Đồ án Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng Meilodogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP. ĐỂ PHÒNG

TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP. GÂY

HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện :

PHAN ÁNH NGÂN

MSSV: 1211100132

Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016.

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu

thực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên

Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công

Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến

hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa

Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp.

HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực.

Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian

lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.

Tp. HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Phan Ánh Ngân

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận

được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng

biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học –

Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri

thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em

trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có

những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em

rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài

báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào

thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những

thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu

của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này

được hoàn thiện hơn.

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của

trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên

khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện

cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng

xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã

nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp.

Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm

bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh

nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót,

em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều

kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới.

Em xin chân thành cảm ơn !

ii

MỤC LỤC

L ỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i

L Ờ I C ẢM ƠN .............................................................................................................. ii

M Ụ C L Ụ C .................................................................................................................. iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi

DANH MỤC BẢNG................................................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. viii

ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................................1

MỤC ĐÍCH ..................................................................................................................2

NỘI DUNG...................................................................................................................2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp......................................................................3

1.1.1. Phân loại khoa học .............................................................................................3

1.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................4

1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces..........................................................5

1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến

trùng..............................................................................................................................6

1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp..................7

Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu11

1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật .....................................................11

1.2.2. Phân loại khoa học ...........................................................................................14

Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp.

trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng...................................................................19

Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp. trong

phòng trừ tuyến trùng hại cây ....................................................................................22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..................................................24

Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................24

iii

Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất ............................................................24

2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................24

2.2.2. Thiết bị..............................................................................................................24

2.2.3. Các loại môi trường sử dụng............................................................................25

Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................26

2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp. ...........................................................27

2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng.....................................................28

2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật...................................28

2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014)29

2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường

nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009)...............................................................30

2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp..........................................................................................................30

2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces

sp.................................................................................................................................31

2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm

Paecilomyces sp..........................................................................................................35

2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ

tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu............................................................36

2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................38

Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp...................................................38

Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của

Paecilomyces sp..........................................................................................................39

iv

3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp.

.....................................................................................................................................39

3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp.

.....................................................................................................................................41

3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và

Paecilomyces sp..........................................................................................................43

Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và

phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng).............................................44

3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm

Paecilomyces sp..........................................................................................................44

3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành

và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) ........................................49

Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm

Paecilomyces sp..........................................................................................................52

3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm...................................................................52

3.4.2. Trên đồng ruộng...............................................................................................55

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................58

Kết luận................................................................................................................58

Kiến nghị .............................................................................................................58

TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................59

Tài liệu tiếng việt........................................................................................................59

Tài liệu tiếng anh........................................................................................................59

Tài liệu từ internet ......................................................................................................61

PHỤ LỤC .....................................................................................................................1

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CDB: Czapeck – Dox.

CMB: Complete Media

NSC: ngày sau cấy.

NT: nghiệm thức.

PDA: Potato D – Glucose Agar

SDAY1: Sabourand dextrose Yeast

SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng.

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm.......................................................................................31

Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu.......................................32

Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm.............................................33

Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và

Paecilomyces sp..........................................................................................................35

Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp......37

Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm..40

Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm

Paecilomyces sp..........................................................................................................40

Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ....................................................41

Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế..........................................................................41

Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ....................................................43

Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm

Paecilomyces sp..........................................................................................................43

Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi

trường lỏng lắc............................................................................................................44

Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit............................46

Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy ....................................................51

Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay ngô mảnh và

gạo tấm........................................................................................................................52

Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm

Paecilomyces sp. ký sinh............................................................................................53

Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu.................................55

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. ........4

Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi ..................................5

Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin)........................................................6

Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật.........................................................15

Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp......................................................17

Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng. .........22

Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA............................................38

Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại

thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin

20WP; E: đối chứng)..................................................................................................39

Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc

hóa học.. (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin

50WP; E: đối chứng)..................................................................................................42

Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. ...........44

Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi

trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường

SDAY3)......................................................................................................................45

Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. ................48

Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A:

môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường

cám) ............................................................................................................................50

Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. ..............51

Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay..............................................52

Hình 3.10. Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị chết ở các ngày sau khi lây

nhiễm. ........................................................................ Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái

tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái

viii

mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển

vi sau khi nhuộm Methylene blue).............................................................................54

Hình 3.12. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu....56

Hình 3.13. Trước khi tưới. .........................................................................................57

Hình 3.14. Sau khi tưới. .............................................................................................57

ix

Đồ án tốt nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam.

Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản

phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Năm 2015, mặc dù chưa có thống

kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo

số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Tuy nhiên, cũng như các ngành nông

nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất

gây nên do dịch hại. Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng

trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính

làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012). Bên

cạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu. Theo kết

quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng

xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại

cao. Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng.

Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ. Tuy

có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu

đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm

cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là

một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu.

