Dự thảo tóm tắt Luận án Nghiên cứu sự lưu hành các typ huyết thanh và kiểu gen kháng kháng sinh của Streptococcus pneumoniae gây bệnh bằng kỹ thuật PCR đa mồi tại một số địa phương ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TỐNG THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ LƢU HÀNH CÁC TYP HUYẾT THANH

VÀ KIỂU GEN KHÁNG KHÁNG SINH CỦA Streptococcus

pneumoniae GÂY BỆNH BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI

TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62420107

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2017

1

Công trình đƣợc hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Đặng Đức Anh

2. GS. TS. Phạm Văn Ty

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

......................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm

luận án Tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

vào hồi.. …giờ .…, ngày ..…tháng ...…năm 201.....

Có thể tìm hiểu luận án tại:

-

Thư viện Quốc gia Việt Nam;

Trung tâm thông tin thư viện - Đại học Quốc gia Hà Nội

2

MỞ ĐẦU

Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) là tác nhân vi khuẩn chủ

yếu gây nhiễm khuẩn nghiêm trọng ở trẻ em và người già như viêm phổi, viêm

màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết. Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae có

thể có vỏ hoặc không có vỏ polysaccharide. Kháng nguyên vỏ là kháng

nguyên quan trọng để phân loại S. pneumoniae, đồng thời kháng nguyên này

đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh và lan truyền bệnh trong

cộng đồng. Dựa trên sự khác biệt tính kháng nguyên vỏ, người ta phân loại vi

khuẩn S. pneumoniae thành trên 90 typ huyết thanh khác nhau. Kháng thể

kháng vỏ thường là kháng thể đặc hiệu và có hiệu lực bảo vệ. Vắc xin phế cầu

đang sử dụng là vắc xin cộng hợp, bao gồm một số loại kháng nguyên vỏ

polysaccharide của vi khuẩn S. pneumoniae.

Phương pháp kinh điển cho chẩn đoán typ huyết thanh của vi khuẩn

Streptococcus pneumoniae là phản ứng phồng vỏ Quellung. Phương pháp này

thường rất tốn kém, mất nhiều thời gian, dễ gây dương tính giả do phản ứng

chéo giữa các kháng huyết thanh, lại không phát hiện các trường hợp đồng

nhiễm nhiều typ. Phương pháp xác định typ huyết thanh sử dụng cho các

nghiên cứu trước đây ở Việt Nam cũng chỉ là những kỹ thuật nuôi cấy kinh

điển. Trong vài năm gần đây, nhiều nước trên thế giới đã phát triển kỹ thuật

PCR để định typ huyết thanh có ưu điểm là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ

phát hiện cao và tỉ lệ đồng nhiễm các typ huyết thanh nhiều hơn so với phương

pháp thông thường. Tuy nhiên, các kỹ thuật PCR đã công bố thường chỉ phù

hợp cho từng khu vực nghiên cứu cụ thể và còn hạn chế về số lượng các typ

huyết thanh được phát hiện. Việc tìm ra một quy trình xét nghiệm không dựa

trên nuôi cấy có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho chẩn đoán phần lớn các typ

huyết thanh lưu hành của phế cầu ở mỗi khu vực, mỗi quốc gia là vấn đề hết

sức cần thiết.

3

Nhiễm trùng do S. pneumoniae có thể dự phòng vắc xin và điều trị

bằng kháng sinh thích hợp. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh đã làm xuất

hiện và lan truyền gen kháng thuốc gây cản trở tiến trình và hiệu quả điều trị.

Mặc dù tình hình kháng kháng sinh có thể thay đổi theo từng khu vực hay từng

quốc gia, nhưng châu Á là một tâm điểm của kháng kháng sinh. Trong khi đó,

nguồn lực cũng như cơ sở hạ tầng cho giám sát y tế cộng đồng còn rất nghèo

nàn. Với hơn 70% dân số trên thế giới sống ở khu vực Châu Á Thái Bình

Dương thì kháng kháng sinh ở khu vực này trở thành một gánh nặng toàn cầu.

Chương trình giám sát về tỉ lệ mắc, sự lưu hành các typ huyết thanh và

tính kháng kháng sinh của S.pneumoniae đã được thiết lập ở nhiều nước trên

thế giới nhưng chưa có ở Việt Nam. Xuất phát từ tính cần thiết và ý nghĩa thực

tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự lưu hành các typ huyết thanh

và kiểu gen kháng kháng sinh của Streptococcus pneumoniae gây bệnh

bằng kỹ thuật PCR đa mồi tại một số địa phương ở Việt Nam.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1. Xác định sự phân bố các typ huyết thanh của các chủng phế cầu gây bệnh

tại một số địa phương ở Việt Nam;

2. Xác định tình trạng kháng kháng sinh của các chủng phế cầu gây bệnh tại

một số địa phương ở Việt Nam;

3. Mối liên quan giữa typ huyết thanh và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn

Streptococcus pneumoniae.

