Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Hữu Phƣớc Trang
- Tổ chức chủ trì: Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật
- Thời gian thực hiện: 08/2018 – 07/2020
2. Mục tiêu:
Nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ
nguồn rong biển đỏ nhằm bổ sung thêm nguồn chất màu tự nhiên cho
ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Chất màu R-
phycoerythrin tinh khiết có thể sử dụng trong lĩnh vực y học và công
nghệ sinh học. Nghiên cứu của đề tài tập trung vào quy trình chiết
xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin bằng phƣơng pháp ngâm
trong dung môi và phƣơng pháp enzyme thủy phân nhằm mục đích
thu nhận R-phycoerythrin đạt năng suất cao với các thông số công
nghệ tối ƣu. Ngoài ra, nghiên cứu bƣớc đầu tinh sạch chất màu này
bằng các phƣơng pháp khác nhau nhằm thu nhận sản phẩm R-PE tinh
khiết.
3. Tình mới và sáng tạo:
Nghiên cứu này đã đƣa ra đƣợc những dẫn liệu khoa học mới
về ảnh hƣởng của các phƣơng pháp chiết xuất đến quá trình chiết
xuất rong biển đỏ. Đồng thời cũng bƣớc đầu tinh sạch chất màu R-PE
đạt đƣợc chỉ số độ tinh khiết cao.
4. Kết quả nghiên cứu:
- Tiền xử lý nguyên liệu là một trong những công đoạn quan trọng
của quá trình chiết xuất R-phycoerythrin. Phƣơng pháp sấy thăng hoa
vii
nguyên liệu và nghiền bằng nitơ lỏng mang lại hiệu quả chiết xuất R-
PE cao.
- Hai phƣơng pháp chiết xuất R-PE đã đƣợc nghiên cứu: sử dụng
dung môi chiết xuất (nƣớc, nƣớc cất và dung dịch đệm phosphate 20
mM, pH 7,1) và sử dụng enzyme thủy phân polysaccharide (xylanase,
cellulase và β-glucanase). Năng suất thu nhận R-PE từ phƣơng pháp
thủy phân đạt 12.76 mg g-1 dw.
- Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân bằng phƣơng pháp bề mặt đáp
ứng tại các điều kiện (nhiệt độ (32C), thời gian (286 phút), enzyme
cellulase/rong biển sấy (47 mg g-1), hàm lƣợng R-phycoerythrin thu
nhận đƣợc đạt giá trị 15.75 mg g-1 dw.
- R-phycoerythrin tinh khiết thu đƣợc với chỉ số độ tinh khiết cao
(A565/A280) đạt 3.25 (chỉ số độ tinh khiết tiêu chuẩn = 3.2) sau khi
tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký với cột DEAE Sepharose với
phân đoạn thu nhận tại nồng độ muối NaCl 200 mM.
5. Sản phẩm:
5.1. Sản phẩm khoa học
+ 01 Bài báo trên Tạp chí Quốc tế thuộc danh mục SCI:
Purification of R-phycoerythrin from a marine macroalga
Gracilaria gracilis by anion-exchange chromatography (2020).
Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Paul Déléris, Joël
Fleurence, Chau Thanh Nguyen-Le, Khanh Ha Vo, Justine
Dumay. Journal of Applied Phycology, 32, 553–561.
+ 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc tế: 4th International
Conference on Green Technology and Sustainable Development
(GTSD 2018).
Extracting and purifying pigment R-phycoerythrin from the red
alga Mastocarpus stellatus”. Tác giả: Huu Phuoc Trang Nguyen,
Michèle Morançais, Joël Fleurence, Thi Ngoc Linh Tran, Justine
Dumay. 4th International Conference on Green Technology and
Sustainable Development (GTSD 2018), 573-578.
+ 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc gia: Hội thảo khoa học quốc
gia “Ứng dụng công nghệ mới trong công trình Xanh (AtiGB 2018).
viii
Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân đến quá trính thu
nhận R-phycoerythrin từ Gracilaria gracilis. Tạp chí Khoa học
Công nghệ, Đại học Đà Nẵng 11(132).2018, Quyển 2; Trang: 166-
170.
