Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng oxid hóa của các peptid Tryptophyllin L
Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Số 39B, 2019
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
TRẦN THỊ THANH NHÃ, TRẦN THÁI HOÀNG, LÊ MINH HIẾU, VĂNG GIA HUY
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
Abstract. Hai tetrapeptid Tryptophillin L gồm Phe-Pro-Trp-Leu(OH) và Phe-Pro-Trp-Leu(NH2) được
tổng hợp thành công bằng phương pháp tổng hợp peptid trên pha rắn sử dụng kỹ thuật Fmoc. Cơ cấu hai
peptid được xác nhận bằng phương pháp đo phổ khối lượng (MS) và phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR), cùng với độ tinh khiết hơn 95% được xác nhận bằng sắc ký lỏng cao áp C-18 (RP-HPLC).
Khảo sát hoạt tính kháng oxid hóa của hai peptid bằng hai phản ứng DPPH và FRAP cho thấy Phe-Pro-
Trp-Leu(NH2) có khả năng kháng oxid hóa vượt trội và là một hợp chất tiềm năng để phát triển peptid
kháng oxid hóa.
Keywords. Tổng hợp peptid trên pha rắn, Fmoc, Tryptophyllin L, chất kháng oxid hóa, DPPH, FRAP.
SYNTHESIS AND INVESTIGATION OFANTIOXIDANT ACTIVITY OF
TRYPTOPHILLIN L PEPTIDES
Abstract. Two Tryptophyllin L tetrapeptides including Phe-Pro-Trp-Leu(OH) and Phe-Pro-Trp-
Leu(NH2) were successfully synthesized using Fmoc solid-phase peptide synthesis technique. The
structures of two peptides were confirmed by mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance
(NMR) measurements. Purity of more than 95% for both peptides were revealed by Reverse Phase Liquid
Chromatography (RP-HPLC). Screening for antioxidant activities of the two peptides by DPPH and
FRAP assays showed a high antioxidant potency of Phe-Pro-Trp-Leu(NH2) which is in contrast with Phe-
Pro-Trp-Leu(OH) and required further investigation for its potential application as an antioxidant for
domestic or medicinal purpose.
Keywords. Peptide solid-phase synthesis, Fmoc, Tryptophyllin L, antioxidants, DPPH, FRAP.
1
GIỚI THIỆU
Vai trò của peptid ngày càng trở nên quan trong trong các nghiên cứu dược phẩm, hóa mỹ phẩm và
gần đây là công nghệ thực phẩm [1-5]. Các công trình nghiên cứu cho thấy, các peptid phân lập từ tự
nhiên thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học bao gồm khả năng kháng oxid hóa, hạ huyết áp, kháng vi
sinh và kháng khuẩn [6]. Peptide kháng oxid hóa đặc biệt được chú ý khi chúng là hợp chất tiềm năng góp
phần quan trọng vào việc ngăn ngừa và chữa trị các căn bệnh như tim mạch, tiểu đường, ung thư, viêm
khớp...[6-9]. Hơn nữa chúng còn có khả năng tạo phức hiệu quả với các ion kim loại như Fe2+ hoặc Cu2+
và làm chậm quá trình peroxid hóa của lipid. Điều này khiến peptid ly trích từ tự nhiên trở thành các hợp
chất được nghiên cứu rộng rãi nhằm ứng dụng trong công nghiệp bảo quản thực phẩm thực phẩm và chất
kháng oxid hóa trong nghiên cứu dược phẩm [10-12].
Đa số các peptid với hoạt tính sinh học thu được từ các nguồn protein khác nhau bằng phương pháp
thủy giải dùng vi sinh hay dùng các enzym thủy giải (protease). Rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm
nâng cao hiệu quả của quy trình thủy giải, khử, tinh chế, xác định cơ cấu và hoạt tính của các peptid đã
được công bố. Qua đó, số lượng peptid với hoạt tính kháng oxid hóa được phát hiện cũng ngày nhiều và
đa dạng về cơ cấu [10, 13-19].
Ngoài việc phân lập và xác định cơ cấu của các peptid có hoạt tính kháng oxid hóa, các nghiên cứu
khác về mối quan hệ giữa cơ cấu và hoạt tính bao gồm ảnh hưởng của thành phần amino acid, vị trí và số
lượng của các amino acid đến khả năng kháng oxid hóa của các peptid này cũng được tiến hành, nhằm
làm cơ sở cho việc dự đoán và thiết kế các peptid có hoạt tính kháng oxid hóa [10, 11, 16]. Trong một
nghiên cứu thống kê trên 42 peptid kháng oxid hóa của nhóm nghiên cứu của Xia từ Trường đại học Y
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
125
khoa Guangdong [11] cho thấy chúng có độ dài 3-16 amino acid, trong đó nhóm có hoạt tính kháng oxid
hóa cao nhất có độ dài dưới 7 amino acid và khối lượng phân tử nhỏ hơn 1000 đvC. Sự có mặt với mật độ
cao của các amino acid hương phương như Tyr, His, Trp và Phe; amino acid kỵ nước như Val, Leu, Ile,
Pro, Ala, Met và Gly được cho là có ảnh hưởng lớn đối với tính kháng oxid hóa của các peptid đã được
nghiên cứu [11, 20]. Nghiên cứu mối quan hệ cơ cấu-tính chất sử dụng mô hình định lượng (QSAR) cho
thấy sự có mặt của amino acid kỵ nước tại vị trí C3 của vùng đuôi carboxilic giúp tăng khả năng phá hủy
gốc peroxi của peptid, từ đó tăng khả năng kháng oxid hóa của chúng [21].
