Tóm tắt Luận án Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-----------------------------------
NGUYỄN THỊ NHẬT LINH
NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM
NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ
ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH SINH LÝ HỌC THỰC VẬT
HUẾ - NĂM 2017
Công trình được hoàn thành tại:
VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Dương Tấn Nhựt
GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc
Phản biện 1: ...........................................................................................
...............................................................................................................
Phản biện 2: ..........................................................................................
...............................................................................................................
Phản biện 3: ..........................................................................................
...............................................................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế
họp tại: ..................................................................................................
...............................................................................................................
Vào hồi .........giờ..............ngày..............tháng.........năm............
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: ....................................................
...............................................................................................................
...............................................................................................................
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vietnamese ginseng, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.), một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, chứa rất nhiều dược
chất saponin hơn so với các loài sâm quý khác trên thế giới Ngoài
26 hợp chất tương tự sâm Mỹ và sâm Triều Tiên, trong sâm Ngọc
Linh còn phát hiện được hơn 20 loại saponin khác. Những saponin
quý này có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa
huyết áp, chống oxy hóa, điều trị các bệnh ung thư, gan, thận và
tiểu đường,... Tuy nhiên, loài sâm quý và có giá trị kinh tế cao này
đang nằm trong danh mục sách đỏ cần được bảo tồn. Hơn nữa, để
sử dụng các hợp chất từ sâm Ngọc Linh vào sản xuất dược phẩm
vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn do thiếu nguồn nguyên liệu.
Nuôi cấy rễ sâm in vitro có tiềm năng thu sinh khối lớn trong
thời gian ngắn. Rễ sâm Ngọc Linh in vitro tăng trưởng tốt khi có
được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Tuy nhiên, ngoài
việc gia tăng sinh khối rễ, sự tích lũy các dược chất saponin cũng
đóng vai trò hết sức quan trọng. Sinh khối rễ sâm Ngọc Linh lớn có
thể làm nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng, thậm chí để
sản xuất thuốc, nếu có hàm lượng saponin cao. Nhưng thực tế, rế
sâm in vitro có hàm lượng saponin thấp hơn rất nhiều so với rễ thu
ngoài tự nhiên. Với lợi ích to lớn của các elicitor trong việc tăng
cường tích lũy saponin trong nuôi cấy mô sẹo sâm Ngọc Linh, các
nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc
Linh là rất cần thiết. Chính vì thế, Đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy rễ
thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và
khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin.”
đã được thực hiện để không những cải thiện sự hình thành rễ thứ
cấp (RTC) từ nuôi cấy rễ bất định (RBĐ) in vitro khi tối ưu môi
2
trường và điều kiện nuôi cấy, còn tăng cường được hàm lượng 3
saponin (MR2, Rb1 và Rg1) trong sâm Ngọc Linh nhờ tác dụng của
các elicitor.
Mục tiêu của luận án
Xác định được điều kiện nuôi cấy và môi trường thích hợp để
RBĐ của sâm Ngọc Linh phát triển và hình thành nhiều RTC, từ đó,
có được nguồn sinh khối lớn và ổn định để nhân nhanh sinh khối rễ
sâm Ngọc Linh trong các hệ thống lớn như Bioreactor.
Xác đinh được các loại, nồng độ của các elicitor khác nhau lên
quá trình sản xuất ba saponin (MR2, Rg1 và Rb1) quan trọng có
trong RTC sâm Ngọc Linh in vitro thông qua 5 loại elicitor (SA, JA,
ABA, CHN và YE) hiện có tại phòng thí nghiệm. Sau đó, tiến hành
kết hợp các elicitor có nguồn gốc khác nhau để nâng cao hiệu quả
sản xuất saponin, đồng thời tìm được thời điểm thích hợp để bổ sung
các elicitor này vào nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro.
Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này cung cấp các dẫn liệu khoa học
mới có giá trị về nghiên cứu phát sinh hình thái rễ, nhân nhanh sinh
khối và tăng cường tích lũy các hợp chất saponin trong các nuôi cấy
RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro. Đồng thời, đây là tài liệu tham
khảo hữu ích cho việc nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực chuyển
hóa thứ cấp, sinh lý thực vật và nuôi cấy mô thực vật.
