Phân tích hàm lượng Phyllanthin, Hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS)

TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 13, Số 2 (2018)

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG PHYLLANTHIN, HYPOPHYLLANTHIN

TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus urinaria L.) BẰNG SẮC KÝ LỎNG

GHÉP NỐI KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

1

2

3

Đoàn Mạnh Dũng , Nguyễn Hữu Tùng , Nguyễn Đình Luyện

1

Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

2

Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia H| Nội

3

Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế

Email: doanmanhdung151090@gmail.com

Ngày nhận bài: 25/10/2018; ngày hoàn thành phản biện: 7/12/2018; ngày duyệt đăng: 10/12/2018

TÓM TẮT

Bằng c{c phương ph{p sắc ký, chúng tôi ph}n lập được hợp chất phyllanthin v|

hypophyllanthin từ c}y Diệp hạ ch}u (Phyllanthus urinaria L.). Cấu trúc của hợp

1

13

chất n|y được x{c định bằng c{c phương ph{p phổ H-NMR, C-NMR và ESI-MS).

Hợp chất n|y được tinh sạch (độ tinh khiết > 99,8%) bằng hệ thống sắc ký lỏng

điều chế, được sử dụng để l|m chất chuẩn ph}n tích h|m lượng phyllanthin v|

hypophyllanthin trong c}y Diệp hạ ch}u bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-

MS/MS). Chúng tôi x}y dựng được chương trình sắc ký sử dụng hệ thống LC-

MS/MS như sau: pha tĩnh cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm), pha động:

MeOH (A) – hỗn hợp dung dịch chứa 10 mM ammonium acetate và 0,1% HCOOH

(B) theo tỉ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dòng: 0,3 ml/phút thể tích tiêm mẫu: 1 μl; nhiệt độ

o

buồng cột: 35 C; thời gian ph}n tích 10 phút, dung môi pha mẫu: MeOH-H2O =

60:40 (v/v). Điều kiện khối phổ bao gồm nguồn ion hóa ESI, loại ion dương, nhiệt

o

độ nguồn ion hóa l| 300 C, chế độ chạy MRM trong đó phyllanthin với ion sơ cấp

m/z 436,0 v| ion thứ cấp m/z 151,0, hypophyllanthin với ion sơ cấp m/z 261,0 v|

ion thứ cấp m/z 231,0. Phương ph{p ph}n tích chúng tôi sử dụng tối ưu hóa cho

qu{ trình ph}n tích 2 hợp chất hypophyllanthin v| phyllanthin trong c}y Diệp hạ

ch}u với độ tuyến tính, độ đúng v| độ chính x{c cao.

Từ khóa: Phyllanthus urinaria, phyllanthin, hypophyllanthin, LC-MS/MS.

1. MỞ ĐẦU

Diệp hạ ch}u thuộc chi Phyllanthus rất phổ biến ở Việt Nam với số lượng

phong phú. Cho đến nay người ta đã ph{t hiện chi Phyllanthus L. (Euphorbiaceae) có

13

Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) <

700 lo|i, gồm từ những c}y th}n thảo đến c}y th}n bụi hay gỗ nhỏ, ph}n bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới v| cận nhiệt đới *1-3+. Th|nh phần hóa học v| t{c dụng của chi n|y rất

phong phú v| đa dạng, l| nguồn dược liệu đầy tiềm năng. C{c nghiên cứu cho thấy

chất phyllanthin v| hypophyllanthin l| những th|nh phần chính của c}y Phyllanthus

urinaria L. *1+, *4+. C{c chất n|y có t{c dụng l|m gia tăng lượng glutathione có vai trò

bảo vệ v| phục hồi tế b|o gan, l|m giảm men gan do ức chế men ADN polymerase của

virus viêm gan B *4+. Vì vậy, Diệp hạ ch}u có t{c dụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm

gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc men gan do uống rượu, bia ... Chính

vì vậy nghiên cứu x{c định h|m lượng của hypophyllanthin v| phyllanthin trong c}y

Diệp hạ ch}u có ý nghĩa quan trọng trong việc x{c định chất lượng dược liệu Diệp hạ

ch}u v| c{c chế phẩm thuốc từ Diệp hạ ch}u.