Khả năng thể hiện hoạt tính kháng oxid hóa của các -amino acid đơn lẻ cũng được nghiên cứu để
tìm kiếm mối liên hệ trực tiếp giữa sự có mặt và số lượng các amino acid này đối với hoạt tính của peptid
kháng oxid hóa. Cụ thể, khả năng bị oxid hóa cao hơn của các amino acid Cys, Met, Trp, Tyr và His so
với các amino acid khác được giải thích bởi khả năng dễ bị oxid hóa của dây nhánh tiol trong Cys, tioeter
trong Met, indol trong Trp, hidroxil phenol trong Tyr, và imidazol trong His [22]. Nhận định này được
kiểm chứng lại lần nữa vào đầu năm 2018 khi nhóm của Matsui tiến hành khảo sát khả năng bảo vệ
myoglobin của 20 -amino acid chống lại các gốc chứa oxigen và nitrogen hoạt động. Nghiên cứu này
cho thấy Trp đứng đầu trong các amino acid chống lại các tác nhân oxid hóa chứa oxigen như hipoclorit
và gốc peroxi, trong khi các amino acid như Asp, Asn, Glu và Gln lại thể hiện tốt khả năng chống lại gốc
oxid hóa chứa nitrogen như peroxinitrit [23].
Ngoài yếu tố thành phần amino acid, sự ảnh hưởng của số lượng và trình tự sắp xếp của các amino
acid đến khả năng kháng oxid hóa của các peptid cũng được nghiên cứu bởi một số nhóm. Trình tự sắp
xếp của các amino acid được nhận định có ảnh hưởng quyết định đến tính oxid hóa của các peptid [24].
Cụ thể sự thay đổi vị trí hay loại bỏ của các amino acid được cho là sẽ làm thay đổi khả năng oxid hóa
của peptid tương ứng [25]. Tuy nhiên khuynh hướng thay đổi cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu rõ
ràng.
Việc khảo sát hoạt tính kháng oxid hóa của các peptid ly trích từ thiên nhiên cùng với việc ảnh
hưởng của các yếu tố cơ cấu đến khả năng kháng oxid hóa của các chúng sẽ góp phần mở rộng ngân hàng
các peptid thuộc nhóm này, đồng thời làm cơ sở cho việc dự đoán và thiết kế peptid ứng dụng vào trong
các ngành như công nghệ thực phẩm và dược phẩm. Chính vì mục đích này mà nhóm nghiên cứu tổng
hợp và xác định khả năng kháng oxid hóa của một số peptid Tryptophyllin.
Tryptophillin L là các peptid được cô lập từ dịch tiết qua da của loài ếch Litoria rubella. Một số
Tryptophillin L tiêu biểu được trình bày trong Bảng 1. Litoria rubella tiết một lượng lớn các
Tryptophyllin ra khi có kích thích xung điện thấp 10-15V qua da. Các Tryptophillin L là peptid chứa từ 4-
7 amino acid với chuỗi Pro-Trp gắn liền nhau [26, 27]. Trong khi các họ peptid phân lập từ loài lưỡng cư
khác như caeridin, aurein, citropin, signiferin, tachykinin sở hữu hàng loạt hoạt tính sinh học như tính
kháng khuẩn, kháng nấm, chống co cơ, giảm đau…nghiên cứu vẫn chưa chỉ ra hoạt tính sinh học nổi bật
của nhóm Tryptophillin [26, 28]. Mặt khác, một nghiên cứu gần đây cho thấy trong dịch tiết của loài này
tại một số địa phương của Úc có chứa các chất chuyển hóa của tryptophan như kynurenine, 5-
hydroxytryptophan và N-formylkynurenine [29]. Điều này có thể lý giải do khả năng dễ bị oxid hóa của
tryptophan có trong các peptid này nhưng cũng đồng thời đặt ra câu hỏi, liệu các peptid Tryptophyllin L
này có phải là những hợp chất có hoạt tính kháng oxid hóa và cấu trúc của chúng có thể được sử dụng
như nền tảng để phát triển các peptid kháng oxid hiệu quả trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm. Giả
thuyết này được củng cố khi các peptid ngắn này đều chứa các amino acid được đánh giá có mặt nhiều
trong các peptid kháng oxid hóa như Pro, Phe và Leu [14, 29, 30]. Để trả lời câu hỏi trên, nhóm nghiên
cứu đã tổng hợp 2 peptid Tryptophyllin L1.2 và Tryptophyllin L1.2.1 (Bảng 1), khảo sát hoạt tính kháng
oxid hóa của chúng qua các thí nghiệm với các tác nhân oxid hóa chứa oxigen như DPPH và FRAP, so
sánh khả năng kháng oxid hóa của chúng với chất chuẩn Trolox từ đó đánh giá tiềm năng sử dụng chúng
như chất nền cho tổng hợp các peptid kháng oxid hóa.
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
126
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
Bảng 1. Một số Tryptophyllin L peptid phân lập từ dịch tiết qua da của loài ếch Litoria rubella
Tên
KLPT
415
560
561
501
Cơ cấu peptid
Pro-Trp-Leu(OH)
Tryptophyllin L 1.1.1
Tryptophyllin L 1.2
Tryptophyllin L 1.2.1
Tryptophyllin L 1.5
Caeridin type Rubellidin
Caeridin type Rubellidin
Phe-Pro-Trp-Leu (NH2)
Phe-Pro-Trp-Leu(OH)
Ser-Pro-Trp-Leu(OH)
Ala-Gly-Leu-Gly-Asp-
Gly-Leu-Gly-Asp-Ile-
882
1038
Tổng hợp peptid trên pha rắn (solid phase peptide synthesis SPPS) là phương pháp được thiết lập và
phát triển bởi Merifield [31] và hiện đang là phương pháp được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm
nghiên cứu cũng như trong công nghiệp để điều chế peptid. Được gọi là phương pháp tổng hợp peptid
trên pha rắn vì nó gắn amino acid đầu tiên lên trên các hạt polimer không tan trong dung môi phản ứng
còn gọi là resin, rồi lần lượt gắn các amino acid theo trình tự để tạo dây peptid mong muốn (Hình 1) [32-
33].