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu đã áp dụng và cải tiến được quy trình PCR đa mồi xác định

typ huyết thanh phù hợp với điều kiện tại Việt Nam. Kỹ thuật này có ưu điểm

là nhanh, nhạy, ít tốn kém, có tỉ lệ phát hiện cao và tỉ lệ đồng nhiễm các typ

huyết thanh nhiều hơn so với phương pháp thông thường.

4

Đưa ra được số liệu tổng quan về các typ huyết thanh lưu hành và tình

trạng kháng kháng sinh giúp hoạch định chiến lược triển khai vắc xin dự

phòng và lựa chọn kháng sinh thích hợp. Cung cấp số liệu cho các chương

trình giám sát trong nước và các nước trong khu vực.

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam có những phân tích về mối

liên quan giữa typ huyết thanh và gen kháng kháng sinh. Phân tích này bên

cạnh việc cho thấy được hiệu quả của vắc xin trong việc làm giảm sự lưu hành

các gen kháng kháng sinh, còn dự đoán được xu hướng các typ huyết thanh nổi

trội sau khi triển khai tiêm vắc xin cho trẻ để có biện pháp thay đổi chiến lược

dự phòng.

CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN

Luận án bao gồm 120 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục; gồm

3 chương, 30 bảng, 38 hình, tham khảo 185 tài liệu trong và ngoài nước. Bố

cục luận án gồm: Mở đầu 4 trang, tổng quan 45 trang, vật liệu và phương pháp

nghiên cứu 20 trang, kết quả và bàn luận 50 trang, kết luận 1 trang, kiến nghị 1

trang; 3 bài báo có liên quan trực tiếp đến luận án đã được công bố.

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 1 Tổng quan chung về vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae (S.pneumoniae), còn gọi là phế cầu

khuẩn, là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tuỳ tiện, tan huyết alpha, có khả năng

tan trong muối mật và không sinh enzym catalase. Phế cầu có thể có vỏ hoặc

không vỏ. Vỏ polysaccharide là yếu tố độc lực của tế bào, đến nay đã phát

hiện được trên 93 typ huyết thanh vỏ khác nhau. Chủng mang các typ huyết

thanh khác nhau về độc lực, tỷ lệ lưu hành theo từng vùng địa lý và tính kháng

kháng sinh. Ngoài viêm phổi, phế cầu còn là nguyên nhân gây nhiều căn bệnh

xâm lấn khác như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm xương, viêm tai

5

giữa, viêm phế quản, viêm xoang cấp, viêm tai giữa, viêm nội mạc tử cung,

viêm màng ngoài tim, viêm màng não và áp xe não.

1 2 Typ huyết thanh của S.pneumoniae

Các kháng nguyên vỏ của vi khuẩn S. pneumoniae được sản xuất bởi tổ

hợp gen nằm trên cùng một vị trí cps của nhiễm sắc thể, xen kẽ giữa hai gen

dexB và aliA. Bốn gen đầu tiên là bảo tồn và giống nhau ở tất cả các typ huyết

thanh, trong khi phần trung tâm của locus chứa các gen đặc hiệu typ. Trình tự

nucleotide của cps locus tương ứng với hơn 90 typ huyết thanh của vi khuẩn

phế cầu đã được xác định và là cơ sở cho việc phân loại vi khuẩn S.

pneumoniae dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. Tại châu Á, có 7 kiểu typ

huyết thanh 1, 5, 6A, 6B, 14, 19F và 23F là phổ biến nhất chiếm 58%-66% các

bệnh phế cầu khuẩn xâm lấn ở các quốc gia.

Tiêm chủng cho trẻ từ sớm sẽ giúp giảm thiểu tác hại của các căn bệnh do

phế cầu gây ra. Vắc xin phòng ngừa bệnh này sản xuất dựa trên vỏ

polysaccharide. Vắc xin liên hợp PCV7, PCV10 và PCV13 đã lần lượt đưa vào

triển khai áp dụng ở các nước/lãnh thổ khu vực châu Á nhưng chưa được áp

dụng tại Việt Nam. Hiệu quả bảo vệ tại các khu vực này chưa công bố nhưng

được ước tính dựa trên độ bao phủ các typ huyết thanh.