2. THỰC NGHIỆM

2.1. Thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS Agilent Technologies 6420

Triple Quad, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) Agilent 1290, cột sắc ký

EC-C18 (100 × 2,1 mm, 2,7 μm), hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification

System), cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x 21,2 mm, 5,0 μm), m{y đo điểm nóng chảy

Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản). Phổ cộng hưởng từ hạt nh}n được đo trên m{y JEOL

ECX 400 (Jeol, Nhật Bản), cột sắc ký c{c loại, c}n ph}n tích OHAUS PA214 độ chính x{c

0,0001g, bể siêu }m, m{y ly t}m Vortex, m|ng lọc 13 mm, 0,22 μm (PTFE).

2.2. Hóa chất

C{c dung môi dùng trong chiết xuất, ph}n lập như methanol (MeOH),

chloroform (CHCl ), ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công

3

nghiệp v| được chưng cất lại trước khi dùng. Dung môi dùng cho ph}n tích methanol

(Merck, Đức), acetonitrile (Merck, Đức), nước cất, acid formic (Merck). Sắc ký cột (CC)

sử dụng silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh và 20-400 mesh, Merck), Sắc ký lớp mỏng

(TLC) sử dụng bản mỏng nhôm tr{ng sẵn silica gel 60 F254 (1,05554; Merck). Ph{t hiện

chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm v| 365 nm hoặc dùng thuốc thử hơi I .

2

2.3. Nguyên liệu thực vật

Diệp hạ ch}u (Phyllanthus urinaria L.) được thu h{i ở Nghệ An, Việt Nam v|o

th{ng 10 năm 2017. C{c mẫu n|y được TS. Đỗ Ngọc Đ|i – Trường Đại học Kinh tế kĩ

thuật Nghệ An định danh tên khoa học v| tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa học C{c

hợp chất thiên nhiên, Viện H|n l}m Khoa học v| Công nghệ Việt Nam.

14

TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 13, Số 2 (2018)

2.4. Chiết xuất và phân lập

Phần trên mặt đất c}y Diệp hạ ch}u (2,0 kg), được phơi khô, xay nhỏ v| ng}m

0

chiết siêu }m với methanol ở 50 C trong 3 giờ (lặp lại 3 lần). Dịch chiết được cất thu hồi

dung môi thu được cao methanol (502 gam). Ph}n bố cao methanol trong nước, sau đó

chiết lỏng/lỏng lần lượt với cloroform v| n-butanol. Cất thu hồi dung môi thu được c{c

cặn dịch chiết lần lượt l| 255g v| 95g. Cao chloroform được ph}n t{ch bằng sắc ký cột

nhồi silicagel, dung môi rửa giải l| chloroform/methanol (99/1; 40/1; 30/1; 20/1) thu

được 10 ph}n đoạn chính. Ph}n đoạn 4 (12 g) tiến h|nh sắc ký cột nhồi silicagel,

chloroform:methanol (10:1) thu được chất hypophyllanthin 450 mg. Ph}n đoạn 5 (22,3

g) tiến h|nh sắc ký cột nhồi silicagel, chloroform:methanol (8:1) thu được phyllanthin

302 mg. Hai hợp chất n|y được tinh sạch (độ tinh khiết > 99,8%) bằng hệ thống sắc ký

lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System) pha tĩnh cột sắc ký ZORBAX SB-C18

(100 x 21,2 mm, 5,0 μm), pha động: MeOH–H

(v/v), tốc độ dòng 15,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 100,0 μL; dung môi pha mẫu:

MeOH-H O (70:30, v/v).