Ý nghĩa thực tiễn: Luận án thiết lập được môi trường nuôi cấy, điều
kiện nuôi cấy và hệ thống nuôi cấy tối ưu cho RBĐ sâm Ngọc Linh
tăng sinh và tạo nhiều RTC trong thời gian ngắn nhất. Đồng thời,
nâng cao hàm lượng các saponin nội sinh (MR2, Rg1 và Rb1). Kết
quả này có thể ứng dụng vào sản xuất sâm Ngọc Linh trên quy mô
lớn nhằm giải quyết vấn đề khan hiếm nguồn nguyên liệu.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH
Cây sâm Ngọc Linh là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam,
chỉ có trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam.
Hiện nay, sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến bởi những hợp
chất saponin của loài sâm này vượt trội so với một số loài sâm nổi
tiếng khác như sâm Triều Tiên và sâm Mỹ.
1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển
1.2. Đặc điểm hình thái và sinh trưởng
1.3. Đặc điểm phân bố
1.4. Đặc điểm đa dạng di truyền
1.5. Tác dụng dược lý
2. HỢP CHẤT SAPONIN CỦA SÂM NGỌC LINH
Saponin hay saponoside là một hợp chất glycoside tự nhiên
có hoạt tính bề mặt. Đây là một nhóm đa dạng của terpenoid được
đặc trưng bởi các cấu trúc khác nhau. Saponin được cấu tạo từ một
aglycon steroid hoặc triterpenoid với một hoặc nhiều chuỗi đường.
Những kết quả nghiên cứu phân lập thành phần hóa học mới nhất
được công bố cho thấy các hợp chất saponin của sâm Ngọc Linh có
trên 60 loại, mà nhóm chất quan trọng nhất của loài sâm này là các
triterpene saponin với các đại diện chính là MR2, Rb1 và Rg1 nằm
trong nhóm dammaran. Triterpene saponin có cấu trúc phức tạp nên
tổng hợp hóa học không có khả năng cạnh tranh kinh tế khi sản
xuất trên quy mô lớn mà nguồn sâm lại vô cùng hiếm.
3. NUÔI CẤY TẠO RỄ THỨ CẤP TỪ RỄ BẤT ĐỊNH
Rễ bất định (RBĐ) là những rễ có nguồn gốc nội sinh, phát sinh
từ nhiều cơ quan khác nhau của thực vật (như lá, hoa, cuống lá) do
4
sự phản biệt hóa của tế bào nhu mô nằm xung quanh hệ thống mô
mạch dưới tác động của auxin.
Rễ thứ cấp (RTC) được hình thành từ các vùng ngoại vi của trụ
bì trưởng thành ở những khoảng cách khác nhau từ các mô phân sinh
đỉnh của rễ. Sơ khởi RTC phát triển thông qua một chương trình
phân chia tế bào rất đặc trưng để tạo ra một cấu trúc y như khuôn
mẫu của rễ chính.
Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ thứ cấp và rễ bất định:
Loại mẫu cấy, vị trí phát sinh, vai trò điều hòa của auxin, tương tác
giữa auxin và cytokinin, nhiệt độ, ánh sáng, giá thể nuôi cấy.
Các nghiên cưu trong và ngoài nước vể nuôi cấy rễ
4. ELICITOR VÀ SỰ KÍCH KHÁNG
Elicitor (elicitor thực vật) có thể được định nghĩa như là một chất
cơ bản mà khi đưa với các nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì
khởi động quá trình phòng vệ ở thực vật, dẫn đến sinh tổng hợp các
hợp chất thứ cấp. Kích kháng là việc gây kích thích hay tăng cường
quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp do sự hiện diện của các
elicitor trong môi trường nuôi cấy. Elicitor có thể được phân loại dựa
vào bản chất hoặc dựa trên nguồn gốc.
Cho đến nay, các nghiên cứu ứng dụng elicitor vào nuôi cấy in
vitro sâm Ngọc Linh nhằm nâng cao hàm lượng các saponin còn rất
hạn chế. Dương Tấn Nhựt và cs (2012) bước đầu nghiên cứu đánh
giá tác động của MeJA lên việc tích lũy saponin của mô sẹo sâm
Ngọc Linh đã cho thấy hiệu quả của các elicitor trong việc tăng
cường các saponin lên đáng kể. Trịnh Thị Hương (2017) cũng đã
bước đầu nghiên cứu tác động của MeJA, SA và ABA nhằm tăng
cường các hợp chất saponin trong nuôi cấy rễ tơ sâm Ngọc Linh.