1 3 Kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

S. pneumoniae kháng kháng sinh lần đầu tiên xuất hiện từ những thập

niên 70, sau đó gia tăng nhanh chóng trên toàn cầu. Sự xuất hiện các chủng

Streptococcus pneumoniae kháng thuốc (drug-resistant Streptococcus

pneumoniae - DRSP) gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người và

cộng đồng. Cơ chế sinh học phân tử gây kháng kháng sinh của S. pneumoniae

(chủ yếu là β-lactams và macrolides) là do đột biến gây giảm tính cảm thụ đối

với các protein gắn penicillin (chủ yếu là pbp1A, pbp2X, pbp2B) hoặc do vi

khuẩn thay đổi cấu trúc đích (methyl hóa ribosom) do gen ermB (gây kháng

6

đồng thời nhiều dòng kháng sinh của macrolides, clindamycine và

tetracycline) hoặc hình thành các bơm sinh học gây thay đổi tính thấm của

kháng sinh do các gen mef A, mef E [21]. Vi khuẩn kháng thuốc thường lan

truyền trong cộng đồng qua việc trao đổi các kiểu gen gây kháng thuốc giữa

các vi khuẩn cùng loài hay khác loài. Hiện nay, các nhà khoa học vẫn tiếp tục

nghiên cứu để xác định nguồn gốc lan truyền các vi khuẩn kháng thuốc và các

đột biến mới liên quan đến kháng thuốc.

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Thiết kế nghiên cứu

- Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp phân tích.

- Thời gian và địa điểm: Giai đoạn 2009 - 2013 tại 3 địa điểm: Bệnh viện

đa khoa Khánh Hòa, bệnh viện đa khoa Hải Dương và bệnh viện Bạch

Mai.

- Đối tượng nghiên cứu: 331 chủng vi khuẩn S. pneumoniae phân lập từ

trẻ dưới 5 tuổi viêm đường hô hấp cấp tính.

2 2 Các phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

- Kỹ thuật chẩn đoán bằng nuôi cấy phân lập: Khuẩn lạc vi khuẩn S.

pneumoniae trên môi trường thạch máu 5%: Tròn, nhỏ, dẹt, không màu và có

xu hướng lõm ở giữa, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha. Vi

khuẩn hình lưỡi mác hay ngọn nến, nối đôi giống hình cặp kính, cũng có thể

đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương. Nhạy cảm optochin

(Đường kính vòng vô khuẩn ≥ 14 mm), tan trong muối mật.

- Kỹ thuật sàng lọc phế cầu khuẩn bằng PCR đa mồi Các chủng phế

cầu phân lập từ kỹ thuật nuôi cấy được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR. Sử dụng

cặp gen lytA và cpsA đặc hiệu.

- Kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện đồng thời nhiều typ huyết thanh:

Áp dụng và cải tiến quy trình của CDC Hoa Kỳ xác định 40 typ huyết thanh

7

của phế cầu. Tổ hợp các nhóm mồi được thiết lập lại sao cho các typ huyết

thanh thường gặp ở Việt Nam sẽ được sắp xếp lần lượt theo tần suất xuất hiện

từ cao xuống thấp, làm giảm chi phí khi xét nghiệm mẫu.

- Kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện kiểu gen kháng kháng sinh: Áp

dụng và cải tiến quy trình của Nagai 2001 phát hiện các gen đột biến gây

kháng kháng sinh: các gen pbp1A, pbp2X, pbp2B liên quan đến kháng kháng

sinh nhóm beta-lactam; các gen ermB và mefA gây kháng đồng thời nhiều

dòng kháng sinh của macrolides, clindamycine và tetracycline.

- Kỹ thuật Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Nồng độ kháng sinh tăng

dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế

được sự phát triển của vi khuẩn, và có thể quan sát được bằng mắt thường.

CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3 1 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn S.pneumoniae

Hình 3.1. Tỷ lệ phân lập S. pneumoniae và H. influenzae

Trong số 1076 trẻ dưới 5 tuổi nhập viện do viêm đường hô hấp cấp tính,

tỷ lệ phân lập được H.influenzae cao nhất ở khu vực Khánh Hòa, sau đó là

Bạch Mai và Hải Dương với tỷ lệ tương ứng là 28,16%, 25,51% và 19,62%.

Trong đó tỷ lệ đồng nhiễm cả Streptococcus pneumoniae và Heamophillus

influenzae ở ba khu vực tương ứng là 14,7%, 12,6% và 10,8%.

3 2 Xác định sự phân bố các typ huyết thanh các chủng phế cầu

3.2.1. Áp dụng và cải tiến quy trình PCR xác định typ huyết thanh

8

Trong nghiên cứu này, đã áp dụng phương pháp PCR đa mồi của CDC.

