Khóa luận Nghiên cứu tổng hợp tạp chất B của Terazosin dùng trong kiểm nghiệm

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ------

TRẦN THỊ OANH

Mã sinh viên: 1201452

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN DÙNG

TRONG KIỂM NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ------

TRẦN THỊ OANH

Mã sinh viên: 1201452

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN DÙNG

TRONG KIỂM NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn

ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy

Nơi thực hiện

Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian nghiên cứu, tìm hiểu và thực hiện đề tài với rất nhiều cố

gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn

chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời

gian qua.

Với lòng biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đỗ Thị

Thanh Thủy giảng viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người

thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa

luận này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ

thuật viên của Bộ môn Hóa Dược và Bộ môn Hóa Lý - trường Đại học Dược Hà

Nội, đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, các anh chị, các

bạn và các em trong nhóm kiểm nghiệm tại bộ môn Hóa Dược đã luôn động viên

khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Trần Thị Oanh

MỤC LỤC

DANH M Ụ C CÁC KÝ HI Ệ U, CH Ữ VI Ế T T Ắ T

DANH M Ụ C CÁC B Ả NG

DANH M Ụ C CÁC HÌNH V Ẽ, ĐỒ TH Ị

ĐẶ T V ẤN ĐỀ………………………………………………………………..1

Chương 1. TỔ NG QUAN ……………………………………………………2

1.1. Terazosi n ..........................................................................................................2

1.1.1. M ộ t s ố thông tin chung v ề terazosin .........................................................2

1.1.2. Ch ỉ đị nh c ủ a terazosin...............................................................................2

1.1.3. M ộ t s ố thành ph ẩ m ch ứ a terazosin trên th ị trườ ng ...................................2

1.2. T ạ p ch ấ t B c ủ a terazosintheo USP 3 7 ..............................................................4

1.2.1. M ộ t s ố thông tin chung v ề t ạ p ch ấ t B c ủ a terazosin .................................4

1.2.2. Quy đị nh v ề gi ớ i h ạ n t ạ p ch ấ t B c ủ a terazosin trong nguyên li ệ u và thành

ph ẩ m ch ứ a terazosin............................................................................................4

1.2.3. Phương pháp xác đị nh t ạ p ch ấ t B trongnguyên li ệ u terazosin theo USP

37.........................................................................................................................4

1.3. T ổ ng quan v ề m ộ t s ố phương pháp hóa lý sử d ụ ng trong nghiên c ứu đề tà i ...5

1.3.1. Phương pháp sắ c ký l ớ p m ỏ n g ..................................................................5

1.3.2. Phương pháp sắ c ký l ỏ ng hi ệu năng ca o ...................................................7

1.3.3. Phương pháp đo phổ h ồ ng ngo ạ i ............................................................11

1.3.4. Phương pháp phân tích khố i ph ổ ............................................................12

1.3.5. Phương pháp đo phổ c ộng hưở ng t ừ h ạ t nhân ........................................12

1.3.6. Phương pháp đo nhiệt độ nóng ch ả y.......................................................13

1.3.7. Phương pháp phân tích nhiệ t tr ọng lượ ng...............................................14

1.4. Các phương pháp tinh chế các h ợ p ch ấ t h ữu cơ ............................................14

1.4.1. Chi ế t ........................................................................................................14

1.4.2. S ắ c ký c ộ t ................................................................................................15

1.4.3. K ế t tinh....................................................................................................15

1.5. Các phương pháp tổ ng h ợ p d ẫ n ch ấ t phenol..................................................16

1.5.1. Phương pháp 1 ........................................................................................16

1.5.2. Phương pháp 2 ........................................................................................16

1.5.3. Phương pháp 3 ........................................................................................16

1.5.4. Phương pháp 4 ........................................................................................17

1.5.5. Phương pháp 5 ........................................................................................17

1.6. Tình hình nghiên c ứ u ở Vi ệ t Nam và trên th ế gi ớ i ........................................17

1.6.1. Tình hình nghiên c ứ u ở Vi ệ t Nam ..........................................................17

1.6.2. Tình hình nghiên c ứ u trên th ế gi ớ i..........................................................18

Chương 2. NGUYÊN LIỆ U, THI Ế T B Ị , N ỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN C Ứ U ……………………………………………………...21