5
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Nguồn mẫu
Mẫu rễ bất định (RBĐ) 30 ngày tuổi được tách ra từ các cụm
RBĐ nuôi cấy trên môi trường SH bổ sung 5 mg/L IBA hiện có tại
Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Viện Nghiên
cứu Khoa học Tây Nguyên.
2. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.1. Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC từ nuôi cấy
rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro
2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình
thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp giữa auxin và cytokinin
lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
+
-
2.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NH4 /NO3 trong môi trường MS
lên sự hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường carbohydrate lên sự
hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và
tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.2. Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh để tăng
cường sự hình thành RTC và tích lũy saponin trong nuôi cấy in vitro
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng sinh và
6
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự tăng sinh và
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự
tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên sự tăng trưởng
của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tăng sinh và
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3. Tối ưu khả năng tích lũy saponin của RTC hình thành từ rễ bất
định sâm Ngọc Linh nhờ tác động của các elicitor
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh
và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của elicitor ngoại sinh và elicitor
nội sinh lên sự tăng sinh và tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
in vitro
2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor lên sự tăng
sinh và tích lũy saponin của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ
7
bất định in vitro
2.4. Phương pháp xác định chỉ số tăng trưởng, tỷ lệ chất khô, tỷ lệ
hình thành và tăng sinh của mẫu cấy
2.5. Môi trường nuôi cấy
Môi trường dinh dưỡng khoáng MS, SH và B5 có bổ sung 30 g/L
đường sucrose, 8 g/L agar, pH = 5,8 và thay đổi tùy vào từng thí
nghiệm.
2.6. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25±2C (trừ thí nghiệm
khảo sát nhiệt độ nuôi cấy), độ ẩm trung bình 50-60%, tất cả các thí
nghiệm đều đặt trong điều kiện tối hoàn toàn (trừ thí nghiệm khảo sát
về thời gian chiếu sáng), các thí nghiệm ngoài sáng được để dưới ánh
sáng đèn huỳnh quang có cường độ chiếu sáng khoảng 40-45
µmol.m-2.s-1 với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày. Nuôi cấy lỏng trên
máy lắc Innova 2100 plantform shaker (Hermle, Đức) với tốc độ 100
vòng/phút.
3. PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH
LƯỢNG SAPONIN
3.1. Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng
3.2. Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.3. Phương pháp xác định năng suất tổng hợp saponin
4. PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TẾ BÀO HỌC
5. PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
8
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. TỐI ƯU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH TỪ
NHỮNG MẪU RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO
1.1. Tối ưu cách chọn mẫu và môi trường nuôi cấy RTC sâm
Ngọc Linh
1.1.1. Ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn RBĐ (RBĐ) lên sự
hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh in vitro thể hiện
ở Bảng 3.1, cho thấy nguồn RBĐ từ mẫu cuống lá, kích thước 2 cm,
không tách hết mẫu cấy là thích hợp nhất cho RTC sâm Ngọc Linh
in vitro hình thành và tăng trưởng.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của cách cắt mẫu RBĐ lên khả năng hình
thành và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ tạo
RTC
(%)
Chiều dài
RTC
(cm)
Mẫu
RBĐ
KT
(cm)
Số
RTC
KLT
(mg)
TM
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
31,67e*
46,67d
82,33b
93,33a
46,00d
53,67cd
79,00b
94,33a
48,33d
60,00c
75,00b
83,33b
0,33h
2,00efg
2,33ef
7,33c
0,37f
29,33g
39,67f
65,00c
73,00b
30,33g
49,67e
57,67d
78,00a
42,33f
51,00e
56,33d
71,33b
C1
C2
C1
C2
C1
C2
0,83f
Từ
Lá
2,00e
3,33bc
1,67e
5,23a
3,13cd
5,60a
0,67f
1,33fgh
10,00b
3,00e
Từ
cuống
lá
13,67a
0,67gh
6,00d
4,03b
2,33de
5,00a
Từ
thân củ
8,33c
13,33a
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, TM: Cách cắt mẫu, C1: mẫu được
cắt ngang RBĐ để bỏ phần mẫu tái sinh, C2: mẫu cắt trên phần mẫu tái sinh, KT:
Chiều dài mẫu cắt.