Tuy nhiên do sự phân bố các typ huyết thanh của vi khuẩn S.pneumoniae giữa

hai quốc gia khác nhau, nên có sự khác biệt trong việc sắp xếp tổ hợp các mồi

ở mỗi phản ứng PCR. Sử dụng 36 cặp mồi xác định 40 typ huyết thanh của

phế cầu, được chia thành 8 nhóm phản ứng. Đây là những typ huyết thanh phổ

biến gây bệnh của phế cầu.

Hình 3.3. Ảnh

điện di quy trình

xác định typ

huyết thanh bằng

kỹ thuật PCR đa

mồi

9

Trong số 331 chủng S. pneumoniae có tới 83,7% số chủng chỉ cần thực

hiện 1 phản ứng PCR, 8,5% số chủng thực hiện 2 phản ứng, 2,1% số chủng

thực hiện 3 phản ứng, số chủng thực hiện 3 và 4 phản ứng đều chỉ có 1,5%.

Chỉ có 33 chủng (9,97%) phải chạy hết cả 8 nhóm phản ứng. Với cách sắp xếp

các typ nổi trội được đưa lên các nhóm phản ứng đầu như vậy sẽ tiết kiệm

được rất nhiều thời gian và nguồn lực do hạn chế được số lần thực hiện xét

nghiệm. Đây chính là điểm mới của luận án.

3 2 2 Kết quả phân bố các typ huyết thanh của vi khuẩn S. pneumoniae

Trong tổng số 331 chủng S. pneumoniae được tiến hành xác định typ

huyết thanh bằng kỹ thuật PCR đa mồi đã xác định được 13 typ huyết thanh.

Các typ huyết thanh chiếm

tỷ lệ vượt trội là 19F

(28,1%), 6A/B (25,4%),

23F(13%), 14(9,7%) và

11(7,6%). Các typ còn lại

chiếm tỷ lệ thấp hơn là

15B/C (4,5%), 19A (3%),

17F (1,8%), 23A (1,5%),

10A (0,9%), 34 (0,9%), 3

(0,6%), và 18 (0,3%).

Hình 3.7. Tỷ lệ phân bố các typ huyết thanh tại 3 bệnh viện thuộc phạm vi

nghiên cứu

Các typ huyết thanh chiếm ưu thế gây bệnh khác nhau giữa các nhóm

tuổi, quốc gia và thay đổi theo thời gian. Bảy kiểu typ huyết thanh (1, 5, 6A,

6B, 14, 19F và 23F) là phổ biến nhất chiếm 58%-66% các bệnh phế cầu khuẩn

xâm lấn ở các quốc gia. Các serotype này là nguyên nhân gây nên trên 300.000

10

ca tử vong ở Châu Phi và 200.000 ca tử vong ở châu Á. Trong nghiên cứu của

chúng tôi phát hiện 5/7 kiểu typ huyết thanh thuộc nhóm này (6A, 6B, 14, 19F

và 23F) và chiếm tới 76,2 % trong tổng số 331 chủng phân lập được.

3.2.5. Tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh trong vắc xin

Trong số 331 trẻ viêm đường hô hấp cấp tính có 243 trẻ (73,4%) được

bao phủ bởi vắc xin PCV7 và PCV10. Độ bao phủ các typ huyết thanh tăng

dần ở vắc xin PCV13 và PPSV23 với số lượng và tỷ lệ tương ứng là

251(75,8%) và 291(87,9%).

Bảng 3.5. Tỷ lệ bao phủ các typ huyết thanh trong vắc xin

PCV7

PCV10

PCV13

PPSV23

Số lượng kiểu

typ huyết

thanh

5

7

11

Typ huyết

19F, 6B,

23F, 14,

18, 19A, 3

19F, 6B, 23F,

14, 18, 19A,

3, 11, 17F,

thanh bao phủ 23F, 14, 18 23F, 14, 18

trong vắc xin

10A, 15B/C

Tuổi

<1 tuổi 127 86(67,7%) 86(67,7%) 89(70,1%)

<2 tuổi 238 174(73,1%) 174(73,1%) 179(75,2%)

<3 tuổi 287 209(72,8%) 209(72,8%) 215(74,9%)

<4 tuổi 315 232(73,7%) 232(73,7%) 239(75,9%)

<5 tuổi 331 243(73,4%) 243(73,4%) 251(75,8%)

Giới

113(89%)

213(89,5%)

251(87,5%)

278(88,3%)

291(87,9%)

Nam 193 146(75,6%) 146(75,6%) 151(78,2%)

172(89,1%)

119(86,2%)

Nữ

138 97(70,3%) 97(70,3%) 100(72,5%)

