Luận án Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
QUÁCH VĂN CAO THI
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC VÀ CƠ CHẾ
ĐA KHÁNG THUỐC CỦA HAI LOÀI VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI
THÂM CANH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07
CẦN THƠ, 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
QUÁCH VĂN CAO THI
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC VÀ CƠ CHẾ
ĐA KHÁNG THUỐC CỦA HAI LOÀI VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI
THÂM CANH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. TỪ THANH DUNG
CẦN THƠ, 2017
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án “Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa
kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas
hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi
thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long” là công trình nghiên cứu của tôi
với sự hướng dẫn của PGS.TS. Từ Thanh Dung. Các số liệu và kết quả trình
bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được người khác công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
TÁC GIẢ LUẬN ÁN
NCS. QUÁCH VĂN CAO THI
i
LỜI CÁM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Cô PGS.TS. Từ Thanh Dung đã dành nhiều thời gian, công sức và tận
tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và theo học tại trường.
Thầy PGS.TS. Trần Nhân Dũng đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi nhất cho việc nghiên cứu và học tập tại Viện.
Cô PGS.TS. Trần Thị Tuyết Hoa, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa
Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình hướng dẫn chuyên đề nghiên
cứu sinh.
Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu trường Cao đẳng
Cộng đồng Vĩnh Long; Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học và
Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ; quý Thầy/Cô và các Anh/Chị phòng
Thanh tra và Pháp chế đã sắp xếp công việc cũng như tạo điều kiện thuận lợi
về thời gian để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập đúng tiến độ.
Cảm ơn các hộ nuôi cá tra ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long đã cung
cấp mẫu cá bệnh để phân lập vi khuẩn.
Chân thành biết ơn anh Trần Văn Bé Năm (phòng Sinh học phân tử, Viện
NC&PT Công nghệ Sinh học); em Nguyễn Bảo Trung và quý Thầy/Cô quản
lý các phòng Thí nghiệm của Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản đã
hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận án.
Vô cùng biết ơn anh Trần Duy Phương (Công ty Pharmaq Việt Nam, chi
nhánh Đồng Tháp) đã cung cấp cá tra giống sạch bệnh cho các thí nghiệm cảm
nhiễm. Cảm ơn các Anh/Chị nghiên cứu sinh khóa 2012; sự hỗ trợ tích cực
của các em học viên cao học: Huỳnh Thị Diễm Trang và Trần Tiến Lực và các
em sinh viên: Đặng Phạm Hòa Hiệp, Trần Minh Khá, Hồ Văn To, Dương
Thanh Quy, Lâm Cẩm Oanh, Bùi Thụy Hạnh Nguyên, Nguyễn Lâm Viên, Võ
Trung Hiếu, Trần Quốc Hảo, Thị Mỹ Hạnh và Nguyễn Thị Hoa Đăng.
Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đóng
góp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, những người luôn ủng hộ,
động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập.
Chân thành cám ơn./.
NCS. QUÁCH VĂN CAO THI
ii
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định các đặc điểm bệnh học
cảm nhiễm kép (coinfection/super infection/concurrent infection/dual infection
hay mixed infection) và cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi thâm
canh ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Bằng các kỹ thuật sinh hóa
truyền thống (bao gồm bộ kít API 20E) và sinh học phân tử (PCR và giải trình
tự gen), đề tài đã phân lập và định danh được 141 chủng vi khuẩn (gồm 67
chủng vi khuẩn E. ictaluri và 74 chủng vi khuẩn A. hydrophila) từ các mẫu cá
tra bệnh gan thận mủ (GTM) và bệnh xuất huyết (XH). Trong số các chủng vi
khuẩn phân lập được thì có 22/67 (chiếm 32,84%) chủng E. ictaluri và 22/74
(chiếm 29,73%) chủng A. hydrophila có nguồn gốc từ cá tra nhiễm kép 2 loại
bệnh này. Kết quả giải trình tự gen cho thấy các chủng vi khuẩn E. ictaluri và
A. hydrophila phân lập có tỷ lệ tương đồng với các chủng vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila trên ngân hàng GenBank dao động từ 99-100% và 98-100%.