2O trong thời gian 5 phút với tỉ lệ 70:30

2

o

Hypophyllanthin: Tinh thể hình kim, m|u trắng, nhiệt độ nóng chảy 128-130 C; ESI-

+

1

MS m/z: 431 [M+H] (tương ứng với công thức ph}n tử C24

H

30

O7

); H-NMR (500 MHz,

CD OD): δ 6,45 (1H, s, H-2), 2,78 (2H, dd, 16,0, 4,5Hz, H-7), 2,61 (1H, dd, J = 15,5, 11,0, H-

3

7), 1,85 (1H, m, H-8), 3,18 (1H, dd, J = 9,5, 6,2, H-9), 3,27 (1H, dd, J = 9,5, 4,2, H-9), 6,63

(1H, d, J = 2,0, H-2’), 6,80 (1H, d, J = 8,0, H-5’), 6,65 (1H, dd, J = 8,5, 2,0, H-6’), 3,95 (1H, d,

J = 7,5, H-7’), 1,77 (1H, m, H-8’), 3,16 (1H, dd, J = 9,5, 3,5, H-9’), 3,29 (1H, dd, J = 9,5, 1,0,

H-9’), 3,78 (3H, s, 3-OCH

3

), 3,25 (3H, s, 9-OCH

), 3,21 (3H, s, 9’-OCH ), 5,69 (1H, d, J = 1,4, O-CH

O D): δ 131,7 (C-1), 106,7 (C-2), 141,7 (C-3), 132,8 (C-4), 146,5

3

), 3,67 (3H, s, 3’-OCH

3

), 3,70 (3H, s, 4’-

OCH

3

2-O), 5,71 (1H, d, J = 1,4, O-CH

2-

13

O); C-NMR (100 Hz, CD

3

(C-5), 114,5 (C-6), 32,7 (C-7), 36,6 (C-8), 74,7 (C-9), 137,9 (C-1’), 112,1 (C-2’), 148,3 (C-3’),

147,0 (C-4’), 111,6 (C-5’), 119,9 (C-6’), 41,1 (C-7’), 44,7 (C-8’), 71,6 (C-9’), 56,1 (3-OCH ),

3

58,3 (9-OCH

3), 55,4 (3’-OCH

3), 55,5 (4’- OCH

3), 58,4 (9’- OCH

3

), 100,6 (O-CH -O).

2

o

Phyllanthin: tinh thể hình kim m|u trắng; nhiệt độ nóng chảy 94-96 C; ESI-MS m/z 421

+

1

[M+H] (tương ứng với công thức ph}n tử C24

H36

O6

). H-NMR (500 MHz, CD

3

OD): δ

6,63 (1H, br s, H-2), 6,76 (1H, d, J = 8,0, H-5), 6,65 (1H, br d, J = 8,0, H-6), 2,64 (1H, m, H-

7), 2,05 (1H, m, H-8), 3,31 (1H, m, H-9), 6,63 (1H, br s, H-2’), 6,76 (1H, d, J = 8,0, H-5’),

6,65 (1H, br d, J = 8,0, H-6’), 2,64 (1H, m, H-7’), 2,05 (1H, m, H-8’), 3,31 (1H, m, H-9’), 3,82

(3H, s, 3-OCH

(3H, s, 4’-OCH

3

), 3,87 (3H, s, 4-OCH

), 3,31 (3H, s, 9’-OCH

3

), 3,31 (3H, s, 9-OCH

3

), 3,82 (3H, s, 3’-OCH

3

), 3,87

13

3

). C-NMR (100 Hz, CD

3OD): δ 133,7 (C-1), 112,3

(C-2), 148,8 (C-3), 147,3 (C-4), 111,2 (C-5), 121,3 (C-6), 34,7 (C-7), 40,9 (C-8), 72,7 (C-9),

133,7 (C-1’), 112,3 (C-2’), 148,8 (C-3’), 147,3 (C-4’), 111,2 (C-5’), 121,3 (C-6’), 34,7 (C-7’),

40,9 (C-8’), 72,7 (C-9’), 55,8 (3-OCH

OCH ), 58,9 (9’- OCH ).