5.2. Sản phẩm ứng dụng
+ 100 ml mẫu R-phycoerythrin từ rong biển đỏ
+ 01 Qui trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ rong
biển đỏ. Cung cấp đầy đủ các công đoạn và thông số kỹ thuật đƣợc
Hội đồng Khoa chuyên ngành thông qua.
6. Phƣơng thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ìch
mang lại của kết quả nghiên cứu:
6.1 Phƣơng thức chuyển giao
Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm
Kỹ Thuật, Đại học Đà Nẵng
6.2. Địa chỉ ứng dụng
Có thể chuyển giao công nghệ cho các cơ sở chế biến thực phẩm, mỹ
phẩm, dƣợc phẩm trong nƣớc.
6.3. Tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu
+ Đối với lĩnh vực giáo dục và đào tạo
Đề tài áp dụng công nghệ hiện đại, thiết bị tiên tiến nhƣ công nghệ
nghiền nhỏ nguyên liệu bằng nitơ lỏng, thiết bị sấy thăng hoa, tinh
sạch chất màu R-phycoerythrin bằng thiết bị sắc ký trao đổi ion, sắc
ký lọc gel…
+ Đối với lĩnh vực khoa học và công nghệ có liên quan
- Đề tài có thể đƣợc sử dụng làm tài liệu tham khảo về các phƣơng
pháp nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin theo
các phƣơng pháp khác nhau nhƣ phƣơng pháp chiết bằng dung môi,
thủy phân enzyme.
- Tăng số lƣợng bài báo công bố trong nƣớc và quốc tế cho ĐHĐN.
+ Đối với phát triển kinh tế-xã hội
- R-PE thu nhận từ rong biển có thể sử dụng thay thế chất màu tổng
hợp, ứng dụng trong ngành chế biến thực phẩm, mỹ phẩm.
- Đa dạng hóa sản phẩm thu nhận từ rong biển.
ix
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
Project title: Study on extraction process of R-phycoerythrin from red
seaweed
Code number: B2018-ĐN06-14
Coordinator: Nguyễn Hữu Phƣớc Trang
Implementing institution: University of Technology and Education
Duration: from 08/2018 to 07/2020
2. Objective(s):
This research reports an effective procedure for the extraction of R-
phycoerythrin from red seaweed. R-phycoerythrin has been used in
food, cosmetics, pharmaceuticals and analytical reagents. Two
different methods for the extraction of this pigment were tested:
using the extraction solutions and using polysaccharide-degrading
enzymes. Besides, the present research aims to purify the R-
phycoerythrin by one-step anion-exchange chromatography.
3. Creativeness and innovativeness:
This research presented different methods for the extraction and
purification of R-phycoerythrin from red seaweed. The purity of the
R-phycoerythrin obtained from G. gracilis reached 3.25 by anion-
exchange chromatography after a three-step increasin gradient of salt
concentration. This method reduced the number of processing steps
for purification of R-PE and the processing time.
4. Research results:
- The algae pretreatment is an important stage, and the highly
effective extraction of R-phycoerythrin from Gracilaria gracilis was
carried out with freeze-dried seaweed and grinding with liquid
nitrogen.
- Two different methods for the extraction of this pigment were tested:
using the extraction solutions (tap water, pure water and phosphate
buffer 20 mM, pH 7,1) and using polysaccharide-degrading enzymes
(xylanase, cellulase and β-glucanase). The latter, especially cellulase,
enhanced the extraction yield of R-phycoerythrin from Gracilaria
gracilis (12.76 mg g-1 dw). Finally, under the optimal hydrolysis
xi
conditions obtained for the enzyme cellulase according to a response
surface methodology study (temperature (32C), hydrolysis time (286
min), enzyme/dry seaweed ratio (47 mg/g CK dw), the maximum
yield of R-phycoerythrin reached 15.75 mg/g CK dw.
- Native R-phycoerythrin was achieved with a high purity index
(A565/A280 ratio) of 3.25 (3.2 = standard R-phycoerythrin purity)
after purification on DEAE Sepharose fast flow chromatography with
the obtained fraction at 200 mM NaCl.
