Khóa luận Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
TỐI ƯU HOÁ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CHỦNG Lactobacillus plantarum NT1.5
BẰNG PHƯƠNG PHÁP
QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH
SVTH : TRẦN THỊ KIỀU
MSSV : 1053012348
KHOÁ: 2010 – 2014
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Công nghệ
Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, cô thầy là người đã tận tình hướng dẫn,
tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em có thể hoàn thành tốt đề tài.
Chân thành cảm ơn các thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở
Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản làm
nền tảng để em có thể hoàn thành đề tài.
Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị
Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi là người đã truyền đạt những kinh
nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện đề
tài.
Xin cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi
sinh đã giúp đỡ, động viên em trong thời gian qua.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ
tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành tốt việc học tập của mình.
Chân thành cảm ơn!
Bình Dương, ngày tháng năm 2014
TRẦN THỊ KIỀU
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
i
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
Giới thiệu.................................................................................................5
LACTOBACILLUS ...................................................................................................10
Thí nghiệm sàng lọc ..............................................................................14
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU............................................................................24
Dụng cụ .................................................................................................24
Trang thiết bị ........................................................................................24
Hoạt hóa chủng .....................................................................................25
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
i
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman................................................................30
pháp leo dốc ..............................................................................................................32
hưởng chính. .............................................................................................................33
môi trường tối ưu......................................................................................................33
BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610.....................................................................35
PLANTARUM NT 1.5...............................................................................................36
Nguồn nitơ.............................................................................................39
Nguồn cacbon........................................................................................41
Nguồn khoáng .......................................................................................42
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
ii
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU..............................................................................57
4.1 KẾT LUẬN ....................................................................................................61
4.2 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 63
PHỤ LỤC................................................................................................................. 68
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
iii
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA
CFU
One-way analysis of variance
Colony forming unit
Cộng sự
Cs.
L. plantarum
MRS
Nm
Lactobacillus plantarum
Deman, Rogosa and Sharpe
nanomet
OD
Optical Density
P-B
Plackett-Burman
WHO
BSH
World Health Organization
Bile salt hydrolase
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
iv
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Streptococcus ......................................................................................6
Hình 1.2 Lactobacillus........................................................................................6
Behnken, 1960).................................................................................................20
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
v
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát..................................................................28
Bảng 3.2. Giá trị OD610 theo thời gian.............................................................36
giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát ...................................................................38
Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian................................................................57
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
i
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC ĐỒ THỊ
các cặp biến khác nhau....................................................................................55
cặp biến khác nhau ..........................................................................................56
trên môi trường tối ưu .....................................................................................58
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
ii
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cholesterol trong máu tăng làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ, một phần ba
bệnh tim thiếu máu cục bộ là do cholesterol cao. Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính
gây ra 2,6 triệu ca tử vong (4,5% của tổng số) và 29,7 triệu người gánh hậu quả. Tổng
số cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây bệnh tật ở cả các nước phát triển
và đang phát triển như là một yếu tố nguy cơ bệnh tim thiếu máu cục bộ và đột quỵ
(WHO, 2013).
Việc giảm cholesterol là vấn đề rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim
và cs., 2004). Một trong những giải pháp đó là nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa có hoạt
tính probiotic và vừa có hoạt tính làm giảm cholesterol là vấn đề thiết thực, được nhiều
nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu.
Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân
muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus…)
có tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005). Ngoài ra, vi khuẩn lactic
còn có khả năng giảm cholesterol bằng cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno,
2007).
Ngày nay việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa vi khuẩn probiotic như
Lactobacilli có tầm quan trọng ngày càng tăng. Những vi khuẩn này có tác dụng
kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và mang lại lợi ích sức khỏe cho
người tiêu dùng (Shahravy, 2012).
Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 đã được chứng minh có khả năng làm
giảm cholesterol thông qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào và khả năng sinh
enzym BSH đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH dạ dày, kháng
muối mật, kháng khuẩn,… (Dương Nhật Linh, 2013). Vì vậy Lactobacillus plantarum
NT1.5 có thể được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic có hoạt tính làm giảm
cholesterol.
Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học
ngày càng tăng. Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật
đang được quan tâm. Do đó, nghiên cứu phát triển môi trường nuôi cấy mới để tăng
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
cường sản xuất sinh khối có thể dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu quả kinh tế hơn
(Shahravy, 2012).
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng
Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”.
Nội dung thực hiện:
Xây dựng được biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế
bào tương ứng với từng giá trị OD.
Xây dựng đường cong tăng trưởng của chủng L. plantarum NT1.5, xác định thời
gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn.
Khảo sát nhiệt độ, pH tối ưu cho sự phát triển của chủng L. plantarum NT1.5
Chọn lựa nguồn cacbon, nitơ và các nguồn khoáng.
Xác định các yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình tăng sinh khối của
Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng thiết kế Plackett – Burman (P - B).
Xác định giá trị tối ưu của các thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy
bằng phương pháp Box-Behnken.