Kết quả thí nghiệm xác định độc lực và khả năng gây bệnh của các chủng
vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila với mật số tiêm vi khuẩn từ 102 đến 106
CFU/cá cho thấy cá tra sau khi cảm nhiễm có dấu hiệu biểu hiện bệnh đặc
trưng của 2 loài vi khuẩn. Các đốm trắng nhỏ li ti xuất hiện trên các cơ quan
như gan, thận và tỳ tạng của cá tra cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri; trong
khi đó các dấu hiệu của bệnh XH do vi khuẩn A. hydrophila gồm mắt lồi, các
đốm XH xuất hiện quanh các vây, miệng, hậu môn và trong xoang bụng cá
bệnh thường có dịch màu hồng. Qua kết quả thí nghiệm cũng đã xác định
được độc lực và liều gây chết LD50 của 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri 1ED3,
3ED3, 8ED3 và 10ED3 lần lượt là 1,58x104, 1,23x105, 1,67x104 và 1,19x105
CFU/mL, trong khi độc lực và liều gây chết LD50 của 4 chủng vi khuẩn A.
hydrophila 1A3, 2A3, 4A3 và 5A3 lần lượt là 1,47x104, 2,37x103, 1,29x103 và
1,52 x104 CFU/mL.
Hai chủng 1ED3 và 4A3 có độc lực cao nhất trong thí nghiệm trên được
chọn gây cảm nhiễm kép trên cá tra bằng phương pháp ngâm và tiêm. Kết quả
thí nghiệm cho thấy việc cảm nhiễm kết hợp 2 chủng vi khuẩn này đã làm gia
tăng độc lực gây bệnh của vi khuẩn. Bệnh bộc phát mạnh với tỷ lệ cá chết ở
các nghiệm thức (NT) nhiễm kép (tỷ lệ cá chết tích lũy dao động từ 80% đến
93,33%) cao hơn có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) so với phương pháp cảm
nhiễm đơn. Thời gian vi khuẩn gây cá chết trong NT ngâm kép là 12 giờ, sớm
hơn so với NT ngâm đơn 2 chủng 1ED3 và 4A3 lần lượt là 96 giờ và 36 giờ.
Cá nhiễm kép trong nghiên cứu có các dấu hiệu bệnh tương tự với các dấu
hiệu bệnh của cá nhiễm kép ngoài tự nhiên và chủ yếu là các dấu hiệu kết hợp
của 2 loại bệnh này. Cá nhiễm kép thường có các dấu hiệu như mắt lồi, các
đốm XH xuất hiện quanh các vây, miệng, hậu môn, dịch màu hồng trong
xoang bụng và các đốm trắng nhỏ li ti xuất hiện trên các cơ quan như gan, thận
iii
và tỳ tạng. Ngoài ra, kết quả nhuộm Haematoxylin và Eosin (H&E) cho thấy
có sự biến đổi cấu trúc tế bào và vùng mô của các cơ quan như gan, thận và tỳ
tạng với các hiện tượng thường xuất hiện như sung huyết, XH và hoại tử mất
cấu trúc. Tuy nhiên, cấu trúc tế bào và vùng mô ở các mẫu da-cơ và mang của
cá nhiễm kép không hoặc ít bị biến đổi trong thời gian theo dõi thí nghiệm.
Kết quả thực hiện kháng sinh đồ trên 67 chủng E. ictaluri và 74 chủng A.
hydrophila cho thấy vi khuẩn E. ictaluri đã kháng hầu hết các kháng sinh với
tỷ lệ cao như chloramphenicol (94,03%), florfenicol (94,03%), tetracycline
(92,54%), streptomycin (74,63%), enrofloxacin (71,64%), gentamicin
(46,27%) và norfloxacin (46,27%). Trong khi đó, vi khuẩn A. hydrophila
kháng hoàn toàn và kháng cao với với các kháng sinh như ampicillin (100%),
amoxicillin (100%), cefalexin (100%), tetracycline (90,54%), florfenicol
(60,81%) và neomycin (54,05%). Đặc biệt, qua kết quả nghiên cứu cho thấy
tất cả các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila phân lập được đều thể
hiện tính đa kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh. Ngoài ra, kết quả luận án
cũng cho thấy các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trong nghiên
cứu thường xuyên tiếp xúc với kháng sinh trong môi trường nuôi cá tra với chỉ
số đa kháng (MAR) ở các địa điểm thu mẫu đều lớn hơn 0,2.
Nghiên cứu đã xác định các yếu tố di truyền liên quan đến cơ chế đa
kháng thuốc của vi khuẩn như sự hiện diện của các integron nhóm 1 ở 2 loài vi
khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri với tỷ lệ lần lượt là 51,35% và 35,82%. Sử
dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, luận án đã xác định nhiều vùng gen
cassette mã hóa cho các enzyme dihydrofolate reductase, aminoglycoside
adenyltransferase, aminoglycoside N(6')-acetyltransferase và β-lactamase
kháng lại nhiều loại kháng sinh khác nhau ở 2 loài vi khuẩn A. hydrophila và
E. ictaluri. Ngoài ra, sự hiện diện của các gen kháng tetracyline như tetA,
tetB,, tetC, tetG, tetK và tetS đã được phát hiện ở 2 loài vi khuẩn A.
hydrophila và E. ictaluri với tỷ lệ lần lượt là 82,5%, 8,75%, 31,25%, 33,75%,
8,75% và 7,5%; trong khi tần số xuất hiện các gen kháng florfenicol là 72,5%
và 87,5%. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn A. hydrophila
và E. ictaluri có khả năng truyền gen kháng thuốc của chúng sang vi khuẩn E.
coli trong môi trường ao nuôi cá tra. Tuy nhiên, giữa các chủng vi khuẩn A.
hydrophila và E. ictaluri không có khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng
thuốc cho nhau.