5. Products:
5.1. Scientific products
+ A research paper was published in SCI journal:
Purification of R-phycoerythrin from a marine macroalga
Gracilaria gracilis by anion-exchange chromatography (2020).
Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Paul Déléris, Joël
Fleurence, Chau Thanh Nguyen-Le, Khanh Ha Vo, Justine
Dumay. Journal of Applied Phycology, 32, 553–561.
+ A research paper was published in the 4th International Conference
on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018).
Extracting and purifying pigment R-phycoerythrin from the red
alga Mastocarpus stellatus”(2018). Huu Phuoc Trang Nguyen,
Michèle Morançais, Joël Fleurence, Thi Ngoc Linh Tran, Justine
Dumay. 4th International Conference on Green Technology and
Sustainable Development (GTSD 2018), 573-578.
+ A research paper was published in the 4th National Scientific
Conference on Applying New Technology in Green Buildings
(AtiGB 2018).
Optimization of hydrolysis conditions to obtain R-phycoerythrin
from Gracilaria gracilis (2018). Nguyễn Hữu Phƣớc Trang.
Journal of Science and Technology, 11(132), 166-170.
5.2. Other products
+ 100 ml R-phycoerythrin
+ An extraction process of R-phycoerythrin from red seaweed.
6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and
benefits of research results:
xii
6.1 Transfer alternatives
The Faculty of Chemical Technology – Environment, University of
Technology and Education, University of Danang.
6.2. Application institutions
The research results are able to be transfered to the food processing
facility, cosmetics and pharmaceuticals.
6.3. Impacts and benifits of research results
+ Educational and training efficiency
This research was applied the modern equipements and methods:
freeze-dried, grinding with liquid nitrogen, anion-exchange
chromatography, gel filtration,...
+ Field of science and technology
- The information from research results is valuable references
resource for extraction process of R-phycoerythrin by different
methods.
- Increasing the research paper for University of Danang
+ Economic and social efficiency
- R-PE from red seaweed could be used in food and cosmetic
- Diversify products from red seaweed
- The research results are able to be transfered to the food processing
facility, cosmetics and pharmaceuticals.
+ University of Technology and Education, University of Danang
- Increasing the research paper for University of Technology and
Education, University of Danang.
-The information from research results is valuable references
resource for teaching theory as well as the practice of relevant
modules in Food Technology.
xiii
TÍNH CẤP THIẾT ĐỀ TÀI
Rong biển chứa nhiều thành phần dinh dƣỡng tốt cho cơ thể và
giá trị dinh dƣỡng cao hơn. Rong biển là nguồn giàu khoáng chất cần
thiết nhƣ magie, canxi, đồng, kali, selen, kẽm, iốt, sắt và chứa lƣợng
rất thấp các chất béo. Rong biển cũng chứa nhiều chất chống oxy hóa,
protein thực vật và hàm lƣợng chất xơ phong phú cần thiết cho cơ thể.
Vitamin có trong rong biển là vitamin A, B, C, E và K. Rong biển
cũng có chứa các axit béo omega-3 và tất cả các axit amin quan trọng
cần thiết cho cơ thể con ngƣời. Ở Việt Nam, rong biển hiện nay chủ
yếu khai thác từ nguồn lợi tự nhiên, sản lƣợng nuôi trồng không
nhiều, chủ yếu tập trung vào nhóm rong đỏ chiết xuất agar,
carrageenan
nhƣ
Gracilaria
(Rhodophyta,
Gigartinales),
Kappaphycus alvarezzi (Rhodophyta, Gigartinales) và Kappaphycus
striatum (Rhodophyta, Gigartinales). Gracilaria gracilis đã đƣợc
nghiên cứu và báo cáo là nguồn nguyên liệu chứa nhiều hợp chất có
giá trị với các ứng dụng nhƣ: polyme agar đƣợc sử dụng làm vật liệu
mao quản và mẫu sinh học trong sản xuất hạt nano, sản xuất protein
cho công nghiệp thực phẩm .