Vắc xin PCV7 và PCV10 có hiệu quả bao phủ các typ huyết thanh như

nhau, cùng là 73,4%. Vắc xin PCV13 có tỷ lệ bao phủ cao hơn (75,8%) và có

khả năng bảo vệ thêm được typ huyết thanh 19A và 3. Đã có nhiều báo cáo

cho thấy các bệnh xâm lấn gây ra bởi các typ huyết thanh không bao gồm

11

trong vắc xin PCV7 kháng penicillin tăng lên và hầu hết các chủng kháng

kháng sinh hiện nay được gây ra bởi typ 19A. Hơn nữa, mức độ nghiêm trọng

của các chủng mang typ huyết thanh 19A gây đa kháng kháng sinh là nguyên

nhân của bệnh viêm màng não và các bệnh nhiễm khuẩn xâm lấn nghiêm

trọng, bệnh viêm xương chũm do phế cầu và là nguyên nhân dẫn đến thất bại

trong điều trị các bệnh viêm tai giữa. Như vậy về khả năng bao phủ các typ

huyết thanh thì vắc xin PCV13 sẽ có hiệu quả nhất trong số các loại vắc xin

hiện có.

3.3. Tình trạng kháng kháng sinh của các chủng phế cầu

3.3.1. Áp dụng quy trình PCR xác định gen kháng kháng sinh

Áp dụng và cải tiến quy trình của Nagai năm 2001 từ 3 phản ứng

thành 2 phản ứng. Sự kết hợp này đã giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và

công sức 1/3 lần so với quy trình ban đầu. Phản ứng 1 sử dụng 3 cặp mồi của

các gen lytA, pbp1A, pbp2X, pbp2B với kích thước tương ứng là 319 bp, 238

bp, 197 bp và 147 bp. Phản ứng 2 sử dụng 2 cặp mồi là mefA và ermB với kích

thước tương ứng là 293 bp và 224 bp.

M: Marker,

1-4 và 6-7: đơn

mồi,

5: lytA, pbp1A,

pbp2X, pbp2B,

8: mefA, ermB,

(-): chứng âm.

Hình 3.12. Ảnh điện di quy trình xác định gen kháng kháng sinh

3.3.2. Kết quả tỷ lệ phân bố kiểu gen kháng kháng sinh bằng PCR đa mồi

Sự biến đổi protein gắn với penicillin (PBPs) làm giảm ái lực đối với

kháng sinh là cơ chế chủ yếu giúp vi khuẩn kháng kháng thuốc. Những biến

đổi này là do đột biến điểm hoặc thể khảm (mosaic) trong các gen pbp2X,

12

pbp2B, và pbp1A. Trung bình ở châu Á, có 52,4% số chủng S.pneumoniae

không nhạy cảm với penicillin. Trong đó Việt Nam có tỷ lệ cao nhất (92%).

Trong nghiên cứu này tỷ lệ mang gen đột biến pbp2B và pbp2X lên tới trên

95%. Tỷ lệ mang gen kháng kháng sinh cũng tương ứng với tỷ lệ kháng kháng

sinh penicillin lên tới 94,3% (I: 60,7%; R: 33,5%). Tỷ lệ kháng trung gian cao

tương ứng với tỷ lệ mang kiểu gen kháng kháng sinh cao, dẫn tới xu hướng

dịch chuyển kháng sinh nhóm penicillin mức trung gian sang nhóm kháng

hoàn toàn. Kháng kháng sinh nhóm penicillin thường kéo theo đa khang với

những kháng sinh nhóm beta-lactam khác.

Bảng 3.6. Tỷ lệ phân bố kiểu gen kháng kháng sinh

pbp1A_ pbp2x pbp2b_

BĐ

_BĐ

BĐ

MefA

ErmB

Khu

vực

p-value

Khánh

Hoà 154

Hải

Dương 77

Bạch

0,03

0,011

0,029

0,027

33,8%

51,9%

38%

0,001

90,9%

74%

94,2% 98,7% 98,1%

89,6%

84%

96,1%

91%

96,1%

91%

Mai 100

89%

Tuổi

≤ 2 tuổi 238

>2 tuổi 93

Giới

36,6%

46,2%

90,3% 97,1% 97,1%

89,9%

77,4%

89,2%

92,5%

91,4%

p-value

0,22

91,7%

87,7%

90%)