Từ khóa: Aeromonas hydrophila, cá tra, Edwardsiella ictaluri, integron, sự
kháng thuốc.
iv
SUMMARY
This study was carried out to determine the experimentally pathological
characteristics of coinfected fish and identify the molecular elements related to
mechanism of multiple antimicrobial resistance in E. ictaluri and A.
hydrophila cause diseases on intensively cultured striped catfish in the
Mekong Delta. By using conventional biochemical tests (including the API
20E identification kit) and molecular biology techniques (PCR and gene
sequencing), total of 141 strains of E. ictaluri and A. hydrophila from bacillary
necrosis of Pangasius and hemorrhagic infected fish samples were isolated
and identified. In which, there were 67 E. ictaluri and 74 A. hydrophila strains.
Among these, there were 22/67 (32.84%) strains of E. ictaluri and 22/74
(29.73%) strains of A. hydrophila recovered from fish samples infected by
both diseases. The gene sequencing results showed that the similarity of
isolated bacterial sequence with the reference sequences in the GenBank
ranged from 99 to 100% for E. ictaluri and from 98 to 100% for A. hydrophila
strains.
The virulence and pathogenicity of E. ictaluri and A. hydrophila strains
were evaluated by intraperitoneal injection with 0.1 mL/fish at bacterial
densities from 102 to 106 CFU/fish. The results showed that the moribund fish
displayed typical clinical signs of single bacterial infection. Tiny white spots
appeared on internal organs such as livers, kidneys and spleens of fish exposed
to E. ictaluri. Meanwhile, the exophthalmic eyes and petechial spots appeared
around the fins, mouth, anus and pinkish fluid in abdominal cavity were also
recorded in hemorrhagic disease infected fish by A. hydrophila. The virulence
and LD50 values of four strains of E. ictaluri (1ED3, 3ED3, 8ED3 and 10ED3)
were 1.58x104, 1.23x105, 1.67x104, and 1.19x105 CFU/mL, respectively; while
the virulence and LD50 values of four strains of A. hydrophila (1A3, 2A3, 4A3
and 5A3) were 1.47x104, 2.37x103, 1.29x103 and 1.52x104 CFU/mL,
respectively.
Two isolates (1ED3 and 4A3) with the highest virulence were chosen to
conduct coinfection experiments by immersion and injection methods. The
results indicated that concurrent infection of two bacterial species significantly
increased the virulence of bacteria, compared to single bacterial infection.
Severe disease outbreak with high mortality was also observed in dual-
infection experiment (cumulative mortality percentage in concurrent infection
test ranged from 80% to 93.33%), which were statistically significantly higher
than single injection. The duration that caused fish mortality in the mixed
infection test using immersion method was 12 hours which was shorter than
single infection by separate immersion of 1ED3 (96 hours) and 4A3 (36
hours). The clinical and gross signs of experimentally co-infected fish were
similar to those of natural co-infected fish. The typical signs of diseased fish
included bulging eyes, petechial hemorrhages around the fins, mouth, anus,
v
and pinkish fluid in abdominal cavity and tiny white spots in the internal
organs such as livers, kidneys, and spleens. Additionally, Haematoxylin and
Eosin (H&E) staining results also showed histopathological changes in tissues
of organs such as the livers, kidneys and spleens with the phenomenon of
congestion, hemorrhage and structural lose necrosis. However, the structural
changes strongly took place in the liver, kidney and spleen tissues, whereas
muscles-skins and gills of infected fish were significantly not or less affected
through the whole experiment.
The antimicrobial susceptibility testing results of 67 strains of E. ictaluri
and 74 strains of A. hydrophila displayed that most of E. ictaluri strains were
relatively highly resistant to chloramphenicol (94.03%), florfenicol (94.03%),
tetracycline (92.54%), streptomycin (74.63%), enrofloxacin (71.64%),
gentamicin (46.27%) and norfloxacin (46.27%). Meanwhile, A. hydrophila
was relatively high resistant to tetracycline (90.54%), florfenicol (60.81%) and
neomycin (54.05%) and completely resistant to ampicillin, amoxicillin,
cefalexin and trimethoprim/sulfamethoxazole. Particularly, all of two bacterial
strains in this study expressed multiple drug resistance. Besides, this research
found that the bacterial strains frequently exposed to antibiotics had the MAR
index (multiple antibiotic resistance) greater than 0.2 in all sampling sites.