R-phycoerythrin (R-PE) là phycobiliprotein chính trong rong
biển đỏ. Cấu trúc tiểu đơn vị của R-PE phổ biến nhất là (αβ)6γ, khối
lƣợng phân tử khoảng 240.000 Da. R-PE hiện đang đƣợc sử dụng
trong sản xuất thực phẩm và mỹ phẩm nhƣ chất tạo màu tự nhiên. Nó
cũng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một phần trong chuyển giao năng
lƣợng huỳnh quang, trong miễn dịch học và lƣu lƣợng tế bào. R-PE
có thể đƣợc chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ
phƣơng pháp ngâm nguyên liệu trong dung môi hay chiết xuất bằng
phƣơng pháp thủy phân nhờ các enzyme polysaccharides. Nghiên
cứu chiết xuất R-PE từ rong biển đỏ Gracilaria gracilis là đề tài với
mục đích nghiên cứu các phƣơng pháp chiết xuất R-PE nhằm nâng
cao năng suất thu hồi R-PE đồng thời bƣớc đầu nghiên cứu tinh sạch
chất màu này nhằm tăng giá trị sử dụng.
1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1.1. Rong biển đỏ Gracilaria
1.1.1. Giới thiệu chung
Gracilaria là một trong những chi lớn của rong biển đỏ
Rhodophyta, với hơn 150 loài đã đƣợc công bố (Byrne et al. 2002),
có giá trị kinh tế quan trọng nhƣ nguồn cung cấp agar, nguồn thức ăn
cho con ngƣời và các loài động vật giáp xác (Armisen 1995).
Chi Gracilaria thuộc ngành rong đỏ, tuy nhiên các loài của
chi này lại tồn tại nhiều màu sắc khác nhau bao gồm: đen, vàng, xanh
và đỏ. Những loài rong biển này có thể thay đổi màu sắc phụ thuộc
vào thành phần sắc tố của chúng, do chịu ảnh hƣởng từ nguồn ảnh
sáng (Ramus et al. 1983), thời gian trong năm, vị trí địa lý (Paul et al.
2014), sự phối hợp giữa các loài rong biển có màu sắc khác nhau
(Plastino et al. 1999) hay màu sắc của chúng bị biến tính (Marevita
2013).
1.1.2. Sự phân bố các loài Gracilaria
Các loài rong biển đỏ Gracilaria hầu nhƣ phân bố trên toàn
thế giới vì nó có khả năng chịu đƣợc sự biến đổi sinh thái lớn (Hình
1.8) (Perez et Barbaroux 2016). Chúng có thể đƣợc tìm thấy tại các
vùng biển từ vĩ độ 600 bắc, 400 nam và vùng nƣớc lạnh (Kling 1978).
Theo FAO, tổng thu hoạch các loài Gracilaria vào năm 2011
trên thế giới đạt khoảng 2.257.919 tấn, đạt 3.538.655 tấn vào năm
2014. Các loài Gracilaria thƣờng đƣợc nuôi trồng phổ biến tại Trung
quốc (1.513.590 tấn) và Đài Loan (khoảng 4.865 tấn). Các loài này
94,2% (khoảng 697.240 tấn) đƣợc thu hoạch từ nuôi trồng, phần còn
lại (42.224 tấn) từ nguồn tự nhiên. Các nƣớc nuôi trồng các loài
Gracilaria hiện nay tại châu Mỹ nhƣ Chilê, Peru, Argentine, tại châu
Á bao gồm Trung quốc, Đài loan, Indonesia, Vietnam, Philipin, Hàn
quốc.
1.1.3. Thành phần hóa học
Gracilaria có khoảng hơn 300 loài, trong đó 160 loài đã
đƣợc định danh (Francavilla et al. 2013). Các loài này mang lại giá trị
kinh tế quan trọng trong công nghiệp và công nghệ sinh học (Capo et
2
al. 1999). Qua các tài liệu tham khảo cho thấy, hàm lƣợng protein của
các loài Gracilaria dao động từ 5,2% đến 45% tùy theo loài. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đối tƣợng là loài
Gracilaria gracilis. Hàm lƣợng lipid của các loài Gracilaria thấp
(nhỏ hơn 4%). Đây là lí do các loài tảo biển đƣợc sử dụng nhƣ thực
phẩm năng lƣợng thấp (Chey et al. 2017). Ngoài ra, rong biển đỏ là
nguồn khoáng cao. Hàm lƣợng tro từ 9 % - 43 %. Hàm lƣợng
carbohydrate từ các loài này đạt hàm lƣợng cao (10,2% - 46,6 %).