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để

phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp. được xem là một trong

những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M

và Copping L., 2000). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces

vẫn còn hạn chế. Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ

thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp. và đã chứng

minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt. Tuy nhiên, tác giả chưa đưa ra

được môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng

ruộng. Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng

trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”.

1

Đồ án tốt nghiệp

MỤC ĐÍCH

Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm

Paecilomyces sp. và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm

Paecilomyces sp.

NỘI DUNG

❖

Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp.

Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của

nấm Paecilomyces sp.

❖

Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm

Paecilomyces sp.

Đáng giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu trong điều kiện in vitro và trên

đồng ruộng.

2

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp.

1.1.1. Phân loại khoa học

Giới:

Ngành:

Lớp:

Bộ:

Fungi

Ascomycota

Eurotiomycetes

Eurotiales

Họ:

Trichocomaceace

Chi:

Paecylomyces

Chi Paecilomyces do Bainier mô tả năm 1907, sau đó được nhiều tác giả

chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Paecilomyces lilacinum đã được

phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy.

Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố

trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces

fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces

tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K. Arora, P. D.

Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004).

Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng,

cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ

dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực

vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số

loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:

- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng

- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất

- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng.

- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng

chết, rừng cao su, đất trồng tiêu... (Crop Protection Compennium, 2002).

3

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2. Đặc điểm hình thái

Paecilomyces sp. là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến

trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá

chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khi

bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên

thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng

sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Cuống

bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp. thường

lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và

uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử

phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc

có gai (Trần Văn Mão, 2002). Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm. Có thể

phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể.

(Phùng Lê Kim Yến, 2014)

Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường

PDA.

(Nguồn:http://galleryhip.com/scopulariopsis.htm)

Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ.

Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn hoặc

hơi nhám, không có bào tử chống chịu.

4

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi

(Nguồn: http://www.wikiwand.com/de/Paecilomyces_variotii)

1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces

Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có

tên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin). Leucinostatins là một peptide

trung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theo

sau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 –

hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theo

Mori et al. 1982). Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F.

Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều

loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến

trùng không có sự tham gia của loại độc tố này. Tùy từng loài Paecilomyces khác

nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin,

viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hóa thứ

cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.

5

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin)

1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến

trùng

Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và

West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và

Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng

hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996).

Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp

biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh

hưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi

vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin

và một lớp lipoprotein bên trong. Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trình

xâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ

trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp

vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004).

Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theo

các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng.

Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học.

Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử

mộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong

6

Đồ án tốt nghiệp

trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Khả năng tiết enzyme chitinase và protease

đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài

nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo

thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980). Sau khi xâm nhập vào

bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể

tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sự

trao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng.

1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.

Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công

vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm

độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối

phó lại với môi trường (Penland, 1982).

1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng

Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp. cần nhiều dưỡng chất, nếu

thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng

(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng

giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành

bào tử của nấm Paecilomyces sp. (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001). Các

nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh

enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001). Các tác giả còn cho biết sucrose là

cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm).

Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động

vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão,

2002).

1.1.5.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự

phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng

(Ayyasamy và Baskaran, 2005). Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25

0

⁰C, nhưng ở 25 C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999). Gần đây, Stather và

7

Đồ án tốt nghiệp

ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát

triển của nấm Paecilomyces sp. và xác định nấm Paecilomyces sp. thích hợp ở nhiệt

0

độ 28 C. Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn công

tuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì

nấm Paecilomyces sp. sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường

(theo Penland, 1982). Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt

0

độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15 C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt

0

độ 24 C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26

0

⁰C, nhưng ở nhiệt độ 18 C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 C.

Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăng

quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002). Julio

J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo

0

nên ở các nhiệt độ 12 ⁰C, 16 ⁰C và 30 C.

1.1.5.3 Ẩm độ

Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Ẩm độ

cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm

độthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm

Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi

ẩm độ 75 %.

1.1.5.4 pH

pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+

có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng,

acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử

(Dasrupta, 1994). Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8. Nhưng nấm tuyến

trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6. Theo nghiên cứu

của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P.

fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7

(Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003).

1.1.5.5 Ánh sáng

8

Đồ án tốt nghiệp

Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự phát

triển và tạo bào tử. Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử

(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình

sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces

spp. sẽ không tạo nhiều bào tử.

1.1.5.6 Độ thoáng khí

Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi

hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của

không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt.