Trong nghiên cứu này các peptid sẽ được tổng hợp trên hai loại resin là 2-chlorotrityl chloride resin
và rink amide resin với các chất ghép đôi N-[(1H-benzotriazole-1-yl)-(dimethylamino)methylene]-N-
methylmethanaminium hexafluoro-phosphate N-oxide (HBTU)/ 1-hydroxybenzotriazole (HOBt). Peptid
được tinh chế sử dụng phương pháp ly trích và cấu tạo được xác định bằng phương pháp phổ nguyên tử
(NMR) và phổ khối lượng (MS). Khả năng kháng oxid hóa của các peptid sẽ được xác định với hai thí
nghiệm DPPH và FRAP.
O
H
N
+
linker
X
OH
R
Y
(i)
amino acid 1
O
H
N
linker
X
O
R
Y
(ii)
O
linker
H2N
O
R
Y
O
H
N
X
OH
(ii)
R1
Y1
amino acid 2
O
H
N
H
linker
N
X
O
O
R1
R
Y1
Y
(iii)
Peptide
Hình 1: Quy trình tổng hợp peptid trên pha rắn
X, Y là nhóm bảo vệ đầu amin và dây nhánh tương ứng
Linker là nhóm chức nối amino acid và resin
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
127
2
HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP
2.1 Hóa chất
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt), Piperidine, Tetrachloro-1,4-benzoquinone (Chloranil),
Picrylsulfonic acid (TNBS), N,N – Diisopropylethylamine (DIPEA), Trifluoroacetic acid (TFA), 2,2-
Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) được mua từ công ty hóa chất
Sigma Aldrich.
Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, và Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2-Chlorotrityl chloride ressin
(100-200 mesh, 1,0-1,5 mmol/g), Rink amide resin (50-90 mesh, 0,8-1,0 mmol/g), (2-(1H-benzotriazol-1-
yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexauorophosphate) (HBTU) được mua từ công ty GL BioChem, Thượng
Hải, Trung Quốc với độ tinh khiết > 95%. Dung môi methylene chloride (DCM) và dimethylformamide
(DMF) với độ tinh khiết > 99.5% được mua từ công ty hóa chất Duksan, Hàn Quốc.
Độ tinh khiết của tác chất và dung môi được yêu cầu nghiêm ngặc trong phản ứng tổng hợp peptid.
DIPEA và piperidin được chưng cất sau khi làm khô bằng KOH, được lưu trữ trong bình đựng rây phân
tử Linde 4 Å và sử dụng trong vòng 2 tuần. Dimethylformamide (DMF) và dichloromethane (DCM) được
làm khô bởi bột Linde 4 Å ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng. Tất cả các hóa chất phải được lưu trữ ở nhiệt
độ dưới 4 oC. Các thuốc thử TNBS and chloranil phải được pha mới ở mỗi lần thử nghiệm.
2.2. Xác định cơ cấu
Điểm chảy được đo trên Mel-Temp melting point (IA9100). Phổ IR được đo trên thiết bị Bruker
Tensor 27. Phổ 1H, 13C-NMR và DEPT được ghi trên phổ kế Bruker Advance III hoạt động tại tần số 500
1
1
13
MHz cho H và 125 MHz cho phổ 13C-NMR và DEPT, dung môi DMSO-d6. Độ dời cho H, C -NMR
được trình bày dưới đơn vị ppm () và mô tả như singlet (s), doublet (d), quartet (q), multiplet (m), double
doublet (dd) và coupling constants J tính bằng Hz.
Phổ khối lượng phun sương điện tử (ESI MS) được tiến hành trên thiết bị Finigan LCQ Advantage
Max LC-ESMS. Nguồn ion hóa: ion trap, ion hóa dương và âm, dãy khối lượng: 80,0-1000,0 m/z, thế ion
hóa 12 eV, loại scan: full, thời gian (acuisition time) 15 phút. Dung môi để chạy RP-HPLC là 0,0% dung
môi B đến 100% dung môi B (dung môi B: acetonitril + 0,1% TFA và dung môi A: 100% water + 0.1%
TFA), cột Cosmosil C18, 4,6 x 250 mm, 5 m, 100 A tốc độ 1,0 ml/phút.
2.3. Quy trình tổng hợp peptid
Cả hai peptid đều được tổng hợp trên thiết bị lắc tự động sử dụng kỹ thuật bảo vệ Fmoc (Hình 1).
Peptid Phe-Pro-Trp-Leu(NH2) được tổng hợp trên 2-chlorotrityl chloride resin và quy trình được tóm tắt
trong Bảng 1. Với HBTU/HOBt là tác nhân kích hoạt phản ứng ghép đôi của các amino acid. Các test
màu trong Bước 8 được tiến hành để xác định sự còn lại (sau phản ứng ghép đôi) hay sự xuất hiện (sau
khi cắt Fmoc) của gốc amin trong quá trình phản ứng. Hỗn hợp (10% DIPEA/DMF và TNBS/DMF) được
sử dụng phát hiện amin nhất cấp, còn hỗn hợp (2% acetaldehyde/DMF và 2% chloranil/ DMF) được dùng
để nhận biết sự có mặt của amin nhị cấp.
Peptid Phe-Pro-Trp-Leu(OH) được tổng hợp trên Rink amid resin và dung môi được sử dụng là
DMF. Trước khi gắn amino acid đầu tiên lên resin, Fmoc được cắt ra khỏi Rink amid bởi dung dịch 20%
piperidin trong DMF. Sau đó tiến hành che bằng dung dịch anhidrid acetic: pyridin tỉ lệ thể tích 3:2. Các
amino acid được gắn lên Rink amid theo quy trình tương tự như trong Bảng 1. Hỗn hợp TFA/H2O/ TIPS
(triisopropyl silane) 18:1:1 được sử dụng để cắt các peptid ra khỏi resin trong 1 giờ.