1.2. R-Phycoerythrin
R-phycoerythrin (R-PE) là một protein oligomaric có khối
lƣợng phân tử khoảng 240.000 Da, bao gồm 6 đơn vị α (20 kDa), 6
đơn vị β (20 kDa) và 1 đơn vị γ (khoảng 30 kDa). Quang phổ hấp thụ
R-PE thể hiện ở ba đỉnh, đỉnh cao nhất là 565 nm (Munier et al.
2015).
R-phycoerythrin mang màu hồng tím và là một chất màu
quan trọng trong công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm, chẩn
đoán miễn dịch, trị liệu, mỹ phẩm, đánh dấu tế bào trong quá trình
phân tích (Dumay et al. 2014). Do đặc tính quang học của nó,
phycoerythrin đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật sinh hóa và chẩn
đoán lâm sàng . Gần đây, khả năng chống ung thƣ của R-PE và ba
tiểu đơn vị α, β, γ đã đƣợc tìm thấy khi thử nghiệm trên mô hình tế
bào (các tế bào khối u của chuột, các tế bào ung thƣ biểu mô gan của
ngƣời). R-PE có tác dụng làm tắc các mạch máu của khối u với sự
cảm ứng của tế bào chết đƣợc lập trình dƣờng nhƣ là cơ chế chủ yếu
của các tiểu đơn vị R-PE (Denis et al. 2009).
R-Phycoerythrin mang hai loại phycobilins (phycoerythrobilin
và phycourobilin). Theo các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng: R-PE có
thể mang các cấu trúc khác nhau tùy thuộc vào loại rong biển: (αβ)3
γ (αβ) 3γ'(260 kDa) (Glazer 1994 ; Munier et al. 2015) và γ (αβ) 3
γ'(αβ) 3 γ (Wang et al. 2015).
3
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Rong biển đỏ Gracilaria gracilis
Rong biển đƣợc thu hoạch từ vùng biển Batz-sur-Mer, Pháp.
Rong biển Gracilaria gracilis đƣợc xử lý và bảo quản, cấp đông (-
20OC).
2.1.1. R-phycoerythrin
R-phycoerythrin sau khi đƣợc nghiên cứu và chiết xuất từ
rong biển Gracilaria gracilis sẽ đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp
sắc ký trao đổi ion.
2.2. Quy trính chiết xuất R-phycoerythrin
2.2.1. Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin bằng phương pháp
ngâm chiết rút
Nguyên liệu đƣợc ngâm cùng dung môi ở 4oC, không ánh
sáng. Dịch chiết thô sẽ đƣợc thu nhận sau khi tiến hành ly tâm.
2.2.2. Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin bằng phương pháp
thủy phân enzyme
Nguyên liệu đƣợc cho vào bộ phản ứng cùng đệm acetat 50
mM, pH 6. Tiếp đó, enzyme đƣợc bổ sung vào, khuấy đều với tốc độ
khuấy 150 rpm, trong thời gian 6 giờ, 35°C (Dumay et al. 2013).
Dịch chiết thô sẽ đƣợc thu nhận sau khi tiến hành ly tâm.
2.3. Tinh sạch R-phycoerythrin
2.3.1. Tinh sạch R-phycoerythrin bằng sắc ký trao đổi ion
Dịch chiết thô đƣợc nạp vào cột trao đổi ion âm DEAE-
Sepharose Fast Flow (26 mm x 100 mm) và đƣợc rửa giải gradient.
Các cƣờng độ ion khác nhau đƣợc nghiên cứu bao gồm: 0 - 150, 150
- 200 và 200 - 1000 mM; 0 - 150, 150 - 250 và 250 - 1000 mM và 0 -
150, 150 - 300 và 300 - 1000 mM.