This study detected genetic elements related to the mechanisms of multi-
drug resistance of E. ictaluri and A. hydrophila such as the presence of class 1
integrons with the ratio of 51.35% and 35.82%, respectively. Using PCR
technique and gene sequencing, the study identified many different gene
cassette regions encoding to dihydrofolate reductase, aminoglycoside
adenyltransferase, aminoglycoside N(6')-acetyltransferase and β-lactamase
enzymes resistant to different antibiotics in both bacterial species.
Furthermore, this research found the presence of tetracycline resistance genes
such as tetA, tetB, tetC, tetG, tetK and tetS of two bacterial species with the
ratio of 82.5%, 8.75%, 31.25%, 33.75%, 8.75% and 7.5%, respectively; while
the frequency of occurrence of florfenicol resistance gene in A. hydrophila and
E. ictaluri was 72.5% and 87.5%, respectively. Besides, this study
demonstrated that A. hydrophila and E. ictaluri strains were capable of
transferring their resistance genes into E. coli collected from catfish aquatic
environment. However, conjugation and transferability of drug resistance
genes between A. hydrophila and E. ictaluri were not found in this research.
Keywords: Aeromonas hydrophila, antibiotic resistance, Edwardsiella
ictaluri, integron, striped catfish.
vi
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN ........................................................................................................ ii
TÓM TẮT ............................................................................................................. iii
SUMMARY.............................................................................................................v
MỤC LỤC ............................................................................................................ vii
DANH SÁCH BẢNG..............................................................................................x
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................. xi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................... xiv
Chương I. GIỚI THIỆU ........................................................................................1
1.1 Tính cấp thiết của luận án...................................................................................1
1.2 Mục tiêu của luận án ..........................................................................................3
1.3 Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................3
1.4 Phạm vi nghiên cứu và giới hạn của luận án......................................................3
1.5 Những đóng góp mới của luận án ......................................................................4
1.6 Ý nghĩa thực tiễn của luận án.............................................................................5
Chương II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..................................................................6
2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra nuôi ở ĐBSCL .........................................6
2.2 Một số bệnh thường gặp trên cá tra nuôi thâm canh ở ĐBSCL .........................7
2.2.1 Bệnh do KST ..........................................................................................7
2.2.2 Bệnh do tác nhân vi khuẩn......................................................................8
2.2.3 Bệnh do vi nấm.....................................................................................18
2.2.4 Các bệnh không truyền nhiễm ..............................................................19
2.3 Các nghiên cứu độc lực vi khuẩn nhiễm kép....................................................19
2.4 Các biện pháp kiểm soát bệnh do vi khuẩn trên cá tra nuôi ở ĐBSCL............20
2.5 Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh................................................21
2.5.1 Kháng sinh và sự kháng thuốc của vi khuẩn ........................................21
2.5.2 Cơ chế tác động của kháng sinh ...........................................................22
2.5.3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn.........................................................23
2.6 Sự kháng thuốc của vi khuẩn trong NTTS .......................................................24
2.6.1 Sự kháng thuốc của vi khuẩn E. ictaluri...............................................25
2.6.2 Sự kháng thuốc của vi khuẩn A. hydrophila.........................................26
2.7 Hiện tượng và cơ chế đa kháng thuốc của vi khuẩn.........................................27
2.8 Các yếu tố di truyền vận động liên quan đến sự kháng thuốc của vi khuẩn ....28
2.8.1 Plasmid..................................................................................................28
2.8.2 Các integron..........................................................................................29
vii
2.9 Hiện tượng trao đổi gen kháng thuốc giữa các loài vi khuẩn
trong tự nhiên.................................................................................................32
2.9.1 Các quá trình tiếp hợp và trao đổi gen kháng thuốc của vi khuẩn........32
2.9.2 Các kết quả nghiên cứu liên quan đến khả năng truyền gen kháng
thuốc giữa nhóm vi khuẩn gây bệnh ở ĐVTS và vi khuẩn E. coli ................33
2.10 Sự kháng tetracycline của vi khuẩn................................................................35
2.10.1 Tổng quan về kháng sinh nhóm tetracycline ......................................35
2.10.2 Cơ chế hoạt động của kháng sinh nhóm tetracycline .........................35
2.10.3 Cơ chế kháng tetracycline của vi khuẩn .............................................35