3), 55,7 (C-4’), 58,9 (9-OCH

3

), 55,8 (3’-OCH ), 55,7 (4’-

3

15

Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) <

2.5. Điều kiện, các thông số tối ưu cho phân tích

Trên cơ sở ph}n tích t|i liệu tham khảo *5+, *7+ v| khảo s{t về th|nh phần pha

động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi x}y dựng được chương trình sắc ký sử

dụng hệ thống UPLC Agilent 1290 Infinity như sau: pha tĩnh cột sắc ký EC-C18 (100 x

2,1 mm, 2,7 μm), pha động: MeOH (A) – dung dịch chứa 10 mM ammonium acetate và

0,1% HCOOH (B) theo tỉ lệ 60:40 (v/v), tốc độ dòng: 0,3 ml/phút thể tích tiêm mẫu: 1 μl;

o

nhiệt độ buồng cột: 35 C; thời gian ph}n tích 10 phút, dung môi pha mẫu: MeOH-H

2O

= 60:40 (v/v). Điều kiện khối phổ bao gồm nguồn ion hóa ESI, loại ion dương, nhiệt độ

o

nguồn ion hóa l| 300 C, chế độ chạy MRM, phyllanthin với ion sơ cấp m/z 436,0 và ion

thứ cấp m/z 151,0, hypophyllanthin với ion sơ cấp m/z 261,0 v| ion thứ cấp m/z 231,0.

Hình 1. Sắc ký đồ của chuẩn hypophyllanthin v| phyllanthin

2.6. Chuẩn bị mẫu phân tích

C}n chính x{c một lượng c}y Diệp hạ ch}u sau khi đã được nghiền nhỏ (từ

0,03-0,04 g), thêm 20 ml dung dịch MeOH-H

ở 40 C trong 2 giờ, thu được dịch chiết (lặp lại 3 lần). Cô quay thu hồi dung môi dưới

2

O = 70:30 (v/v) rồi tiến h|nh chiết siêu }m

o

{p suất thấp thu được cao chiết sau đó được định mức bằng dung môi MeOH-H O -

2

60:40 (v/v) trong bình định mức 100 ml. Sau đó, lọc qua m|ng 0,22 μm, cuối cùng bơm

v|o hệ thống LC-MS/MS [6], [7].

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định cấu trúc

o

Hypophyllanthin: Tinh thể hình kim, m|u trắng, nhiệt độ nóng chảy 128-130 C. Phổ

+

khối lượng ESI của hợp chất 1 cho peak ion m/z 431 [M+H] tương ứng với công thức

1

ph}n tử C24

H

30O

7

. Dữ liệu phổ H-NMR cho thấy hợp chất có một nhóm metylen gắn

với hai oxygen (-OCH

2O-), ba nhóm metylen, 2 nhóm metin v| năm nhóm metoxyl.

16

TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 13, Số 2 (2018)

13

Phổ C-NMR, DEPT cho c{c tín hiệu tương ứng với 24 carbon bao gồm 5 nhóm –

OCH , 4 nhóm –CH2, 7 nhóm –CH, 8 nhóm carbon bậc bốn. Từ c{c số liệu kết hợp so

3

s{nh với t|i liệu tham khảo cho ta hợp chất đó l| hypophyllanthin. Hợp chất n|y đã

được ph}n lập từ c}y Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria *5+, có hoạt tính kh{ng

virut viêm gan B mạnh *1+, [5].

o

1

Phyllanthin: tinh thể hình kim m|u trắng, nhiệt độ nóng chảy 94-96 C. Phổ H-NMR

cho tín hiệu 17 proton của một nhóm metin, hai nhóm metylen và 3 nhóm metoxyl.

13

Phổ C-NMR, DEPT cho các tín hiệu tương ứng với 12 carbon bao gồm 3 nhóm –

OCH

3, 2 nhóm –CH

2, 4 nhóm –CH, còn lại là carbon bậc bốn. Nó l| một ligan gồm 2

mảnh giống nhau ghép lại v| công thức ph}n tử l| C24

H

34

O6

. So s{nh với t|i liệu tham

khảo ta khẳng định hợp chất n|y l| phyllanthin. Hợp chất n|y đã được phân lập từ cây

Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria [5], có hoạt tính kháng virut viêm gan B mạnh

[1], [5].

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Hình 2. Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất chính trong c}y Diệp hạ ch}u.