Peptid được vừa cắt khỏi resin sẽ được làm lạnh trong dietil eter và tách khỏi dung dịch dưới dạng
kết tủa. Hỗn hợp được đem ly tâm và lọc. Chất rắn được hoàn tan trong dung môi 10% ACN/H2O rồi
đông khô. Peptid Phe-Pro-Trp-Leu(NH2), công thức phân tử là C31H40N6O4 được tổng hợp với hiệu suất
80%. Peptid Phe-Pro-Trp-Leu(NH2), công thức phân tử là C31H39N5O5 được tổng hợp với hiệu suất 73%.
Các peptid được tổng hợp theo quy trình được tóm tắt ở Bảng 2. Quy trình này là kết quả của sự tối
ưu hóa tất cả các yếu tố liên quan gồm dung môi, thời gian lắc và thể tích của các tác chất và dung môi
cho tổng hợp các tetrapeptid (peptid gồm bốn amino acid), được tiến hành trong điều kiện của phòng thí
nghiệm tại Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Quy trình này được kiểm chứng cho
tổng hợp Tryptophyllin L1.2 và một số tetrapeptid đã cho kết quả tương tự và hiệu suất đều trên 70%.
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
128
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
Bảng 2. Quy trình tổng hợp peptid sử dụng 2-chlorotrityl chloride resin (với khả năng tải lý thuyết của resin là 1
mmol peptid/1 g resin)
Tên bước
Hóa chất sử dụng
Lượng
chất
500 mg
Thời
gian
1 h
Lặp
lại
x 1
1. Ngâm resin
2-Chlorotrityl chloride
DCM
5 ml
2. Tải AA1 lên
resin
Thêm Fmoc-AA1 (1.1mol), DIPEA (5.5 mol) trong
DCM
DCM
6 ml
3-8 h
x 1
x 3
3. Rửa lần 1
4. Che resin
5. Rửa lần 2
6. Cắt Fmoc
7. Rửa lần 2
8. Test màu
6 ml
5 ml
6 ml
6 ml
5 ml
CH2Cl2:MeOH :DIPEA (17:2:1)
Rửa bằng DCM/DMF/DCM
20 % piperidin/DMF (tỉ lệ 1:4)
Rửa bằng DCM/DMF/DCM
Amin nhất cấp: (10% DIPEA/ DMF) và
(5 mg TNBS + 0.5 mL DMF) đỏ/ cam đỏ
Amin nhị cấp: (2% acetaldehid/DMF) và (2 %
cloranil/DMF) xanh đậm/lá
Thêm Fmoc-AAn (3 mol), HBTU (3mol), HOBt
(3mol), DIPEA (6 mol), dung môi DCM: DMF (1:1)
Từ bước 7-9 cho các Fmoc-amino acid tiếp theo
TFA/ H2O/ TIPS (18:1:1)
30 min x 1
x 3
1 h
x 3
9. Ghép đôi các
AA tiếp theo
10. Lặp lại
11. Cắt peptid ra
khỏi resin
5 ml
5 ml
6 h
1 h
x 2
x 1
x 2
2.4. Thí nghiệm bắt gốc tự do DPPH
Khả năng bắt gốc tự do DPPH của peptid được đo lường bởi phương pháp đo quang [34]. Dung dịch
chứa 2 ml của peptid trong etanol ở nồng độ giảm dần từ 800-50 g/ml được trộn với 2 ml của dung dịch
DPPH nồng độ 0,2 mM trong etanol. Hỗn hợp phản ứng được để tại nhiệt độ phòng trong bóng tối trong
30 phút. Độ hấp thụ của dung dịch được đo tại 517 nm bởi máy đo quang Thermo Scientific Genesys 20.
Dung dịch DPPH: H2O (v/v 1:1) được sử dụng như đối chứng âm. Khả năng bắt gốc tự do của hai peptide
ược tính sử dụng công thức sau:
Khả năng bắt gốc tự do (%) = [(Acontrol − Asample)/Acontrol]x 100 (1)
Trong đó Acontrol là độ hấp thụ của đối chứng âm.
Asample là độ hấp thụ của peptid ở các nồng độ khác nhau.
Tất cả các peptid được tiến hành 3 lần và lấy giá trị trung bình. Giá trị nồng độ tại đó peptid thể hiện
khả năng bắt 50% gốc tự do (IC50) được suy ra từ phương trình hồi quy tuyến tính mô tả sự phụ thuộc
của phần trăm bắt gốc tự do theo nồng độ của peptid. Khả năng bắt gốc DPPH của glutathione được xác
định giống như đối với các peptid.
2.5. Thí nghiệm khử FRAP
Thí nghiệm FRAP được thực hiện theo phương pháp của Benzie và Strain [35]. Thuốc thử FRAP
được điều chế bằng cách trộn dung dịch đệm acetat 0,3 M, TPTZ 10 mM trong 40 mM HCl, 20 mM
FeCl3 pH 3,6 theo tỷ lệ 10:1:1 về thể tích. Các peptid được hòa tan trong dung dịch etanol: H2O (1: 1) để
o
đạt nồng độ 2 mg/ml. Dung dịch peptid và thuốc thử FRAP được ủ ở 37 C trong bể ổn nhiệt. Peptid và
dung dịch FRAP được trộn với nhau theo tỉ lệ 1:5, để ổn nhiệt và độ hấp thụ được đo ở 593 nm sau 30
phút. Đường chuẩn được tạo ra bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch FeSO4 nồng độ 100-1000 M.