9
1.1.2. Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng trưởng của
RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của auxin lên khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Auxin
(mg/L)
Tỷ lệ tạo
RTC (%)
0,00f*
Số
Chiều dài
RTC (cm)
0,00f
KLT
KLK
RTC
(mg)
(mg)
0
3
5
7
9
3
5
7
9
3
5
7
9
0,00i
23,33h
40,2g
1,33i
60,00e
78,33c
59,33e
63,33de
78,33c
93,67ab
96,33ab
98,67a
66,67d
90,00b
91,67b
90,00b
7,67f
0,83e
2,70h
4,00fg
5,70d
5,00de
5,67d
11,00b
15,27a
11,63b
1,33i
13,67c
15,67a
7,33f
1,83d
47,67f
62,67d
65,00d
54,67e
115,33c
158,33a
140,33b
32,00g
48,33f
56,33e
66,67d
NAA
3,13c
4,67b
9,00e
1,77d
16,00a
17,67a
14,67b
5,33h
6,33g
12,33d
12,67d
5,17b
IBA
IAA
6,00a
4,60b
1,03e
1,83d
3,17gh
4,67ef
6,83c
3,33c
3,56c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.1.3. Ảnh hưởng của việc kết hợp auxin với cytokinin lên sự hình
thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của IBA kết hợp với cytokinin lên sự hình
thành và tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
IBA
(mg/L)
Cytokinin
(mg/L)
Tỷ lệ tạo
RTC
Số
Chiều dài
RTC (cm)
5,25a
KLK
(mg)
KLT (mg)
RTC
13,75a
5,75c
0
0,1
94,53a*
81,53b
68,75cd
47,50f
155,00de
85,50g
14,25de
6,50hi
0,95de
0,75ef
0,5
1,0
4,00de
2,75ef
1,50fg
10,25b
12,50a
4,75cd
1,75fg
4,00de
2,75ef
1,50fg
0,75g
121,00f
229,00b
70,25g
13,75def
17,00bc
5,98hi
Kin
0,45fgh
0,20gh
1,95b
2,0
0,1
25,00g
85,00ab
92,50a
77,50bc
56,25ef
82,75ab
65,00de
30,00g
10,00h
125,25f
260,25a
132,25ef
164,25cd
117,50f
233,00ab
187,25c
60,00g
7,75h
7,0
0,5
2,23b
21,50a
12,25efg
11,78fg
10,23g
15,25cd
18,50b
5,00i
BA
1,0
1,25cd
0,70ef
2,0
0,01
1,50c
0,05
0,1
0,85def
0,65efg
0,13h
TDZ
0,2
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan.
10
1.1.4. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành và
tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau lên sự hình
thành và phát triển RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Tỷ lệ
Chiều
Môi
trường
tạo
RTC
(%)
Số
RTC
dài
RTC
(cm)
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Đặc điểm rễ
RTC màu trắng trong
và mảnh, rễ chính
màu trắng và mảnh
RTC mập, màu
trắng đục và rễ
chính màu vàng,
dày
RTC màu vàng và
mảnh, rễ chính hóa
nâu, phồng dày lên
SH
MS
B5
78,70b* 16,50b 3,63b 206,75c 20,75b
92,50a 18,26a 4,50a 346,25a 31,25a
82,50ab 14,00c 1,35c 312,25b 21,75b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong Duncan’s test. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô, RTC: Rễ thứ cấp.
+
-
1.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4 /NO3 trong môi trường MS lên sự
hình thành và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
+
-
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH4 /NO3 lên sự hình thành và tăng
trưởng RTC của RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Chiều
Số
KLT
(mg)
KLK
(mg)
+
-
NH4 /NO3
dài RTC
(cm)
RTC
15,22c*
19,33a
16,83b
13,00d
4,00f
4,33bc
6,57a
323,67b
396,00a
281,00b
219,67c
63,33d
24,33b
26,67a
22,83c
21,50d
5,67f
0/2
1/2
1/1
3/2
2/0
2/2
2/3
3,50cd
2,67d
2,87d
15,67bc
11,00e
2,60d
316,67b
99,67d
24,67b
9,27e
4,67b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
11
Số rễ/mẫu
Chiều dài rễ (cm)
25
20
15
10
5
400
300
200
100
0
a
a
a
b
bc
b
c
b
c
d
c
e
f
d
a
a
b
c
c
d
e
0
1/2 MS 1/2 SH 3/4 MS 3/4 SH MS MSCB SH
Môi trường nuôi cấy
Biểu đồ 3.1. So sánh giữa môi trường cải biên có tỷ lệ NH4 /NO3 tốt
+
-
nhất so với các môi trường nuôi cấy khác.