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích

a. Kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng phương ph{p tổng diện tích peak tính to{n độ tinh khiết của mẫu

ph}n tích. Tiến h|nh sắc ký theo chương trình trên, ph}n tích c{c peak phụ (tạp chất)

trên sắc ký đồ v| tính độ tinh khiết bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (UPLC-

DAD) Agilent 1290, pha tĩnh: cột sắc ký EC-C18 (100 x 2,1 mm, 2,7 μm), pha động:

MeOH (A) – dung dịch chứa 10 nM ammonium acetate v| 0,1% HCOOH (B) theo tỉ lệ

o

60:40 (v/v), tốc độ dòng: 0,3 ml/min; thể tích tiêm mẫu: 10 μl; nhiệt độ buồng cột: 30 C;

bước sóng ph{t hiện: 230 nm; thời gian ph}n tích 10 phút; dung môi pha mẫu:

MeOH:H O - 60:40 (v/v). Kết quả cho thấy phyllanthin v| hypophyllanthin tinh chế

2

được có độ tinh khiết cao (>99,8%) phù hợp l|m chất chuẩn ph}n tích, chất chuẩn đối

chiếu. C{c peak phụ (tạp chất) đều t{ch rõ r|ng khỏi peak chất ph}n tích.

b. Tính đặc hiệu

Tiến h|nh sắc ký c{c loại mẫu trắng v| mẫu ph}n tích hypophyllanthin v|

phyllanthin theo chương trình khảo s{t trên, ghi lại sắc ký đồ, x{c định thời gian lưu v|

phổ UV của peak hypophyllanthin v| phyllanthin trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy

trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian

17

Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) <

lưu tương ứng với thời gian lưu của hypophyllanthin (t

R

= 7,042 phút) và phyllanthin

(t = 8,088 phút (Hình 1). Vậy phương ph{p ph}n tích hypophyllanthin và phyllanthin

R

x}y dựng được có độ đặc hiệu cao.

c. Tính thích hợp của hệ thống

Tiến h|nh bơm 6 lần dung dịch chuẩn phyllanthin (nồng độ 10 ppm) v|

hypophyllanthin (nồng độ 15 ppm) ghi lại c{c sắc ký đồ v| x{c định gi{ trị thời gian

lưu, diện tích peak. Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của c{c thông số đều

thấp hơn 2 %. Điều đó cho thấy c{c điều kiện sắc ký đã lựa chọn v| hệ thống sắc ký

LC-MS/MS sử dụng l| ổn định, phù hợp cho phép ph}n tích định tính, định lượng

phyllanthin, hypophyllanthin trong mẫu cây Diệp hạ ch}u.

Bảng 1. Kết quả khảo s{t tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Hypophyllanthin

Phyllanthin

Diện tích

peak

Thí

nghiệm

Thời gian

lưu

Diện tích

peak

Hệ số đối

xứng

Thời gian

lưu

Hệ số đối

xứng

1

2

7,042

6,889

6,903

6,887

6,901

6,890

6,918

262,6327

263,1130

262,3435

261,9856

260,9899

264,1241

262,5315

0,98

1,01

1,02

1,01

0,98

0,99

8,088

7,997

300,7612

301,1024

300,5615

301,2019

302,0199

299,9845

300,9386

1,01

0,99

1,02

0,98

1,03

1,00

3

7,976

8,003

4

7,999

7,989

8,008

5

6

TB

RSD

(%)

0,5

0,8

0,3

1,8

0,19

1,64

d. Độ tuyến tính

Chuẩn bị c{c dung dịch chuẩn có nồng độ 0,05-30 μg/ml (ppm) bằng c{ch pha

loãng từ dung dịch chuẩn gốc ban đầu với c{c hệ số pha loãng kh{c nhau. Tiến h|nh

sắc ký c{c dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc ký đồ v| x{c định

diện tích peak tương ứng. X{c định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan

tuyến tính giữa nồng độ chất ph}n tích v| diện tích peak tương ứng trên sắc ký đồ

bằng phương ph{p bình phương tối thiểu. Kết quả phương trình hồi quy tuyến tính

thu được với hypophyllanthin v| phyllanthin có hệ số x{c định v| hệ số tương quan

rất cao, độ tuyến tính chặt, khoảng tuyến tính rộng.