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
129
3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tryptophyllin L 1.2 Phe-Pro-Trp-Leu(NH2)
Hai peptid Phe-Pro-Trp-Leu(NH2) và Phe-Pro-Trp-Leu(OH) có cấu tạo được mô tả lần lượt trong
Hình 2 và 3. Phân tích cơ cấu hai sản phẩm peptid bằng phương pháp ghi phổ FTIR, phổ khối lượng và
phổ NMR cho kết quả như sau:
14
15
13
16
12
17
10
27
H2N
24
26
NH
O
9
23
C
28
CH
O
H2C
11
25
1
C
H2
8
CH
31
H
H2
C
18
N
C
CH3
29
7
C
5
CH
N
3
CH
30
4
N
19
20
22
H
6
C
2
CH3
O
21
O
NH2
Hình 2: Cấu tạo phân tử Phe-Pro-Trp-Leu(NH2) (Tryptophyllin L 1.2)
Peptid Phe-Pro-Trp-Leu(NH2), công thức phân tử là C31H40N6O4, thể rắn, hiệu suất 80%. Nhiệt độ
nóng chảy 108-120 oC. Phổ dương ESI HRMS của peptid cho peak [M+H] + 561.30. IR (KBr, νmax, cm-1):
3294 (N-H), 1648 (CO-NH), 1516 (C-N).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.78 (dd, J = 23.1, 11.0 Hz, 1H, NH indole), 8.29 (d, J = 9.3 Hz,
1H, CO-NH-CH), 7.89 (dd, J = 8.1, 4.8 Hz, 1H, CO-NH-CH), 7.61 (t, J = 7.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.32 (dd, J
= 12.8, 5.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.31 – 7.20 (m, 4H, Ar-H), 7.18 (s, 1H, CH-NH indole), 7.13 (s, J = 7.3 Hz,
2H, CO-NH2), 7.09 – 7.02 (m, 1H, Ar-H), 6.98 (m, 2H, Ar-H), 4.62 – 4.52 (m, 1H, NH-CH-CONH2),
4.44 (dd, J = 8.1, 3.8 Hz, 1H, NH-CH-CO pyrrolidine), 4.33 – 4.19 (m, 2H, NH-CH-CO), 3.27 – 3.10 (m,
1H, CH2 pyrrolidine), 3.10 – 2.86 (m, 4H, CH2-CH-CO), 2.52 – 2.47 (m, 4H, CH2 pyrrolidine), 2.05 –
1.95 (m, 1H, CH2 pyrrolidine), 1.91 (s, 1H, CH-NH2), 1.73 (m, J = 30.5 Hz, 2H, CH2-CH(CH3)2), 1.60 –
1.50 (m, 1H, CH-(CH3)2), 0.87 (dd, J = 6.5, 3.4 Hz, 3H, CH-(CH3)2), 0.83 (d, J = 6.4 Hz, 3H, CH-
(CH3)2).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 174.35 (C6), 171.34 (C7), 171.24 (C18), 167.27 (C23), 136.52
(C12), 135.09 (C31), 130.32, 129.88, 129.11, 128.96, 127.65 (C26-30), 127.88 (C17), 124.15, 121.28,
118.88, 118.70, 111.70 (C11, C13-16), 110.21 (C10), 60.09 (C19), 54.05 (C8), 52.71 (C24), 51.34 (C5),
47.23 (C22), 41.61 (C4), 36.55 (C25), 29.41 (C20), 27.86 (C21), 24.84 (C9), 24.59 (C3), 23.51 (C1-2),
22.10(C1-2).
14
15
13
16
12
17
10
27
H2N
24
26
NH
O
9
23
C
28
CH
O
H2C
11
25
1
C
H2
8
CH
H
H2
C
18
N
CH3
C
29
7
C
5
CH
N
3
CH
30
4
N
19
20
22
H
6
C
2
O
CH3
21
O
OH
Hình 3: Cơ cấu phân tử Phe-Pro-Trp-Leu(OH) (Tryptophyllin L 1.2.1)
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
130
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
Peptid Phe-Pro-Trp-Leu(NH2), công thức phân tử là C31H39N5O5, thể rắn, hiệu suất 73%. Nhiệt độ
o
nóng chảy 108-120 C. Phổ dương ESI MS của peptid cho mũi [M+H] + 562.10. IR (KBr, νmax, cm-1):
3294 (N-H), 1648 (CO-NH), 1516 (C-N).
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.81 (t, J = 18.7 Hz, 1H, NH indole), 8.11 – 7.99 (m, 1H, CO-NH-
CH), 7.94 (t, J = 8.7 Hz, 1H, CO-NH-CH), 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 1H, CH-NH indole), 7.56 (dt, J = 7.5, 5.9
Hz, 1H, Ar-H), 7.35 – 7.17 (m, 5H, Ar-H), 7.12 – 7.06 (m, 1H, Ar-H), 7.04 (dd, J = 14.2, 7.1 Hz, 1H, Ar-
H), 6.96 (dd, J = 9.3, 5.5 Hz, 1H, Ar-H), 4.62 – 4.53 (m, 1H, NH-CH-CONH2), 4.36 (dd, J = 8.2, 3.5 Hz,
1H, NH-CH-CO pyrrolidine), 4.22 (dd, J = 14.6, 7.5 Hz, 1H, NH-CH-CO), 4.17 – 4.08 (m, 1H, NH-CH-
CO), 3.01 (ddd, J = 28.6, 16.0, 9.8 Hz, 1H), 2.87 – 2.76 (m, 2H, CH2-CH-CO), 2.71 (m, J = 26.6, 13.8
Hz, 1H, CH2-CH-CO), 2.50 (m, 5H, CH2 pyrrolidine), 1.74 (m, 2H, CH2-CH(CH3)2), 1.70 – 1.55 (m, 1H,
CH-(CH3)2 ), 1.56 – 1.46 (m, 2H), 1.45 – 1.22 (m, 3H), 0.88 (dd, J = 10.8, 4.7 Hz, 3H, CH-(CH3)2), 0.84
(dd, J = 6.4, 4.3 Hz, 3H, CH-(CH3)2).