Các chữ cái khác nhau (a, b, c...) trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p
≤ 0,05 trong phép thử Duncan.
1.1.6. Ảnh hưởng các loại đường carbohydrate lên sự hình thành
và tăng trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.6. Ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên sự hình thành và
tăng trưởng RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ
Loại đường
KLT
(mg)
KLK
(mg)
chất
khô
Đặc điểm rễ
(g/L)
(%)
0
51,67e*
160,33d
206,67d
379,33c
577,67b
523,00b
374,33c
641,33a
572,33b
533,33b
526,67b
91,67e
3,33hi
15,00gh
18,33g
41,57e
51,93bcd
67,40a
29,33f
55,33bc
56,00b
47,83cde
46,33de
9,00hi
15,33gh
17,33f
7,67hi
6,42d
trong, nhũn, không phát triển
trắng, dài, phân nhánh ít
10
30
40
50
60
10
30
40
50
60
10
30
40
50
60
9,82bc
8,89bcd
10,96ab
8,99bcd
13,03a
8,85bcd
8,64bcd
9,79ab
9,16bcd
7,80cd
8,22bcd
9,54bc
9,76bc
7,37cd
6,94cd
trắng, rất dài, phân nhánh ít
trắng, rất dài, mập, ít nhánh
trắng, rất dài, mập, nhiều nhánh
trắng, rất dài, mập, nhiều nhánh
trắng đục, tròn đều, mập, ít nhánh
dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh
dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh
dài, trắng đục, mập, nhiều nhánh
dài, hơi vàng, mập, nhiều nhánh
vàng, ít phân nhánh và kéo dài
vàng, ít phân nhánh
D-
Glucose
Sucrose
Maltose
182,67d
181,67d
102,73e
62,53e
vàng, ít phân nhánh
vàng, mọng nước, ít phân nhánh
vàng, không phân nhánh
4,33hi
*Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong
phép thử Duncan.
12
1.1.7. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự hình thành và tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên khả năng hình thành
và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ
Số lượng
rễ
(rễ/mẫu)
48,45a*
13,83b
8,80c
Chiều
dài rễ
(cm)
2,70a
0,94b
0,68b
tạo
RTC
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Giá thể
(%)
Agar
Gelrite
Bông gòn
100,00a
100,00a
121,40a
121,03a
77,20b
12,47a
13,23a
8,27b
93,34b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.2. Tối ưu điều kiện nuôi cấy RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc
Linh in vitro
1.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng trưởng của
RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
277,7a
300
250
200
150
100
50
R² = 0.9508
230b
203,3b
148,7c
88d
28,3d
58a
56,3ab
54,3b
38c
27,8a
17,7b
16,3b
13,3c
11e
14
5,3d
e
0e
0,63
0
28
42
56
70
84
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Khối lượng khô (mg)
Khối lượng tươi (mg)
Hướng phát triển của rễ thứ cấp
Số lượng rễ thứ cấp/mẫu
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC từ nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro.
13
1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của RTC sâm
Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tăng trưởng của
RTC từ RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Nhiệt độ Tỷ lệ tạo RTC
Số RTC Chiều dài rễ
KLT
KLK
(mg)
8,33a
6,67b
4,33c
(°C)
22
(%)
100a*
100a
100a
(rễ/mẫu)
(cm)
1,00a
0,73b
0,50c
(mg)
41,67a
127,33a
102,00b
62,00c
23,67b
25
18,00c
28
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.2.3. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng của RTC
sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH đến khả năng hình thành và tăng
trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ tạo
RTC
(%)
Chiều dài
RTC
KLT
(mg)
KLK
(mg)
pH
Số RTC
(cm)
4,3
4,8
5,3
5,8
6,3
100a*
100a
18,67c
36,67b
56,00a
30,00bc
21,33c
0,80c
91,67bc
169,67b
210,67a
116,33b
77,33c
9,67c
16,33b
20,67a
11,33c
8,00c
1,07b
100a
1,37a
100a
1,00bc
1,00bc
100a
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
1.2.4. Ảnh hưởng của giai đoạn nuôi cấy tối và sáng lên sự tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các điều kiện chiếu sáng lên sự hình
thành và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Thời điểm
chiếu sáng
100%Tối
80% Tối
50% Tối
100% Sáng
Tỷ lệ tạo
RTC (%)
94,00a*
94,67a
Số
Chiều dài
RTC (cm)
5,66a
KLT (mg)
KLK (mg)
RTC
18,67a
19,00a
8,67b
1,00c
365,33a
369,00a
188,67b
24,67c
26,67b
34,33a
13,67c
1,67d
5,00a
64,67b
2,83b
12,33c
0,83c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. 80% tối ở thời gian đầu nuôi cấy; 100% tối là thời gian nuôi cấy hoàn toàn trong
tối; 50% tối là nửa thời gian đầu nuôi cấy trong tối hoàn toàn; 100% sáng là nuôi cấy ngoài
sáng với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày.