18

TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 13, Số 2 (2018)

Hình 3. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của Phyllanthin

Hình 4. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của Hypophyllanthin

e. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn ph{t hiện: tiến h|nh pha loãng mẫu ph}n tích phyllanthin và

hypophyllanthin đến khi tín hiệu của chất ph}n tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ

S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3. Nồng độ x{c định được l| giới hạn ph{t

hiện (LOD) của phương ph{p ứng với từng chất. Giới hạn định lượng (LOQ) của

phương ph{p được x{c định dựa trên giới hạn ph{t hiện: LOQ = 3,3 x LOD. Kết quả

ph}n tích cho thấy phương ph{p có giới hạn ph{t hiện với phyllanthin và

hypophyllanthin lần lượt l| 0,10 ppb và 0,15 ppb, tương ứng có giới hạn định lượng

lần lượt l| 0,33 ppb và 0,50 ppb.

g. Độ đúng

Độ đúng của phương ph{p ph}n tích phyllanthin, hypophyllanthin được x{c

C₂C

Re v(%) 

¹100

định thông qua độ thu hồi (Recovery) theo công thức:

. Trong đó, C

0

C_o

l| nồng độ chất ph}n tích được thêm v|o trong mẫu thật; C

1

l| nồng độ chất ph}n tích

trong mẫu thật; C

2

l| nồng độ chất ph}n tích trong mẫu thật đã được thêm chuẩn. Độ

19

Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) <

thu hồi của phương ph{p cũng được x{c định bằng c{ch tiến h|nh xử lý lần lượt c{c

mẫu ph}n tích (lặp lại 3 lần) theo quy trình ở mục 2.6 rồi thêm một lượng x{c định chất

chuẩn sau đó tiến h|nh ph}n tích ba lần lặp lại, tính kết quả trung bình. Kết quả độ thu

hồi của phương ph{p được nêu ra ở Bảng 1, 2.

Bảng 2. Kết quả đ{nh gi{ độ đúng của phương ph{p x{c định phyllanthin trong mẫu nghiên

cứu

Mẫu

Nồng độ

phyllanthin trong

mẫu (mg)

Nồng độ

phyllanthin thêm

v|o mẫu (mg)

0,01

Nồng độ phyllanthin Độ thu hồi, %

sau khi thêm v|o mẫu

(Rev, %)

(mg)

0,0537

98,0

104,0

96,0

Lá

Thân

Rễ

0,0439

0,0050

0,0039

0,005

0,0102

0,0087

Bảng 3. Kết quả đ{nh gi{ độ đúng của phương ph{p x{c định hypophyllanthin trong mẫu

nghiên cứu

Mẫu

Nồng độ

hypophyllanthin

trong mẫu (mg)

Nồng độ

hypophyllanthin

thêm v|o mẫu (mg)

Nồng độ

hypophyllanthin sau

khi thêm v|o mẫu

(mg)

Độ thu hồi,

% (Rev, %)

0,01

0,2847

99,0

102,0

96,0

Lá

Thân

Rễ

0,2748

0,0166

0,0029

0,0268

0,0077

0,005

Từ kết quả tính to{n ở bảng 1, 2 cho thấy, phương ph{p x{c định h|m lượng

phyllanthin và hypophyllanthin có độ thu hồi đạt từ 96,0 đến 104,0%, phù hợp yêu cầu

của AOAC. Vậy, phương ph{p LC-MS/MS đạt được độ đúng tốt, nên có thể {p dụng

để ph}n tích phyllanthin và hypophyllanthin trong mẫu c}y Diệp hạ ch}u.

3.3. Phân tích phyllanthin, hypophyllanthin trong mẫu cây Diệp hạ châu

H|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong c{c mẫu cây Diệp hạ ch}u

được x{c định với c{c điều kiện tối ưu v| theo phương ph{p đường chuẩn đã x}y

dựng ở mục 2.5 v| 2.6. [p dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính x}y dựng được v|

phương ph{p nội suy để ph}n tích h|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong c{c

mẫu dược liệu, kết quả nghiên cứu được trình b|y ở bảng 3, 4. Từ c{c kết quả ở bảng 3,

4 cho thấy, phương ph{p LC-MS/MS khi ph}n tích c{c mẫu c}y Diệp hạ ch}u đạt độ

lặp lại tương đối tốt. Như vậy, phương ph{p ph}n tích có độ lặp lại cao, phù hợp để

x{c định phyllanthin, hypophyllanthin trong mẫu c}y Diệp hạ ch}u.