2.11 Sự kháng florfenicol của vi khuẩn..................................................................37
2.11.1 Tổng quan về kháng sinh nhóm phenicol ...........................................37
2.11.2 Cơ chế hoạt động của kháng sinh nhóm phenicol ..............................38
2.11.3 Cơ chế kháng florfenicol của vi khuẩn...............................................38
Chương III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............39
3.1 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................39
3.2 Phương tiện nghiên cứu....................................................................................39
3.2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm.........................................................39
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm..............................................................39
3.2.3 Môi trường và hóa chất thí nghiệm.......................................................40
3.2.4 Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................42
3.3 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................42
3.3.1 Địa điểm và phương pháp thu mẫu cá tra bệnh ....................................42
3.3.2 Phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila...............43
3.3.3 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila.............................................................................................46
3.3.4 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học cảm nhiễm kép 2 loài vi khuẩn
E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra ..........................................................48
3.3.5 Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn
E. ictaluri và vi khuẩn A. hydrophila.............................................................51
3.3.6 Xác định các đặc điểm phân tử liên quan đến sự đa kháng thuốc ở
2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila..................................................53
3.3.7 Thành phần chung cho các phản ứng PCR...........................................59
3.3.8 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu................................................59
Chương IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................60
4.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn ..........................................................60
4.1.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri .............................60
4.1.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn A. hydrophila......................605
4.1.3 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn E. coli ...................................71
4.2 Kết quả cảm nhiễm cá tra với vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila...............72
viii
4.2.1 Kết quả cảm nhiễm cá tra với các chủng vi khuẩn E. ictaluri..............72
4.2.2 Kết quả cảm nhiễm cá tra với các chủng vi khuẩn A. hydrophila .....728
4.3 Đặc điểm bệnh học cảm nhiễm kép 2 loài vi khuẩn A. hydrophila
và E. ictaluri trên cá tra .................................................................................83
4.3.1 Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn..........................................83
4.3.2 Dấu hiệu bệnh lý của cá bệnh ...............................................................84
4.3.3 Khả năng gây bệnh khi gây cảm nhiễm kép 2 loài vi khuẩn ................86
4.3.4 Kết quả quan sát mẫu bằng phết kính tiêu bản tươi..............................90
4.3.5 Biến đổi cấu trúc mô của 1 số cơ quan cá bệnh....................................91
4. 4 Tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila............98
4.4.1 Sự kháng thuốc của vi khuẩn của vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila.............................................................................................98
4.4.2 Sự đa kháng thuốc của vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila ............104
4.4.3 Các kiểu hình đa kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila...........................................................................................106
4.4.4 Chỉ số đa kháng thuốc MAR của vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila...........................................................................................107
4.5 Sự hiện diện các integron nhóm 1, 2 và 3 ở vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila...........................................................................................109
4.5.1 Sự hiện diện các integron nhóm 1, 2 và 3...........................................109
4.5.2 Đặc điểm vùng gen cassette của các chủng E. ictaluri và A. hydrophila
dương tính với integron nhóm 1 ..................................................................118
4.5.3 Khảo sát vùng 3’-conserved segment (CS) của các
integron nhóm 1...........................................................................................123
4.6 Sự hiện diện của các gen kháng florfenicol và tetracycline ở
2 loài vi khuẩn..............................................................................................126
4.6.1 Sự hiện diện của các gen kháng tetracycline ở vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila...........................................................................................126
4.6.2 Sự hiện diện của các gen kháng florfenicol ở vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila...........................................................................................135
4.7 Sự hiện diện của các plasmid ở vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila ..........136