14
1.2.5. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên khả
năng hình thành và tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ
tạo rễ
(%)
Chiều
dài rễ
(cm)
2,12b
3,18a
2,84a
2,38b
1,32c
Thể tích
(mL)
Số lượng rễ
(rễ/mẫu)
KLT
(mg)
KLK
(mg)
93,34b
100a
8,2d*
70,60a
38,80b
14,40c
12,60c
117,20c 12,80c
455,60a 45,60a
176,40b 18,20b
134,00c 13,40c
114,00c 12,00c
10
30
50
70
90
100a
100a
93,34b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý
nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi,
KLK: Khối lượng khô.
1.2.6. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự hình thành và tăng
trưởng của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy đến sự hình thành và
tăng trưởng RTC sâm Ngọc Linh in vitro
Tỷ lệ
KLT KLK
Tỷ lệ chất
khô (%)
Hệ thống nuôi cấy 3 L
tăng sinh
(lần)
(g)
(g)
Bioreactor tự tạo
Bình tam giác kết hợp
lắc
72,82a* 6,74a
30,54c 2,65c
51,30b 4,63b
9,71a
9,25a
8,68b
9,03ab
4,07c
6,84b
Bioreactor hình cầu
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý
nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi,
KLK: Khối lượng khô.
15
2. TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY SAPONIN CỦA RỄ THỨ CẤP
SÂM NGỌC LINH
2.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
2.1.1. Ảnh hưởng của các giai đoạn nuôi cấy lên sự tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tích lũy
saponin từ RTC của nuôi cấy RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Hàm lượng saponin (‰)*
Thời gian
(ngày)
NS
(mg/L)
Tổng (Rg1+
Rb1+ MR2)
0,00
Rg1 Rb1 MR2
0,00 0,00 0,00
0,05 0,02 0,74
0,06 0,03 1,05
0,05 0,01 2,41
0,06 0,02 3,13
0,08 0,02 3,26
0,00
0,14
0,51
2,29
1,89
1,83
14
28
42
56
70
84
0,81
1,14
2,47
3,21
3,36
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khô; NS: năng suất
tổng hợp cả 3 saponin trên toàn bộ sinh khối khô thu được.
2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tích lũy saponin của RTC
sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tích lũy saponin
của RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
Hàm lượng saponin (‰)*
Nhiệt
NS
độ (°C)
(mg)
Rg1 Rb1 MR2
Tổng 3 saponin
22
25
28
0,06c 0,76a 0,64a
0,07b 0,73b 0,35b
0,07b 0,62c 0,39b
1,40a
1,12b
1,08c
0,40a
0,23b
0,17c
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khô; NS: Năng suất
tổng hợp cả ba saponin trên toàn bộ sinh khối khô thu được.
16
2.1.3.Ảnh hưởng của pH lên sự tích lũy saponin của RTC sâm
Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tích lũy saponin ở RTC
sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
Hàm lượng saponin (‰)*
NS
pH
(mg)
0,42c
0,81b
1,16a
0,95ab
0,45c
Rg1
Rb1 MR2 Tổng 3 saponin
4,3
4,8
5,3
5,8
6,3
0,03c 0,01b 1,25c
0,03c 0,01b 1,45c
0,04b 0,02ab 1,62b
0,04b 0,02a 2,45a
0,06a 0,02b 1,61b
1,29c
1,49c
1,68b
2,51a
1,67b
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khô; NS: Năng suất
tổng hợp cả ba saponin trên toàn bộ sinh khối khô thu được.