1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy

Năm 1986, tác giả Jeanne M. M. I. và CS. (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy

nấm Paecilomyces sp. bằng phương pháp lên men chìm. Tác giả đã tiến hành thử

nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồn

nitơ và cacbon khác nhau. Kết quả cho thấy trong các nguồn nitơ thử nghiệm thì

(NH₄)₂SO₄thích hợp nhất cho nấm Paecilomyces sp. phát triển, tạo bào tử chồi.

nhiều nghiên cứu về sản xuất nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện nuôi cấy lỏng

đã chỉ ra rằng để tối ưu hóa cho sản xuất tối đa sinh khối sợi nấm và exo –

polysaccharide của nấm Paecilomyces japonica. Kết quả cho thấy với thành phần

glucose 30g, 20 g cao nấm men, 0,5g KH₂PO₄và 0,1 g CuCl₂.2H₂O và 1 lít nước

cất được cho là môi trường tối ưu để sản xuất nấm Paecilomyces japonica ở nhiệt

độ 27 ⁰C sẽ cho sinh khối sợi nấm và lượng polysaccharide lần lượt là 23,1 g / l và

2,5 g / l (Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012). Nghiên

cứu của Li Gao (2015) báo cáo về tác động của các yếu tố dinh dưỡng và môi

trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối và bào tử nấm Paecilomyces lilacunus IPC

– P. Các yếu tố này bao gồm nguồn carbon và nitơ, tỷ lệ C / N, các khoáng chất và

vitamin cùng với nguồn nước, nhiệt độ, chu kỳ sáng / tối và độ pH. Các bào tử đã

được cấy trên môi trường cơ bản (sucrose 19.00 g / l, peptone đậu nành 4.06 g / l,

K₂HPO₄1,00 g / l, KCl 0.50 g / l, MgSO₄0.50 g / l, FeSO₄0,01 g / l, agar 13,00 g /

l) trong 4 ngày, trước khi được cấy chuyền qua môi trường hình thành bào tử

9

Đồ án tốt nghiệp

(dextrin 2.27 g / l, urê 2.13 g / l, CaCl₂3,00 g / l, ZnSO₄· 7H₂O 0,01 g / l, agar

13.00 g / l) cho thêm 4 ngày theo các điều kiện môi trường sau đây: -3,9 MPa / pH 7

/ ánh sáng 24 h / nhiệt độ 29 °C; những điều kiện đã được thay đổi để -0,3 MPa / pH

6 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 23 ° C để có được số lượng sinh khối tốt hơn. Số liệu

cung cấp thông tin về nhu cầu dinh dưỡng và môi trường của loại nấm này, đó sẽ là

điều cần thiết cho việc sản xuất chế phẩm thương mại của nó. Môi trường nuôi cấy

lỏng với nồng độ carbon khác nhau và tỷ lệ C / N đã được thử nghiệm để sản xuất

bào tử chịu khô hạn của Paecilomyces fumosoroseus. Trong khi tất cả các môi

trường được thử nghiệm hỗ trợ hình thành bào tử trong môi trường lỏng, nồng độ

bào tử cao (5,8 × 10⁸bào tử / ml) được sản xuất trong môi trường có chứa 80 g

glucose.l^-1và 13,2 g Casamino axit.l^-1(môi trường MS) và một tỷ lệ cao hơn đáng

kể (79 %) của các bào tử sống sót không khí khô. có chứa nồng độ glucose trong

môi trường lớn hơn 20 g / l và axit Casamino nồng độ từ 13,2 và 40 g / l hỗ trợ sản

xuất tối đa của bào tử chịu khô hạn. Tất cả 23 chủng nấm P. fumosoroseus phân lập

trong trong môi trường MS được sản xuất cho nồng độ cao của bào tử chịu khô hạn.

Khi bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, hơn 60 % số bào tử đông khô được sản xuất trong

môi trường MS vẫn còn hoạt tính sau khi bảo quản 7 tháng trong khi ít hơn 25 %

của bào tử khô trong không khí sống sót sau 90 ngày lưu trữ.

Hàng loạt các nghiên cứu về các loại cơ chất, thành phần môi trường để sản

xuất sinh khối nấm Paecilomyces sp. đã được thực hiện. S. Prabhu, S.Kumar và S.

Subranmanian (2008) nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus

trên môi trường lỏng để trừ trứng tuyến trùng. Thí nghiệm được thực hiện trên 4

loại môi trường Potato dextrose broth (PDB), môi trường Richards; 10 % Molasses

và môi trường Semi chọn lọc. Kết quả thí nghiệm cho thấy khối lượng sợi nấm đạt

cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (19,82g), tiếp theo là môi trường 10 %

Molasses (16.85 g). Khối lượng sợi nấm đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.5g). Sinh

khối sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (32.8 x 10⁷bào tử / g), tiếp

theo là môi trường 10% Molasses (28.8 x 10⁷bào tử / g). Bào tử đạt ít nhất ở môi

trường PDB (10.3 x 10⁷bào tử / g). Năm 2015, Zhen Yu, You – chi Zhang, Xiang

10