0,51

0,34

0,1

43%

34,1%

39,3%

0,93

Nam 193

Nữ 138

Tổng

96,4%

94,9%

95,8%

96,4%

94,2%

95,5%

86,5%

86,2%

86,4%

331

Đối với cơ chế kháng kháng sinh nhóm macrolide, con đường ức chế

quá trình dịch mã được quy định bởi ermB là cơ chế chính ở hầu hết các quốc

13

gia châu Á và châu Âu và cũng đang gia tăng ở Hoa Kỳ trong thời gian gần

đây, trong khi đó gen mefA vẫn chiếm ưu thế ở Canada. Các nguyên nhân

chính dẫn đến sự đề kháng macrolide cao ở các nước châu Á là việc lạm dụng

macrolid trong thực hành lâm sàng và sự lan rộng dòng vi khuẩn mang gen

kháng macrolid qua quá trình chọn lọc kháng sinh. Với tình hình dịch tễ học

kháng kháng sinh như vậy, kinh nghiệm sử dụng phác đồ điều trị macrolide

đơn dòng cho các bệnh viêm phổi cộng đồng hay viêm phổi do phế cầu khác

không phải là sự lựa chọn thích hợp ở nhiều nước châu Á, nơi có thể gây ra

thất bại trong liệu pháp kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn.

3 3 3 Kết quả tình trạng kháng kháng sinh theo kiểu hình bằng kỹ thuật

nồng độ ức chế tổi thiểu

3.3.3.1. Tình trạng kháng kháng sinh chung ở cả 3 bệnh viện thuộc khu vực

nghiên cứu

Bảng 3.7. Tình trạng kháng sinh của các chủng S.pneumoniae (n = 331)

Kh

áng

sinh

MI

C5

0

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

MIC

90

Range

S

I

R

201(60,7

%)

111(33,5

pcg

0.016-32

1

4

8

2

8

2

19(5,7%)

%)

amp

c

293(88,5

16(4,8%) 22(6,6%)

%)

110(33,2 56(16,9% 165(49,8

amp 0.016-128

cav 0.008-16

cxm 0.016-64

1

%)

285(86,1

%)

)

%)

0.5

2

19(5,7%) 27(8,2%)

124(37,5 46(13,9% 161(48,6

%)

165(49,8

%)

)

%)

44(13,3%

)

122(36,9

%)

ctx

0.008-4

0.5

cfp

m

ipm

264(79,8 65(19,6%

0.032-4

0.008-1

1

2

2(0,6%)

8(2,4%)

%)

)

0.2

0.5

120(36,3

203(61,3

14

Kh

áng

sinh

MI

C5

0

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

MIC

90

Range

S

I

R

5

%)

0.008-

>129

0.064-

>129

0.032-

>129

0.008-

>129

61(18,4%

258(77,9

%)

263(79,5

%)

260(78,5

%)

224(67,7

%)

137(41,4

%)

258(77,9

%)

em

32

128

12(3,6%)

11(3,3%)

16(4,8%)

19(5,7%)

-

)

57(17,2%

azm

cam

64 >129

32 >129

128 >129

)

55

(16,6%)

88(26,6%

)

194(58,6

%)

cld

m

cp

tc

1-32

4

16

64

1

68(20,5%

)

0.125-128 16

0.5-

5(1,5%)

309(93,4

cpfx 0.032-32

7(2,1%)

15(4,5%)

1

%)

Trong nghiên cứu của chúng tôi đã lựa chọn phương pháp ức chế tối

thiểu để xác định tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn S.pneumoniae. Bên

cạnh xác định được tỷ lệ các chủng vi khuẩn nhạy cảm và kháng kháng sinh,

còn xác định được nồng độ tối thiểu cần thiết để tiêu diệt vi khuẩn, từ đó làm

cơ sở để lựa chọn các mức liều trong điều trị.

Đã có sự dịch chuyển sang nhóm giảm nhạy cảm (60%) và kháng

(33,5%) đối với penicillin, và tỷ lệ kháng là 49,8% đối với ampicillin (MIC, 

2g/ml). Tuy nhiên trong nhóm penicillin, vẫn còn 88,5% nhạy cảm với

amoxicillin (MIC,2g/ml) và 89,6% còn nhạy cảm với amoxicillin-

clavunalic (MIC,  2/1g/ml). Chỉ có 5,7% số chủng S. pneumoniae còn nhạy

với penicillin và 33,2% nhạy với ampicillin. Nồng độ ức chế tối thiểu của vi

15

khuẩn S.pneumoniae đối với kháng sinh nhóm penicillin ở mức thấp với MIC₅₀

từ 0,5-1g/ml và MIC₉₀từ 2-8 g/ml.

Tỷ lệ nhạy cảm với nhóm kháng sinh Cephalosporin tăng từ thế hệ

thấp tới thế hệ cao. Chỉ có 37,5% còn nhạy cảm với cefuroxime (thế hệ II),

tăng dần ở cefotaxime (thế hệ III) là 49,8% và 70,8% ở cefepime (thế hệ IV).