2.1.4. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên sự tích lũy saponin
của RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy đến khả năng tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy RBĐ in vitro
Hàm lượng saponin (‰)*
Hệ thống nuôi cấy 3
NS
Tổng
3 saponin
4,15b
L
(mg)
Rg1
Rb1 MR2
Bioreactor tự tạo
Bình tam giác kết
hợp lắc
0,12c 1,03c 3,00b
0,35a 1,90a 1,15c
0,93b
0,30c
1,31a
3,40b
Bioreactor hình cầu 0,25ab 1,41ab 6,86a
8,52a
*Trung bình 3 lần chạy mẫu tính trên 1 g chất khô; NS: năng suất
tổng hợp cả ba saponin trên toàn bộ sinh khối khô thu được.
17
2.2. Ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ RBĐ in vitro
2.2.1. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy saponin
của RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ mẫu RBĐ in vitro
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
CHN
(mg/L)
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Tổng 3
saponin
0,88d
Rg1
Rb1
MR2
0,339d 0,144d 0,395c
0
50
100
150
200
456,90a* 41,85a
271,82c 26,93c 0,260e
159,93e 15,85e 1,632a 0,142d 0,251d
202,87d 20,32d 0,676b 0,328b
298,33b 29,50b 0,368c 0,231c 0,415b
0,164e
0,433a
0,89d
0,466a
2,03a
1,43b
1,02c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05
trong phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
2.2.2. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và tích
lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm men lên sự tăng sinh và
tích lũy saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ RBĐ in vitro
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
YE
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Tổng 3
saponin
0,88d
1,48b
1,42b
3,51a
1,67c
(mg/L)
Rg1
Rb1
MR2
0
456,90c* 41,85c 0,339c 0,144c 0,395d
510,83a 51,25a 0,502b 0,251a 0,679c
473,30b 47,25b 0,534b 0,200b 0,743b
250,03d 25,03d 2,482a 0,244a 0,786b
154,60e 15,39e 0,544b 0,256a 0,842a
50
100
150
200
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý
nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.
18
2.2.3. Ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của abscisic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh từ mẫu RBĐ in vitro
ABA
(µg/L)
0
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
Rg1
Rb1
MR2
0,395d
1,058b
0,973c
1,651a
1,637a
Tổng 3 saponin
456,9a* 41,85a 0,339d
156,33b 16,67b 0,703c
107,17c 10,59c 1,234b
0,144d
0,88e
50
0,198c
0,204c
0,219b
0,277a
1,96d
100
150
200
2,41c
82,47d
8,25d 1,506a
3,37a
76,30d
7,58d
0,731c
2,65b
**Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong
phép thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
2.2.4. Ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của salicylic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC từ mẫu RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
SA
(µg/L)
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Tổng 3
saponin
0,88d
Rg1
Rb1
MR2
0
50
100
150
200
456,9a*
433,07b
200,03c
84,23d
41,85a
43,52a
19,8b
8,18c
0,339d
0,675a
0,455c
0,503b
0,439c
0,144d
0,248b
0,385a
0,176c
0,356b
0,395c
0,867a
0,599b
0,576b
0,398c
1,79a
1,44b
1,25c
67,37d
6,79c
1,19c
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
2.2.5. Ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC sâm Ngọc Linh
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của jasmonic acid lên sự tăng sinh và tích lũy
saponin của RTC từ mẫu RBĐ sâm Ngọc Linh in vitro
JA
(µg/L)
0
KLT
(mg)
KLK
(mg)
Hàm lượng (% trên 1 g RTC khô)
Rg1
Rb1
MR2
0,395e
1,855c
1,302d
2,464b
2,826a
Tổng saponin
456,90a* 41,85a 0,339e
0,144e
0,849a
0,718b
0,582c
0,401d
0,88d
50
166,24b
125,56c
81,56d
75,56d
15,89b 2,227c
4,93c
100
150
200
12,76c 3,219a
5,24b
8,59d
2,524b
5,57a
7,59d
1,975d
5,21b
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 trong phép
thử Duncan. KLT: Khối lượng tươi, KLK: Khối lượng khô.
Tải về để xem bản đầy đủ
27 trang
12780
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Tóm tắt Luận án Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- tom_tat_luan_an_nghien_cuu_nuoi_cay_re_thu_cap_sam_ngoc_linh.pdf