13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 174.55 (C6), 171.39 (C7), 171.63 (C18), 171.47 (C23), 136.50
(C12), 135.09 (C31), 130.09, 129.67, 128.72, 128.61, 127.08 (C26-30), 127.95 (C17), 126.81, 124.11
121.24, 118.74, 111.69 (C11, C13-16), 110.60 (C10), 60.16 (C19), 54.35 (C8), 51.72 (C24), 51.07 (C5),
46.99 (C22), 40.78 (C4), 39.69 (C25), 31.40 (C20), 29.21 (C21), 24.75 (C9), 24.67 (C3), 23.35, 22.19
(C1-2),
Cơ cấu của hai peptid được xác định qua các phép đo phổ khối lượng và phổ NMR. Sự có mặt nhóm
chức amid được minh chứng bởi phổ FTIR và phổ 1H NMR, với số lượng nguyên tử C các bậc khác nhau
13
được thể hiện qua phổ C và các phổ DEPT. Tuy nhiên đối với loại hợp chất trên, sự có mặt của nhóm
chức carboxilic và amido (CO-NH2) rất khó khẳng định bởi phổ NMR và vì vậy phương pháp phổ khối
lượng đã được sử dụng. Kết quả phổ khối lượng cho thấy hai mũi ứng với khối lượng phân tử hai chất tại
561 và 562 m/z. Phổ khối lượng MS/MS cho kết quả sự mất amoniac (NH3) từ [M+H]+ của peptid Phe-
Pro-Trp-Leu(NH2) và sự mất CO2 từ [M+H]+ của peptid Phe-Pro-Trp-Leu(OH)
3.2. Hoạt tính kháng oxid hóa qua thí nghiệm DPPH
Thử nghiệm hoạt tính kháng oxid hóa của hai peptid sử dụng gốc tự do DPPH, đây là gốc tự do bền,
màu xanh tím và hấp thu mạnh ở bước sóng 517 nm. Bởi vì độ hấp thu của dung dịch phản ứng có giá trị
phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ ban đầu của DPPH, tỉ lệ DPPH-peptid và dung môi, cho nên thay
vì sử dụng sự giảm độ hấp thụ để biểu thị cho khả năng phản ứng của peptid, chỉ số IC50 gọi là chỉ số bắt
50% gốc DPPH, được sử dụng để đặc trưng cho hoạt tính kháng oxid hóa của các peptid [36].
Kết quả thí nghiệm DPPH cho thấy có sự khác biệt lớn trong hoạt tính kháng oxid hóa của hai peptid
Tryptophyllin L. 1.2 và Tryptophyllin L. 1.2.1. Phản ứng của Tryptophyllin L. 1.2 với DPPH diễn ra
nhanh hơn Tryptophyllin L. 1.2.1 rất nhiều, biểu hiện bằng sự giảm cường độ màu của dung dịch DPPH
ngay lập tức khi cho Tryptophyllin L. 1.2 vào so với sự mất màu rất chậm của dung dịch phản ứng
Tryptophyllin L. 1.2.1. Biểu đồ biểu thị sự phụ thuộc của phần trăm bắt gốc tự do vào nồng độ của
Tryptophyllin L 1.2 là tuyến tính còn biểu đồ của Tryptophyllin L 1.2.1 cho thấy, peptid này không phản
ứng với DPPH ở nồng độ nhỏ hơn 200 µg/ml, ngược lại còn làm tăng độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng
(Hình 3). Tuy nhiên, để thu được giá trị IC50, đường thẳng hồi quy đã được sử dụng cho cả hai peptid
trên, cho thấy IC50 của Tryptophyllin L. 1,2 là 2,59 mM trong khi Tryptophyllin L. 1.2.1 gần gấp đôi là
4.56 mM (Bảng 2). Với sự khác nhau duy nhất trong cơ cấu của 2 peptid này là gốc amid và gốc
carboxilic, có thể suy luận rằng sự thay thế gốc amid bởi gốc carboxilic làm giảm khả năng bắt gốc
DPPH. Hay nói cách khác, sự khác biệt về cơ cấu ảnh hưởng đến cơ chế trao đổi điện tử hoặc cho nhận
proton của peptid với DPPH. Để làm rõ hơn về khả năng trao đổi điện tử, hai peptid đã được cho thử
nghiệm với dung dịch FRAP (phần 3.3).
Bảng 3. Nồng độ bắt 50% gốc DPPH của hai peptid và chất chuẩn glutathione
IC 50
Tryp L 1.2
mM
Tryp L 1.2.1
mM
Glutathione
mM
2.59 ± 0.078
4.56 ± 0.43
0.16 ± 0.01
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
131
Tryptophyllin L 1.2
y = 0.033x + 2.2063
Tryptophyllin L 1.2.1
35.000
30.000
25.000
20.000
15.000
10.000
5.000
10
0
y = 0.025x - 16.148
500
0
1000
-10
-20
-30
-40
0.000
0
200
400
600
800 1000
nồng độ (g/mL)
nồng độ (g/mL)
Hình 4: Phần trăm bắt gốc DPPH của hai peptid theo nồng độ
So sánh khả năng bắt gốc tự do của hai peptid với glutathione, một peptid nội sinh kháng oxid hóa,
cho thấy khả năng kháng oxid hóa của các peptid Tryptophyllin L kém so với glutathione khoảng 10 lần
(Bảng 3). Tuy nhiên khi so sánh khả năng kháng oxid hóa của các Tryptophyllin L với các peptid được ly
trích từ thiên nhiên phổ biến như từ β-lactoglobulin, thịt, tảo và sản phẩm phụ thực phẩm [17, 25, 37, 38],
giá trị này là một giá trị nằm ở ngưỡng cao của peptid kháng oxid hóa.
3.3. Hoạt tính kháng oxid hóa qua thí nghiệm FRAP
Thí nghiệm FRAP dựa vào khả năng khử Fe3+(TPTZ)2 tạo phức Fe2+(TPTZ)2 có màu xanh đặc trưng
để xác định khả năng hoàn nguyên của peptid, tỉ lệ thuận với khả năng nhường điện tử với chất oxid hóa.