Tỷ lệ kháng của cefotaxime thấp (13,3%) nhưng tỷ lệ giảm nhạy cảm lại khá

cao (36,9%). Đề kháng ở nhóm carbapenem (đại diện là imipenem) chỉ 2,4%

(MIC,  1g/ml), tuy nhiên có tới 61,3% số chủng kháng ở mức độ trung gian.

Các chủng S. pneumoniae đã kháng lại kháng sinh có phổ kháng

khuẩn hẹp thuộc nhóm macrolide và lincosamide như: 77,9% kháng với

erythromycin, 79,5% kháng với azithromycin, 78,5 kháng với clarithromycin

và 67,7% kháng với chlindamycin. Dải kháng khuẩn trong nhóm kháng sinh

này rộng từ 0,008 - >129 g/ml, và giá trị nồng độ tiêu diệt trên 90% số chủng

rất cao với MIC₉₀>129g/ml.

Hình 3.15. Kháng kháng sinh hoàn toàn và kháng trung gian (n=331)

Kháng sinh nhóm macrolide có tỷ lệ kháng hoàn toàn cao và tỷ lệ

kháng trung gian thấp, như vậy nhóm giảm nhậy cảm đã dịch chuyển sang

kháng hoàn toàn, kết hợp với kết quả các giá trị nồng độ MIC rất cao ở nhóm

kháng sinh này (Bảng 3.7, và 3.8) chứng tỏ nhóm macrolide sẽ không còn tác

dụng trong điều trị bệnh phế cầu nữa.

16

Một số kháng sinh nhóm beta-lactam có tỷ lệ kháng thấp như

penicillin G, cefotaxim hoặc kháng sinh thế hệ cao và mạnh như cefepim,

imipenem, ciprofloxacin nhưng lại có tỷ lệ kháng ở mức trung gian rất cao

(Hình 3.15). Điều này dự báo khả năng dịch chuyển từ nhóm giảm nhạy cảm

sang nhóm kháng hoàn toàn. Các loại kháng sinh này sẽ có khả năng gia tăng

tính kháng trong tương lai gần. Dự báo khả năng gia tăng các chủng kháng

thuốc nếu không có liệu pháp sử dụng kháng sinh hợp lý. Một trong các biện

pháp làm giảm nhẹ xu hướng kháng kháng sinh đó là phối hợp kháng sinh đối

với loại có tỷ lệ kháng trung gian cao hoặc luân phiên chuyển đổi sang nhóm

kháng kháng sinh khác. Một số kháng sinh nhóm beta-lactam như amoxicillin,

amoxicillin/ clavulanic, cefepim có tỷ lệ nhạy cảm cao tương ứng là 88,5%,

86,1% và 79,8%. Đây là các kháng sinh có thể điều trị hiệu quả các bệnh phế

cầu.

3 3 5 Tình trạng đa kháng kháng sinh của các chủng S.pneumoniae

Bảng 3.16. Đa kháng kháng sinh của vi khuẩn S.pneumoniae (n=331)

Số kháng sinh

Số lƣợng chủng

Số chủng kháng cộng

dồn

kháng

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

2(0,6%)

4(1,2%)

8(2,4%)

2(0,6%)

6(1,8%)

14(4,2%)

16(4,8%)

26(7,9%)

38(11,5%)

40(12,1%)

50(15,1%)

54(16,3%)

31(9,4%)

20(6,0%)

23(6,9%)

15(4,5%)

30(9,1%)

56(16,9%)

94(28,4%)

134(40,5%)

184(55,6%)

238(71,9%)

269(81,3%)

289(87,3%)

312(94,3%)

327(98,8%)

17

Số kháng sinh

Số lƣợng chủng

Số chủng kháng cộng

dồn

kháng

0

331(100%)

4(1,2%)

Các chủng vi khuẩn S.pneumoniae kháng từ 3 kháng sinh trở lên được

gọi là đa kháng thuốc, các chủng kháng hoàn toàn tất cả các nhóm kháng sinh

thử nghiệm là toàn kháng. Có tới 289/331 chủng phế cầu đa kháng kháng sinh,

chiếm tỷ lệ lên tới 87,3%. Chỉ có 4 chủng (1,2%) không kháng với tất cả các

loại kháng sinh. Có 2 chủng kháng với 13/15 loại kháng sinh. Không có chủng

nào kháng với tất cả các loại kháng sinh, đồng nghĩa với tỷ lệ toàn kháng là

0%. Tỷ lệ các chủng đa kháng tập trung chủ yếu ở số loại kháng sinh kháng là

từ 4 đến 8 loại kháng sinh.