4.7.1 Sự hiện diện của các plasmid ở vi khuẩn E. ictaluri ..........................137
4.7.2 Sự hiện diện của các plasmid ở vi khuẩn A. hydrophila.....................137
4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng tiếp hợp và trao đổi gen
kháng thuốc của các vi khuẩn......................................................................141
Chương V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................145
5.1 Kết luận ..........................................................................................................145
5.2 Đề nghị ...........................................................................................................146
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................147
PHỤ LỤC ............................................................................................................175
ix
DANH SÁCH BẢNG
Trang
E. ictaluri .........................................................................................................9
A. hydrophila .................................................................................................13
trên thế giới....................................................................................................22
Bảng 2.4: Các gen kháng đáp ứng tetracycline ......................................................37
Bảng 3.3: Các đoạn mồi và điều kiện phản ứng PCR xác định các gen kháng
tetracycline và florfenicol ở vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila.............578
ở 1 số tỉnh ĐBSCL.......................................................................................108
của vi khuẩn E. ictaluri................................................................................112
vi khuẩn trên ngân hàng NCBI ....................................................................120
A. hydrophila ...............................................................................................140
sau khi tiếp hợp............................................................................................143
x
DANH SÁCH HÌNH
Trang
giai đoạn 1997-2014 ........................................................................................7
vào vật chủ qua vết thương............................................................................16
vi khuẩn..........................................................................................................23
Hình 2.6: Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn...........................................................25
các gen cassette của integron.........................................................................30
Hình 4.2: Kết quả định danh vi khuẩn E. ictaluri phân lập được
bằng bộ kít API 20E.....................................................................................652
bằng bộ kít API 20E.......................................................................................67
xi
cảm nhiễm trên cá tra.....................................................................................73
E. ictaluri chủng 1ED3. .................................................................................75
vi khuẩn E. ictaluri. .......................................................................................76
A. hydrophila chủng 4A3...............................................................................80
các chủng vi khuẩn A. hydrophila. ................................................................81
với các kháng sinh .........................................................................................99
với các loại kháng sinh ................................................................................100
đối với các loại kháng sinh. .........................................................................101
xii
và A. hydrophila...........................................................................................106
và E. ictaluri. ...............................................................................................111
A. hydrophila và E. ictaluri. ........................................................................116
với các integron nhóm 1. .............................................................................118
với các integron nhóm 1. .............................................................................119
A. hydrophila và E. ictaluri. ........................................................................127
A. hydrophila và E. ictaluri .........................................................................127
A. hydrophila và E. ictaluri .........................................................................127
A. hydrophila và E. ictaluri. ........................................................................128
A. hydrophila và E. ictaluri. ........................................................................128
A. hydrophila và E. ictaluri. ........................................................................128
với vi khuẩn E. coli......................................................................................142
xiii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A. hydrophila
ADH
ADN
AMO
AMP
AMY
ARA
BHIA
BHIB
BKD
Aeromonas hydrophila
Arginine hidrolate
Acid deoxyribonucleic
Amoxicillin
Ampicillin
Amygdalin
Arabinose
Brain heart infusion agar
Brain heart infusion broth
Basic Local Alignment Search Tool
Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Bacillary Necrosis of Pangasius
Base pairs
BLAST
BNN-PTNT
BNP
Bp
CFL
Cefalexin
CFU
CIP
Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)
Ciprofloxacin
CIT
Sodium citrate
CLSI
CTAB
CTX