Thí nghiệm cho thấy hai peptid này phản ứng theo chiều hướng tương tự với DPPH, trong đó khả năng
tham gia phản ứng hoàn nguyên phức Fe3+(TPTZ)2 của Tryptophyllin 1.2 lớn hơn so với Tryptophyllin
1.2.1 với giá trị là tương ứng 87,55 và 5,23 mM Fe2+/mol peptid. Giá trị hoàn nguyên FRAP này được lấy
tại 30 phút như trong hầu hết các phản ứng FRAP của peptid nhằm mục đích so sánh. Tuy nhiên, phản
ứng thật sự không kết thúc tại thời điểm này, đồ thị biểu thị sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào thời gian cho
thấy, phản ứng của Tryptophyllin 1.2 kết thúc ở khoảng 150 phút và của Tryptophyllin 1.2.1 ở khoảng
250 (Hình 4). Tuy nhiên giá trị hoàn nguyên tại hai thời điểm này không được sử dụng do hai lý do, thứ
nhất trong phản ứng oxid hóa khử để thử hoạt tính kháng oxid hóa, tốc độ phản ứng sẽ đóng vai trò quan
trọng khi phải tương tác với chất oxid hóa nhanh hơn chất cần được bảo vệ (chẳng hạn lipid) và vì vậy
việc chọn thời điểm kết thúc phản ứng quá dài là không hợp lý và không phản ánh được tiềm năng kháng
oxid hóa của chúng. Tuy nhiên phải nhấn mạnh rằng, khả năng hoàn nguyên của hai peptid thay đổi rất
đáng kể khi kéo dài thời gian phản ứng, với giá trị lần lượt là 119,78 và 104,25 mM Fe2+/mol peptid.
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
132
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
2.5
2
Tryptophyllin L1.2
1.5
1
Tryptophyllin L1.2.1
0.5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Thời gian (phút)
Hình 5: Khả năng khử FRAP theo thời gian của hai peptid
4
KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này hai peptid Tryptophyllin L bao gồm Phe-Pro-Tryp-Leu(NH2) và Phe-Pro-
Tryp-Leu(OH) đã được tổng hợp thành công bằng phương pháp tổng hợp peptid trên pha rắn sử dụng 2-
chlorotrityl chloride và Rink amid resin. Cơ cấu của hai peptid đã được xác định qua các phương pháp đo
1
phổ FTIR, phổ khối MS và MS/MS và phổ H, 12C NMR và DEPT. Khảo sát hoạt tính kháng oxid hóa
của hai peptid bằng hai thí nghiệm DPPH và FRAP cho thấy Tryptophyllin L 1.2 là một chất có kháng
oxid hóa tiềm năng và cũng giải thích cho việc tiết ra một lượng lớn chất này trên da của loài Litoria
rubella khi bị kích thích bằng xung điện cường độ rất thấp, nhằm chống lại stress do môi trường tạo nên.
Tuy nhiên có một sự khác biệt lớn trong hoạt tính kháng oxid hóa của hai Tryptophyllin L trong khi
chúng chỉ khác nhau ở đuôi carboxilic và amid. Việc nghiên cứu mối quan hệ giữa cơ cấu và hoạt tính
kháng oxid hóa của hai peptid trong tương lai sẽ cho làm rõ lý do của sự khác biệt này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] K. Fosgerau, T. Hoffmann, Peptide therapeutics: current status and future directions, Drug Discovery Today, 20
(2015) 122-128.
[2] A. Henninot, J.C. Collins, J.M. Nuss, The current state of peptide drug discovery: Back to the future?, Journal of
Medicinal Chemistry, 61, (2017) 1382-1414.
[3] J.L. Lau, M.K. Dunn, Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future
directions, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 26, (2018) 2700-2707.
[4] S. Lohan, G. Singh Bisht, Recent approaches in design of peptidomimetics for antimicrobial drug discovery
research, Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 13 (2013) 1073-1088.
[5] P. Hashim, D. Mat Hashim, A review of cosmetic and personal care products: Halal perspective and detection of
ingredient, Pertanika Journal of Science and Technology, 21 (2013) 281-292.
[6] H. Admassu, M.A.A. Gasmalla, R. Yang, W. Zhao, Bioactive peptides derived from seaweed protein and their
health benefits: antihypertensive, antioxidant, and antidiabetic properties, Journal of Food Science, 83 (2018)
6-16.
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
133
[7] A. Montoya-Rodríguez, E.G. de Mejía, Pure peptides from amaranth (Amaranthus hypochondriacus) proteins
inhibit LOX-1 receptor and cellular markers associated with atherosclerosis development in vitro, Food
Research International, 77 (2015) 204-214.
[8] A. Sánchez, A. Vázquez, Bioactive peptides: A review, Food Quality and Safety, 1 (2017) 29-46.
[9] S. Chakrabarti, F. Jahandideh, J. Wu, Food-derived bioactive peptides on inflammation and oxidative stress,
BioMed Research International, 2014 (2014).
[10] J.M. Lorenzo, P.E. Munekata, B. Gómez, F.J. Barba, L. Mora, C. Pérez-Santaescolástica, F. Toldrá, Bioactive
peptides as natural antioxidants in food products–A review, Trends in Food Science & Technology, (2018).
[11] T.-B. Zou, T.-P. He, H.-B. Li, H.-W. Tang, E.-Q. Xia, The structure-activity relationship of the antioxidant
peptides from natural proteins, Molecules, 21 (2016) 72.
[12] M. Sohaib, F.M. Anjum, A. Sahar, M.S. Arshad, U.U. Rahman, A. Imran, S. Hussain, Antioxidant proteins and
peptides to enhance the oxidative stability of meat and meat products: A comprehensive review, International
Journal of Food Properties, 20 (2017) 2581-2593.
[13] B.T. Clarke, The natural history of amphibian skin secretions, their normal functioning and potential medical
applications, Biological Reviews, 72 (1997) 365-379.
[14] M.A. Apponyi, T.L. Pukala, C.S. Brinkworth, V.M. Maselli, J.H. Bowie, M.J. Tyler, G.W. Booker, J.C.
Wallace, J.A. Carver, F. Separovic, Host-defence peptides of Australian anurans: structure, mechanism of
action and evolutionary significance, Peptides, 25 (2004) 1035-1054.