Có mối liên quan chặt chẽ giữa tỷ lệ mang đa gen với tỷ lệ đa kháng

kháng sinh. Số chủng không mang gen kháng hoặc mang từ 1-3 gen chỉ tập

trung ở số chủng kháng với ít loại kháng sinh hơn. Số chủng mang cả 5 loại

gen kháng kháng sinh tỷ lệ thuận với số loại kháng sinh kháng. 100% số chủng

mang cả 5 gen kháng trong nhóm có kiểu hình kháng với 12 và 13 loại kháng

sinh thử nghiệm.

Hình 3.17. Mối liên quan giữa đa kháng và mang đa gen kháng

18

Nguyên nhân dẫn đến tình trạng đa kháng nhiều loại kháng sinh cao

chủ yếu do tình trạng lạm dụng kháng sinh phổ biến trong điều trị cũng như

trong nông nghiệp, đặc biệt ở những nước khu vực châu Á và ở Việt Nam.

Một phần khác do tỷ lệ các chủng kháng penicillin và các chủng mang các

typ huyết thanh liên quan đến kháng kháng sinh tăng cao. Các chủng kháng

kháng sinh nhóm penicillin thường liên quan đến đa kháng kháng sinh với

nhiều nhóm kháng sinh khác. Trong nghiên cứu này tỷ lệ kháng penicillin G

lên tới 94,3% (60,7% kháng ở mức độ trung gian và 33,5% kháng hoàn

toàn). Đây có thể là nguyên nhân đầu tiên dẫn đến tỷ lệ đa kháng kháng sinh

cao.

Các typ huyết thanh (23F, 19F, and 6B), thường liên quan đến đa

kháng nhiều dòng kháng sinh như kháng penicillin, các cephalosporin phổ

rộng, và kháng sinh marolide tại nhiều nước khu vực châu Á giai đoạn trước

khi tiêm vắc xin PCVs. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các typ huyết thanh

23F, 19F, 6A/B là phổ biến và chiếm tỷ lệ cao nhất. Đây cũng là nguyên

nhân dẫn đến tỷ lệ đa kháng kháng sinh ở Việt Nam. Như vậy của vắc xin

PCVs bao phủ các typ huyết thanh phổ biến này còn có vai trò làm giảm tình

trạng đa kháng kháng sinh.

3 4 Mối liên quan giữa typ huyết thanh và tình trạng kháng kháng sinh

Bảng 3.17. Tỷ lệ phân bố các gen kháng kháng sinh theo typ huyết thanh có

và không có trong vắc xin PCV10

mef

pbp1 pbp2 pbp2

Tru

ng

bình

pbp- mef

BĐ

erm

B

A+

erm

B

N

a-

x-

b-

A

ĐB

Phân nhóm typ huyết

thanh

79,1

%

94,7 97,9 97,9 94,2 42,8 90,5 35,4

PCV 243

%

19

65,2

%

non-

PCV 67

74,6

%

88,1 73,1 28,4 82,1 19,4

91%

%

PCV10

100

%

98,9

%

100

%

98,9 89,2 83,9 73,1

92%

19F 93

%

73,8

%

96,4

%

100

%

100

%

96,4 11,9

100

%

11,9

%

6A/B 84

%

69,1

%

97,7 97,7

23F 43 86%

%

86% 14% 93% 9,3%

84,4 18,8

69,6

%

87,5 93,8 90,6 87,5

14 32

non-

%

25%

%

PCV10

100

%

100

%

86,7 86,7

100

%

100

%

100

%

76%

61%

11 25

15B/

16%

53,3

%

16%

C

15 60%

%

60%

60% 20%

100

71,4

%

19A 10 80% 90% 90% 80% 30%

%

30%

Tổng

95.8 95.5 89.1 39.3 86.4 29.6

chung

90%

%

PCV10: Các typ huyết thanh được bao phủ trong vắc xin PCV10

Non- PCV10: Các typ huyết thanh không được bao phủ trong vắc xin PCV10

Nhóm chủng mang typ huyết thanh có trong vắc xin PCV10 mang tỷ

lệ gen kháng kháng sinh cao hơn so với nhóm typ không có trong vắc xin.

Trong nhóm PCV10 tỷ lệ mang gen pbp từ 94,7%-97,9% trong khi trong

nhóm non-PCV10 tỷ lệ này từ 74,6%-88,1%. Tỷ lệ đồng nhiễm cả 3 gen pbp

ở nhóm PCV10 là 94,2%, nhóm non-PCV10 là 73,1%. Gen kháng kháng sinh

nhóm macrolide cũng tương tự như vậy. Nhóm PCV10 có từ 42,8%-90,5%,

nhóm non-PCV10 từ 28,4%-82,1% mang gen mefA hoặc ermB, tỷ lệ đồng

20