Clinical and Laboratory Standards Institute
Cetyl trimethyl ammonium bromide
Cefotaxime
ĐBSCL
ĐHCT
dNTPs
DOX
ĐVTS
E. coli
E. ictaluri
EIM
Đồng bằng sông Cửu Long
Đại học Cần Thơ
Deoxyribonucleotide triphosphate
Doxycycline
Động vật thủy sản
Escherichia coli
Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella ictaluri medium
Enrofloxacin
ENR
ESC
EtBr
Enteric Septicemia of Catfish
Ethidium bromide
EUS
FFC
Epizootic ulcerative syndrome (hội chứng/bệnh lở loét)
Florfenicol
GEL
Gelatin
GEN
Gentamicin
GLU
Glucose
GTM
H&E
H2S
Gan thận mủ
Haematoxyline và Eosin
Hydrogen sulfide
CHL
Chloramphenicol
IND
Indole
INO
Inositol
xiv
Kbp
Kilobase pairs
KST
LD50
LDC
MAN
MAR
MAS
Ký sinh trùng
Lethal dose, 50% (liều gây chết 50)
Lysine decarboxylate
Mannitol
Multiple antibiotic resistance index (chỉ số đa kháng)
Motile aeromonad septicaemia (nhiễm trùng huyết do
nhóm Aeromonas di động)
MCK
MEL
MHA
MIC
MacConkey agar
Melibiose
Muller-Hinton agar
Minimal inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối
thiểu)
NB
Nutrient broth
NBF
Neutral buffer formalin (dung dịch đệm formol trung
tính)
NCBI
NEO
NOR
NT
National Center for Biotechnology Information
Neomycin
Norfloxacin
Nghiệm thức
NTTS
ODC
ONPG
PCR
RHA
SAC
SDS
SEM
SOR
STR
Nuôi trồng thủy sản
Ornithine decarboxylate
Ortho-nitrophenyl galactosidase
Polymerase chain reaction (phản ứng PCR)
Rhamnose
Sucrose
Sodium dodecyl sulfate
Scanning Electron Microscope
Sorbitol
Streptomycin
SXT
TDA
TET
Trimethoprim/sulfamethoxazole
Tryptophane deaminase
Tetracycline
THIO
TSA
URE
VASEP
VP
Thioglycollate
Tryptic soy agar
Urease
Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam
Voges-Proskauer
XH
Xuất huyết
xv
Chương I. GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là 1 trong những loài cá da trơn
nước ngọt có giá trị kinh tế cao được nuôi phổ biến ở ĐBSCL (Phan et al.,
2009). Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc sản xuất và tiêu thụ cá tra
đang phải đối mặt với nhiều khó khăn và thách thức do giá cả bấp bênh, thị
trường xuất khẩu không ổn định và việc thâm canh hóa với mật số nuôi cao đã
làm cho bệnh trên cá xảy ra thường xuyên hơn (Dung et al., 2008; Le and
Cheong, 2010). Nhiều tác nhân gây bệnh (chủ yếu là các bệnh do vi khuẩn và
ký sinh trùng (KST) xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL đã được báo cáo
(Crumlish et al., 2002; Dung et al., 2008; Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv., 2008;
Ly et al., 2009; Nguyễn Thị Thu Hằng và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2012; Từ
Thanh Dung và ctv., 2012). Đặc biệt, các kết quả nghiên cứu gần đây đã xác
định 2 loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá
tra là bệnh GTM do vi khuẩn E. ictaluri (Crumlish et al., 2002; Từ Thanh
Dung và ctv., 2004) và bệnh XH do vi khuẩn A. hydrophila (Ly et al., 2009;
Crumlish et al., 2010). Đây là 2 bệnh có thể xảy ra trên cá tra ở tất cả các giai
đoạn nuôi với tỷ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Từ Thanh Dung và ctv., 2015).
Cho đến nay, kháng sinh vẫn là giải pháp chủ yếu để kiểm soát 2 bệnh
này. Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh (Nguyễn Chính,
2005; Nguyễn Quốc Thịnh và ctv., 2014; Phu et al., 2015) là 1 thách thức
không nhỏ đang đặt ra cho nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL do nhiều báo cáo cho
thấy việc tồn dư của kháng sinh trong thực phẩm và vấn đề kháng thuốc của vi
khuẩn (Cabello, 2006; Sarter et al., 2007; Akinbowale et al., 2007). Các
nghiên cứu gần đây cho thấy 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila gây
bệnh trên cá tra đã kháng với nhiều loại kháng sinh sử dụng trong nuôi trồng
thủy sản (NTTS) (Crumlish et al., 2002; Dung et al., 2008; Từ Thanh Dung và
ctv., 2010). Ngoài ra, vi khuẩn kháng thuốc có thể là nguồn để truyền và phát
tán các gen kháng thuốc của chúng cho các loài vi khuẩn khác (van Elsas and
Bailey, 2002; Heuer et al., 2009; Aminov, 2011; Marshall and Levy, 2011;
Van Meervenne et al., 2012), đặc biệt là các loài vi khuẩn có tiềm năng, nguy
cơ gây bệnh cho con người như vi khuẩn Escherichia coli, Aeromonas sp. và
2014). Điều này có thể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khỏe người
tiêu dùng.
1
Bên cạnh đó, người nuôi còn sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh (Phu
et al., 2015) để điều trị bệnh trên cá tra dẫn đến hiện tượng đa kháng thuốc
(multi-drug resistance/multiple antibiotic resistance) của vi khuẩn (kháng ít
nhất 2 hoặc 3 loại kháng sinh trở lên) (McPhearson et al., 1991; DePaola et
al., 1995; Sarter et al., 2007). Kết quả nghiên cứu của Dung et al. (2008) đã
xác định 73% vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh biểu hiện sự đa
kháng thuốc. Trong khi đó, nghiên cứu của Phạm Thanh Hương và ctv. (2010)
cho thấy có đến 96% vi khuẩn E. ictaluri và 23% vi khuẩn A. hydrophila thể
hiện sự đa kháng. Hậu quả của trình trạng vi khuẩn đa kháng thuốc dẫn đến
việc điều trị trở nên khó khăn và kém hiệu quả do liều lượng kháng sinh sử
dụng tăng và thời gian điều trị kéo dài hơn (Phu et al., 2015).
Đặc biệt, trong vài năm trở lại đây hiện tượng nhiễm kép xuất hiện rất
phổ biến trên các động vật thủy sản (ĐVTS): vật chủ bị nhiễm 2 hay nhiều tác
nhân gây bệnh khác nhau và mỗi tác nhân cùng ảnh hưởng có hại đến vật chủ
(Bakaletz, 2004; Kotob et al., 2016). Trên cá tra nuôi ở ĐBSCL thì hiện tượng
nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila đã gây nhiều thiệt hại
và tổn thất cho người nuôi do tỷ lệ cá chết cao đã được Crumlish and Dung
(2002) ghi nhận. Kết quả nghiên cứu của Nusbaum and Morrison (2002) cho
thấy cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus, Rafinesque) khi bị nhiễm vi khuẩn A.