[15] R.J. Lewis, M.L. Garcia, Therapeutic potential of venom peptides, Nature reviews drug discovery, 2 (2003)
790.
[16] K. Sato, Structure, Content, and Bioactivity of Food-Derived Peptides in the Body, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 66 (2018) 3082-3085.
[17] R. Liu, L. Xing, Q. Fu, G.-h. Zhou, W.-g. Zhang, A review of antioxidant peptides derived from meat muscle
and by-products, Antioxidants, 5 (2016) 32.
[18] J. Yang, L. Hu, T. Cai, Q. Chen, Q. Ma, J. Yang, C. Meng, J. Hong, Purification and identification of two novel
antioxidant peptides from perilla (Perilla frutescens L. Britton) seed protein hydrolysates, PloS one, 13
(2018) e0200021.
[19] P.A. Harnedy, M.B. O'Keeffe, R.J. FitzGerald, Fractionation and identification of antioxidant peptides from an
enzymatically hydrolysed Palmaria palmata protein isolate, Food Research International, 100 (2017) 416-
422.
[20] T. Wang, Q. Zhao, Q. Wang, Production and antioxidant properties of marine‐ derived bioactive peptides,
Marine proteins and peptides. Biological Activities and Applications, (2013) 385-406.
[21] Y.-W. Li, B. Li, Characterization of structure–antioxidant activity relationship of peptides in free radical
systems using QSAR models: key sequence positions and their amino acid properties, Journal of Theoretical
Biology, 318 (2013) 29-43.
[22] J.L. Hougland, Darling, J., & Flynn, S. , Protein posttranslational modification, John Wiley & Sons Inc., New
Jersey, 2013.
[23] R. Matsui, R. Honda, M. Kanome, A. Hagiwara, Y. Matsuda, T. Togitani, N. Ikemoto, M. Terashima,
Designing antioxidant peptides based on the antioxidant properties of the amino acid side-chains, Food
Chemistry, 245 (2018) 750-755.
[24] K. Saito, D.-H. Jin, T. Ogawa, K. Muramoto, E. Hatakeyama, T. Yasuhara, K. Nokihara, Antioxidative
properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial chemistry, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 51 (2003) 3668-3674.
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
134
TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXID HÓA
CỦA CÁC PEPTID TRYPTOPHYLLIN L
[25] Y. Ohashi, R. Onuma, T. Naganuma, T. Ogawa, R. Naude, K. Nokihara, K. Muramoto, Antioxidant properties
of tripeptides revealed by a comparison of six different assays, Food Science and Technology Research, 21
(2015) 695-704.
[26] S.T. Steinborner, The observation of evolutionary trends in amphibians and the analysis of negative ion
fragmentations in large peptide systems by mass spectrometry, Department of Chemistry, The University of
Adelaide, Adelaide, SA, 1997, 43-62.
[27] S.T. Steinborner, P.A. Wabnitz, R.J. Waugh, J.H. Bowie, C. Gao, M.J. Tyler, J.C. Wallace, The structures of
new peptides from the Australian red tree frog 'Litoria rubella'. The skin peptide profile as a probe for the
study of evolutionary trends of amphibians, Aust. J. Chem., 49 (1996) 955-963.
[28] R.J. Jackway, V.M. Maselli, I.F. Musgrave, M.J. Maclean, M.J. Tyler, J.H. Bowie, Skin peptides from anurans
of the Litoria rubella Group: sequence determination using electrospray mass spectrometry. Opioid activity
of two major peptides, Rapid Commun. Mass Spectrom., 23 (2009) 1189-1195.
[29] S.T. Ellis‐ Steinborner, D. Scanlon, I.F. Musgrave, T.N. Tran, S. Hack, T. Wang, A.D. Abell, M.J. Tyler, J.H.
Bowie, An unusual kynurenine‐ containing opioid tetrapeptide from the skin gland secretion of the
Australian red tree frog Litoria rubella. Sequence determination by electrospray mass spectrometry, Rapid
Communications in Mass Spectrometry, 25 (2011) 1735-1740.
[30] T.L. Pukala, J.H. Bowie, V.M. Maselli, I.F. Musgrave, M.J. Tyler, Host-defence peptides from the glandular
secretions of amphibians: structure and activity, Natural Product Reports, 23 (2006) 368-393.
[31] R.B. Merrifield, Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide, Journal of the American
Chemical Society, 85 (1963) 2149-2154.
[32] R. Behrendt, P. White, J. Offer, Advances in Fmoc solid‐ phase peptide synthesis, Journal of Peptide Science,
22 (2016) 4-27.
[33] J.M. Palomo, Solid-phase peptide synthesis: an overview focused on the preparation of biologically relevant
peptides, RSC Advances, 4 (2014) 32658-32672.
[34] M.S. Blois, Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature, 181 (1958) 1199.
[35] I.F. Benzie, J.J. Strain, The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the
FRAP assay, Analytical Biochemistry, 239 (1996) 70-76.
[36] S.B. Kedare, R. Singh, Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay, Journal of Food
Science and Technology, 48 (2011) 412-422.
[37] M. Tian, B. Fang, L. Jiang, H. Guo, J. Cui, F. Ren, Structure-activity relationship of a series of antioxidant
tripeptides derived from β-Lactoglobulin using QSAR modeling, Dairy Science & Technology, 95 (2015)
451-463.
[38] W. Liao, L. Gu, Y. Zheng, Z. Zhu, M. Zhao, M. Liang, J. Ren, Analysis of the quantitative structure–activity
relationship of glutathione-derived peptides based on different free radical scavenging systems,
MedChemComm, 7 (2016) 2083-2093.
Ngày nhận bài: 02/07/2019
Ngày chấp nhận đăng: 25/10/2019
© 2019 Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
Bạn đang xem tài liệu "Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng oxid hóa của các peptid Tryptophyllin L", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- tong_hop_va_khao_sat_hoat_tinh_khang_oxid_hoa_cua_cac_peptid.pdf