Bảng 4. Kết quả ph}n tích h|m lượng phyllanthin

H|m lượng phyllanthin đo được, mg/g

Mẫu

1/2.RSDH (%)

4,5

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình ± SD

0,0439±0,0004

RSD (%)

0,8

Lá

0,0439

0,0436

0,0443

20

TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 13, Số 2 (2018)

Thân

Rễ

0,0050

0,0039

0,0048

0,0037

0,0054

0,0041

0,0051±0,0003

0,0039±0,0002

6,0

5,1

6,3

6,5

Bảng 5. Kết quả ph}n tích h|m lượng hypophyllanthin

H|m lượng hypophyllanthin đo được, mg/g

Mẫu

1/2.RSDH (%)

Lần 1

0,2748

0,0166

0,0029

Lần 2

0,2744

0,0163

0,0030

Lần 3

0,2751

0,0171

0,0027

Trung bình ± SD

0,2748±0,0004

0,0167±0,0004

0,0029±0,0002

RSD (%)

0,1

Lá

Thân

Rễ

3,4

5,2

6,8

2,4

5,3

a. Sắc ký đồ của mẫu lá Diệp hạ châu

b. Sắc ký đồ của mẫu thân Diệp hạ châu

21

Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) <

c. Sắc ký đồ của mẫu rễ Diệp hạ châu

Hình 5. Sắc ký đồ của c{c mẫu ph}n tích

4. KẾT LUẬN

Bằng c{c phương ph{p sắc ký, chúng tôi ph}n lập được hợp chất phyllanthin,

hypophyllanthin từ c}y Diệp hạ ch}u (Phyllanthus urinaria L.). Cấu trúc của hợp chất

1

n|y được x{c định dựa trên cơ sở c{c số liệu phổ công hưởng từ hạt nh}n H-NMR,

13

C-NMR v| phổ khối lượng ESI-MS). Hợp chất n|y được tinh sạch (độ tinh khiết >

99,8%) bằng hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System), được sử

dụng để l|m chất chuẩn ph}n tích h|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong các

mẫu c}y Diệp hạ ch}u bằng phương ph{p sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS).

Kết quả cho ta thấy h|m lượng phyllanthin, hypophyllanthin tập trung chủ yếu ở l{,

trong đó h|m lượng hypophyllanthin cao hơn phyllanthin. Cần tiếp tục nghiên cứu

ph}n lập v| x{c định h|m lượng c{c hợp chất có hoạt tính sinh học kh{c từ c}y Diệp hạ

châu để đ{nh gi{ đầy đủ nhất cho cây Diệp hạ ch}u v| c{c chế phẩm thuốc có nguồn

gốc từ cây Diệp hạ ch}u.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nh| xuất bản Khoa học v|

Kỹ thuật, H| Nội.

[2]. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), Nhà xuất bản Y học, H| Nội.

[3]. Phạm Ho|ng Hộ (1992), Cây cỏ Việt Nam, Nh| xuất bản Trẻ, H| Nội.

[4]. Calixto J. B., Santos A. R., Cechinel F. V., Yunes R. A. (1998), A review of the plants of the

genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential, Med. Res.

Rev., 18(4), 225-58.

22

TẠP CHÍ KHOA HỌC V\ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế

Tập 13, Số 2 (2018)

[5]. Vandana S., Manju S., Richa M., Karuna S., Ram K. V., Madan M. G., Anil K. G., Suman P.

S. K. (2008), Separation and quantification of lignans in Phyllanthus species by a simple

chiral densitometric method, J. Sep. Sci., 31, 47-55.