Nuôi cấy thử nghiệm.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC
1.1.1. Giới thiệu
Vi khuẩn lactic acid (LAB) là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên được ứng
dụng trong nhiều ngành công nghiệp, là một chế phẩm sinh học an toàn cho con người
(David, 2013).
Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được sắp xếp:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ I: Lactobacillaceae
Giống I: Lactobacillus
Giống II: Pediococcus
Họ II: Enterococceae
Giống: Enterococcus
Họ III: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Họ IV: Streptococcaceae
Giống I: Streptococcus
Giống II: Lactococcus
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không
sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm. Những vi
khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu, cho nên
chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic,
nhiều loại vitamin…, bình thường chúng không có cytochrome. Vì vậy, chúng được
xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu khí, có khả năng lên men
trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
5
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi trên niêm mạc ruột của người và
động vật. LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc,
Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005).
Trong đó tế bào của chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus,
Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus.
a
b
Hình 1.1 Streptococcus
a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử
b: Streptococcus nhuộm Gram
b
a
Hình 1.2 Lactobacillus
a: Lactobacillus dưới KHV điện tử
b:Lactobacillus nhuộm Gram
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
6
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Bifidobacteria cũng được xem là một chi của lactic acid bacteria do có cùng đặc
điểm tiêu biểu và cách thức lên men đường.
1.1.2. Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic
Sự phân loại giữa các chi của vi khuẩn lactic dựa trên hình thái, cách thức lên
men đường, sự phát triển ở những nhiệt độ khác nhau, cấu trúc của sản phẩm acid
lactic, khả năng chịu muối, chịu acid hoặc kiềm (Mascel, 2005).
LAB có hai con đường lên men đường chính (Mascel, 2005):
Glycolysis (Embden- Meyerhof- Parnas pathway): sản phẩm cuối cùng là acid
lactic hay còn gọi là con đường lên men lactic đồng hình.
Con đường 6- phosphogluconate/ phosphoketolase: sản phẩm của quá trình lên
men này ngoài acid lactic còn có ethanol, acetate và CO2 hay còn gọi là quá trình lên
men dị hình.
Dựa vào khả năng lên men đường người ta chia LAB thành LAB đồng hình và
LAB dị hình.
1.1.2.1 Lên men đồng hình
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình gần như chuyển hóa hoàn toàn đường chúng
sử dụng thành acid lactic. Trong điều kiện thừa glucose và oxy hạn chế lên men đồng
hình 1 mol glucose theo con đường chuyển hóa EMB (Embden – Meyerhoff – Parnas)
tạo 2 mol pyruvate. Sự cân bằng oxi hóa khử trong tế bào được duy trì thông qua các
quá trình oxi hóa của NADH, song song đó là sự khử pyruvat thành acid lactic. Các
phản ứng diễn ra trong phần nền tế bào chất. Các enzym đặc trưng trong quá trình này
là aldolase và triozophosphateisomerase. Glucose không phải là đường duy nhất có thể
được sử dụng. Với hệ thống enzym thích hợp, các loại đường khác có thể được chuyển
đổi thành glucose hoặc một trong những chất trung gian trong quá trình như glucose-
6-phosphate (hoặc trong trường hợp đường pentose, ribulose-5-phosphate). Khả năng
sử dụng các loại đường khác nhau ở vi khuẩn lactic thay đổi theo loài. Đại diện cho
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
7
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và
Lactobacillus nhóm I. (Desantis và cs., 1989)
1.1.2.2 Lên men dị hình
Lên men dị hình sử dụng con đường pentose phosphate, cách gọi khác là con
đường phosphoketolase pentose. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử
hydro thành 6- phosphogloconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử
CO2. Kết quả là pentose -5- phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate
(GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hóa thành lactate
như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất
trung gian là acetyl – CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối cùng (bao
gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với sản phẩm từ quá trình dị hóa một phân
tử glucose. Hai enzyme đặc trưng trong quá trình này là transketolase xúc tác chuyển
hóa nhóm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuyển hóa nhóm 3C. Quá trình này xảy ra
trong cytosol. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc oenococcus,
Weissella và Lactobacillus nhóm III. (Desantis và cs., 1989)
1.1.3. Tổng quan về Lactobacillus plantarum
1.1.3.1. Phân loại
Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plntarum được phân loại:
Giới (Kingdom): bacteria
Ngành (Division): Firmicutes
Lớp (Class): Bacilli
Loài: L. Plantarum
1.1.3.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobaciillus plantarum
Lactobacillus plantarum là một trong hơn 50 loài Lactobacillus. Lactobacillus
plantarum là vi khuẩn gram dương, catalase âm (Bujalence, 2006), hình trực không
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
8
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
sinh bào tử được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người và động vật. Vi khuẩn này lần
đầu tiên được tìm thấy trong nước bọt của con người. (Waugh và cs., 2009)
Lactobacillus plantarum là một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi cao, nó có
thể tồn tại ở phạm vi nhiệt độ rộng lớn (từ 1-600C) (Natural New, 2010), kị khí tùy
nghi. Trong chi Lactobacillus, L. Plantarum được xếp vào nhóm vi khuẩn lên men dị
hình, có thể sống trong nhiều môi trường như thịt, cá, sữa, các quá trình lên men thực
vật, thực vật và trong nhiều loại pho mát. (Kohajdová, 2012).