hydrophila chưa biểu hiện bệnh nhưng bệnh sẽ bộc phát mạnh khi cá nhiễm
thêm vi khuẩn E. ictaluri. Hiện nay, việc chẩn đoán bệnh trên cá của người
nuôi chủ yếu dựa vào các dấu hiệu biểu hiện lâm sàng thường hay xuất hiện
hoặc gửi mẫu xét nghiệm. Điều này không thể đáp ứng được yêu cầu điều trị
khi bệnh bùng phát do phải mất thời gian xét nghiệm hoặc do việc chẩn đoán
sai tác nhân gây bệnh vì các dấu hiệu bệnh ngoài tự nhiên thường giống nhau
có thể do 1 hoặc nhiều tác nhân cùng gây bệnh.
Do đó, để ngành nuôi cá tra thâm canh ở ĐBSCL phát triển bền vững thì
việc tìm ra các giải pháp kiểm soát, quản lý dịch bệnh và cuối cùng là đưa ra
các biện pháp hiệu quả trong việc phòng và trị đối với 2 loài vi khuẩn E.
ictaluri và A. hydrophila trên cá tra là rất cần thiết. Để thực hiện được điều đó,
trước hết cần phải có những kiến thức về đặc điểm bệnh học do 2 loài vi khuẩn
này cùng gây bệnh trên cá tra. Ngoài ra, cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi
khuẩn cũng cần được làm sáng tỏ nhằm quản lý và sử dụng kháng sinh hiệu
quả và an toàn hơn. Cho đến nay, việc nghiên cứu các đặc điểm bệnh học
nhiễm đơn và hiện tượng kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn trên đã được thực
hiện bởi nhiều tác giả (Ferguson et al., 2001; Đặng Thị Hoàng Oanh và
Nguyễn Thanh Phương, 2009; Đặng Thuỵ Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh,
2010; Nguyễn Thiện Nam và ctv., 2010). Tuy nhiên, các thông tin về bệnh học
2
cá tra nhiễm kép và các đặc điểm phân tử liên quan đến cơ chế đa kháng thuốc
của 2 loài vi khuẩn trên chưa được nghiên cứu ở nước ta. Xuất phát từ thực tế
trên, đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của
hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh
trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng bằng
sông Cửu Long” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu của luận án
Xác định được 1 số đặc điểm bệnh học cảm nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E.
ictaluri và A. hydrophila gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở ĐBSCL nhằm
làm cơ sở cho việc phát hiện và chẩn đoán bệnh.
Xác định được cơ chế đa kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và
A. hydrophila nhằm mục đích kiểm soát, quản lý và sử dụng kháng sinh hiệu
quả trên các ao nuôi cá tra ở ĐBSCL.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được 2 mục tiêu trên, nghiên cứu đã thực hiện các nội dung sau:
Phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila gây bệnh
GTM và XH trên cá tra nuôi thâm canh ở 1 số tỉnh ĐBSCL. Ngoài ra, đề tài
còn phân lập các chủng vi khuẩn E. coli từ ruột và nước ao nuôi cá tra để khảo
sát khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila đối với vi khuẩn này.
Nghiên cứu 1 số đặc điểm bệnh học (dấu hiệu biểu hiện bệnh, thời gian
vi khuẩn gây bệnh, tỷ lệ cá chết và các đặc điểm mô bệnh học) cảm nhiễm kép
2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila.
Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh và hiện tượng đa kháng thuốc của các
chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila phân lập từ cá tra bệnh.
Nghiên cứu các đặc điểm phân tử liên quan đến cơ chế đa kháng thuốc
của vi khuẩn như xác định sự hiện diện các integron nhóm 1, 2 và 3; sự hiện
diện của các plasmid kháng thuốc và xác định 1 số gen kháng thuốc kháng
sinh ở 2 loài vi khuẩn này.
Khảo sát khả năng tiếp hợp và trao đổi gen kháng thuốc của 2 loài vi
khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila với vi khuẩn E. coli cũng như khả năng tiếp
hợp và trao đổi gen kháng thuốc của 2 loài vi khuẩn này với nhau.
1.4 Phạm vi nghiên cứu và giới hạn của luận án
Nghiên cứu chỉ phân lập các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
từ các cơ quan gan, thận và tỳ tạng của cá tra bệnh GTM và XH hoặc cá nhiễm
kép 2 bệnh này ở 1 số tỉnh có diện tích và sản lượng nuôi thâm canh lớn của
3
Tải về để xem bản đầy đủ
226 trang
14380
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_an_nghien_cuu_dac_diem_benh_hoc_va_co_che_da_khang_thuo.pdf