[6]. Tripathi A. K., Verma R. K., Gupta A. K., Gupta M. M., Khanuja S. P.,(2006), Quantitative

determination of phyllanthin and hypophyllanthin in phyllanthus species by high-

performance thin layer chromatography, Phytochem. Anal. 17(6): 394–397

[7]. Fan H., Zhang W., Wang J., Lv M., Zhang P., Zhang Z., Xu F. (2015), HPLC–MS/MS

method for the determination of four lignans from Phyllanthus urinaria L. in rat plasma and

its application, Bioanalysis, 7(6), 701–712.

ISOLATION AND QUANTITY DETERMINATION OF PHYLLANTHIN,

HYPOPHYLLANTHIN FROM Phyllanthus urinaria L. BY LIQUID

CHROMATOGRAPHY- MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS)

1

2

3

Doan Manh Dung , Nguyen Huu Tung , Nguyen Dinh Luyen

1

Faculty of Chemistry, University of Sciences, Hue University

2

School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University, Hanoi

3

Faculty of Chemistry, University of Education, Hue University

*Email: doanmanhdung151090@gmail.com

ABSTRACT

By using chromatography methods, we isolated principal compound of

phyllanthin and hypophyllanthin from Phyllanthusurinaria L.. Its structure was

1

13

determined on the basis of spectroscopic data ( H-NMR, C-NMR and ESI-MS

mass spectra). This compound is purified (purity > 99,8%) by Agilent 218

purification system, which was used as standard for analyzing phyllanthin,

hypophyllanthin in samples. The liquid chromatography (LC-MS/MS) with

chromatography column: EC-C18 (100 x 2.1 mm, 2.7 μm), mobile phase: MeOH (A)

–Slution (10mM ammonium acetate and 0,1% formic acid ) (B) (v/v = 60/40), flow:

0,3 ml/min, injection volume: 1μL,Quantifcation was performed using multiple

reaction monitoring (MRM) at transitions of m/z 261→231 for hypophyllanthin and

m/z 436→151 for phyllanthin. We used the optimized analytical method for

determining rapidly two active compounds hypophyllanthin and phyllanthinin

Phyllanthusurinaria L. with good linearity, precision and accuracy using LC-MS/MS

technique.

Keywords: Phyllanthusurinaria, phyllanthin, hypophyllanthin, LC-MS/MS.

23

Phân tích hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin trong cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) <

Đoàn Mạnh Dũng sinh ng|y 15/10/1990 tại H| Tĩnh. Năm 2008, ông tốt

nghiệp cử nh}n ng|nh Sư phạm Hóa học tại trường Đại học Vinh. Năm

2014, ông tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ng|nh Hóa Hữu cơ tại Trường Đại

học Vinh. Từ năm 2015 đến nay, ông l| nghiên cứu sinh tiến sĩ chuyên

ng|nh Hóa ph}n tích tại trường Đại học khoa học, Đại học Huế.

Lĩnh vực nghiên cứu: hóa ph}n tích, hóa hữu cơ, hóa học c{c hợp chất thiên

nhiên.

Nguyễn Hữu Tùng sinh năm 1982 tại Bắc Ninh. Ông tốt nghiệp Đại học

B{ch khoa H| Nội năm 2005 v| đạt học vị Tiến sĩ Dược học năm 2010 tại

Đại học Quốc gia Chungnam, H|n Quốc. Từ 2010 đến 2015, ông l|m

nghiên cứu sau tiến sĩ tại Đại học Quốc tế Nagasaki, Nhật Bản. Ông là

giảng viên thuộc Bộ môn Hóa dược & Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược -

Đại học Quốc gia H| Nội từ 2015.

Lĩnh vực nghiên cứu: ph{t triển dược liệu c}y thuốc, x{c định c{c hoạt chất

từ đa dạng nguồn dược liệu.

Nguyễn Đình Luyện sinh ngày 22/01/1965 tại Quảng Bình. Năm 1986,

ông tốt nghiệp cử nh}n sư phạm Hóa học tại trường Đại học Sư phạm

Huế v| được Trường giữ lại l|m CBGD từ đó đến nay. Ông bảo vệ luận

{n Tiến sĩ năm 1999 v| được nh| nước công nhận Phó gi{o sư năm 2009.

Hiện tại l| Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế.

Lĩnh vực nghiên cứu: hóa phân tích.

24