L. plantarum có nhiều điểm khác biệt so với các loài lactobacillus khác ở những
điểm sau:
- Có bộ gen tương đối lớn nên có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau
(Kleerebezem và cs., 2003)
- Có thể lên men nhiều loại đường.
-Thích nghi cao với điều kiện acid, chịu pH thấp (Daeschel và Nes 1995).
- Có thể chuyển hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs.,
2001), phân giải muối tanat nhờ hoạt động của enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004).
Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013)
1.1.3.3. Lợi ích của vi khuẩn L. plantarum
Lactobacillus plantarum có nhiều trong nước bọt và đường tiêu hóa của con
người. Nó thường được sử dụng trong các quá trình lên men thực phẩm và làm
probiotic. Các chế phẩm sinh học sử dụng L. plantarum ngày càng được công nhận trên
thị trường.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
9
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
L. plantarum có thể nâng cao tính toàn vẹn ruột, hoạt động trao đổi chất của các
tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen và cs., 2009).
Giảm thiểu một số triệu chứng rối loạn tiêu hóa khi điều trị bằng kháng sinh
(Lonnermark và cs., 2009).
Theo nghiên cứu của nhóm Karlsson và cộng sự (2009) được tiến hành ở Thụy
Điển cho thấy uống trực tiếp L. plantarum có thể tăng tính đa dạng của hệ vi sinh vật ở
ruột kết.
Bảo vệ tế bào biểu mô khỏi sự gây hại của E. coli bằng cách thay đổi hình thái tế
bào chủ, giảm hình thành tổn thương, tăng sức đề kháng và khả năng thẩm thấu đơn
lớp phân tử (Qin và cs., 2009).
1.2.
LACTOBACILLUS
Các nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã và đang được triển khai rộng rãi trên toàn
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ
thế giới, trong đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Lactobacillus. Tuy nhiên ở
Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn lactic còn quá khiêm tốn và có rất ít
công trình nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus. Phần lớn các
nghiên cứu về Lactobacillus ở trong nước chỉ là nghiên cứu cơ bản về nhóm vi khuẩn
này như ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống có hoạt tính tốt để làm
probiotic.
1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Năm 2012, Hu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi
cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nông nghiệp có giá thành
thấp như bột đậu nành, bột ngô, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh dưỡng, từ
đó làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mô lớn.
Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa các yếu tố
dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, muối khoáng và các yếu tố tăng trưởng (vitamin
B, axit amin) khi dùng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng sinh khối vi khuẩn
Lactobacillus rhamnosus PEN.
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
10
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Năm 2006, Altaf và cộng sự đã tối ưu hóa môi trường thu acid lactic cho chủng
Lactobacillus amylophilus GV6 bằng cách sử dụng các nguồn cacbon, nitơ rẻ tiền như:
bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho pepton, glucose trong môi trường MRS bằng
phương pháp Plackett-Burman và đáp ứng bề mặt (RSM). Kết quả cho thấy
Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% và năng suất 96% (g acid
lactic/ g tinh bột được sử dụng).
Farooq và cộng sự (2012) đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của quá trình sản
xuất đường mía) làm nguồn cacbon trong môi trường tối ưu thu sinh khối của vi khuẩn
Lactobacillus delbrueckii.
Năm 1995, Oh và cộng sự đã công bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton,
cao nấm men, glucose, nhiệt độ nuôi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei
YIT 9018. Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.casei
YIT 9018 như sau: trypton, 3,04%; cao nấm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhiệt độ
nuôi cấy là 35oC.
Năm 2006, Zhong đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Lactobacillus casei LC2W bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng cường sản xuất
exopolysaccharid. Kết quả tối ưu các điều kiện nuôi cấy để sản xuất exopolysaccharid:
nhiệt độ nuôi cấy là 32,5°C và thời gian nuôi là 26 giờ.
1.2.2. Các nghiên cứu trong nước
Năm 1996, Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự đã công bố nghiên cứu về môi trường
nuôi vi khuẩn lactic tốt nhất. Môi trường đó là sữa gầy hoàn nguyên với thời gian lên
men tốt nhất là 18-20 giờ, bổ sung giống 2-3%.
Trong công bố nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2003 đã sử
dụng hai chủng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế
phẩm probiotic. Tìm ra được ba môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bifidobacteria
bifidum là môi trường thyoglycolat, môi trường nước chiết gan, môi trường nước chiết
thịt bò ở điều kiện nuôi cấy kỵ khí. Môi trường thích hợp cho L. acidophilus là môi
SVTH: TRẦN THỊ KIỀU
11
Tải về để xem bản đầy đủ
86 trang
29/03/2022
8380
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Khóa luận Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- khoa_luan_toi_uu_hoa_moi_truong_nuoi_cay_chung_lactobacillus.pdf