2.3.2. Phương pháp điện di
Dung dịch thu nhận sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc
ký trao đổi ion DEAE đƣợc tiếp tục phân tích bằng phƣơng pháp điện
di SDS-PAGE
4
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp hóa sinh
2.4.1.1. Xác định chất lƣợng R-phycoerythrin
- Hàm lƣợng R-phycoerythrin
[R-PE] (mg/ml) = [(A565-A592) - (A455-A592) × 0.20] × 0.12
- Chỉ số độ tinh khiết của R-phycoerythrin (Galland-Irmouli et al.
2000):
PI= A565/A280 (PI standard = 3,2)
2.4.1.2. Xác định protein hòa tan
Protein hòa tan đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Bradford
(Bradford 1976).
2.4.1.3. Xác định đƣờng hòa tan
Hàm lƣợng đƣờng hòa tan đƣợc xác định bằng phƣơng pháp
Dubois (Dubois et al. 1965).
2.4.2. Phương pháp toán học
Thiết kế ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế ma trận
phức hợp trung tâm (central composite design, CCD) (Homayoonfal
et al. 2015). Theo phƣơng pháp này, 19 thí nghiệm đƣợc thực hiện
bao gồm 8 thí nghiệm nhân tố, 5 thí nghiệm tại tâm và 6 thí nghiệm
xung quanh trục. Phần mềm Statgraphics Plus v.5 đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu này. Ngoài ra, phần mềm Minitab 16 phân tích
phƣơng sai ANOVA (p<0,05) đƣợc sử dụng để thực hiện các tính
toán thống kê trong các thí nghiệm nghiên cứu.
5
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nghiên cứu quy trính chiết xuất chất màu R-phycoerythrin
3.1.1. Nghiên cứu chiết xuất R-PE bằng phương pháp ngâm
3.1.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi
Nguyên liệu đƣợc sử dụng là rong biển Gracilaria gracilis
sấy thăng hoa và nghiền mịn bằng nitơ lỏng. Dung môi đƣợc sử dụng
cho quá trình ngâm, chiết rút là nƣớc. Các tỷ lệ giữa nguyên liệu và
dung môi đƣợc khảo sát bao gồm: 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40 (m/V).
Bảng 3.1. Hàm lƣợng R-PE và chỉ số độ tinh khiết PI tại các tỷ lệ
giữa nguyên liệu/dung môi nƣớc đƣợc khảo sát
Tỷ lệ (m/V)
1/5
Hàm lƣợng R-PE (mg/g CK)
PI
nd
nd
1/10
1/20
1/30
1/40
2,49±0,02*
3,20±0,05
3,26±0,03
3,35±0,07
0,14±0,01
0,12±0,01
0,12±0,01
0,14±0,01
Chú thích: nd = no data (không thu đƣợc dữ liệu)
*: kết quả có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P<0,05
Năng suất chiết R-PE đạt giá trị cao khi thực hiện chiết xuất
theo các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/20, 1/30 và 1/40. Tuy nhiên,
kết quả thu đƣợc giữa các mẫu này không có sự khác biệt đáng
kể.Trong nghiên cứu này, kết quả của mẫu tỷ lệ nguyên liệu/dung
môi nƣớc 1/20 (m/V) đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết xuất
Từ các tài liệu tham khảo (Denis et al 2009, Fleurence 2013,
Munier et al. 2013) chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian
chiết xuất đến quá trình ngâm, chiết rút R-PE tại các thời điểm: 20
phút, 360 phút (6h) và 960 phút (16h).
Bảng 3.2. Chất lƣợng R-PE tại các thời điểm đƣợc khảo sát
Thời gian (phút) Hàm lƣợng R-PE (mg/g CK)
PI
20
360
960
3,21 ± 0,03
3,13 ± 0,07
2,67 ± 0,02*
0,11 ± 0,02
0,10 ± 0,01
0,07 ± 0,01
Chú thích: *: kết quả có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với P<0,05
6
Tải về để xem bản đầy đủ
30 trang
14120
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Báo cáo tóm tắt Đề tài Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ rong biển đỏ", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- bao_cao_tom_tat_de_tai_nghien_cuu_quy_trinh_chiet_xuat_chat.pdf