2.1. Nguyên li ệ u ....................................................................................................21

2.2. Thi ế t b ị ...........................................................................................................21

2.3. Nôi dung nghiên c ứ u ......................................................................................22

2.4. Phương pháp nghiên cứ u................................................................................22

2.4.1. Phương pháp tổ ng h ợ p t ạ p ch ấ t B ...........................................................22

2.4.2. Phương pháp tinh chế s ả n ph ẩ m thô .......................................................22

2.4.3. Kh ẳng đị nh c ấ u trúc ch ấ t t ổ ng h ợp đượ c ................................................23

2.4.4. Xác đị nh gi ớ i h ạ n t ạ p ch ấ t ......................................................................23

2.4.5. Xác định hàm lượ ng IBT ........................................................................23

2.4.6. Xác đị nh gi ớ i h ạ n t ạ p ch ấ t B trong nguyên li ệ u ch ứ a terazosin .............23

Chương 3. THỰ C NGHI Ệ M, K Ế T QU Ả VÀ BÀN LU Ậ N ……………...24

3.1. T ổ ng h ợ p t ạ p ch ấ t B c ủ a terazosi n .................................................................24

3.1.1. Nguyên t ắ c : ............................................................................................24

3.1.2. Quy trình t ổ ng h ợ p chung: ......................................................................24

3.1.3. Cách đánh giá để l ự a ch ọn điề u ki ệ n ph ả n ứ ng thích h ợ p ......................25

3.1.4. Kh ảo sát giai đoạ n diazo hóa ..................................................................25

3.1.5. Kh ảo sát giai đoạ n th ủ y phâ n ..................................................................29

3.1.6. Quy trình t ổ ng h ợ p t ạ p ch ấ t B c ủ a terazosin...........................................32

3.2. Ki ểm tra độ tinh khi ế t c ủ a s ả n ph ẩ m thô .......................................................32

3.2.1. Đo nhiệt độ nóng ch ả y ............................................................................32

3.2.2. Ki ểm tra độ tinh khi ế t c ủ a s ả n ph ẩ m thô b ằ ng TL C ...............................33

3.3. Tinh ch ế IBT thô ............................................................................................34

3.3.1. Chu ẩ n b ị c ộ t s ắ c ký .................................................................................34

3.3.2. Đưa mẫ u lên c ộ t ......................................................................................34

3.3.3. Ti ế n hành r ử a gi ả i ...................................................................................34

3.4. Ki ểm tra độ tinh khi ế t c ủ a s ả n ph ẩ m tinh ch ế ................................................35

3.4.1. Đo nhiệt độ nóng ch ả y ............................................................................35

3.5. Kh ẳng đị nh c ấ u trúc c ủ a s ả n ph ẩ m tinh ch ế ...................................................37

3.5.1. Đo phổ I R ................................................................................................37

3.5.2. Ph ổ kh ố i MS............................................................................................38

3.5.3. Ph ổ NMR ................................................................................................38

3.5.4. K ế t qu ả phân tích nhi ệ t tr ọng lượ ng .......................................................39

3.6. Xác đị nh gi ớ i h ạ n t ạ p ch ất liên quan và hàm lượ ng s ả n ph ẩ m. .....................40

3.6.1. Xác đị nh t ạ p ch ấ t liên quan b ằ ng TLC ...................................................40

3.6.2. Xác đị nh t ạ p ch ấ t liên quan b ằ ng HPLC.................................................40

3.6.3. Bước đầu xác định hàm lượng hàm lượ ng IBT ......................................43

3.7. S ử d ụ ng s ả n ph ẩm để ki ể m tra gi ớ i h ạ n t ạ p B trong nguyên li ệ u terazosintheo

USP 37...................................................................................................................45

3.7.1. Điề u ki ệ n s ắ c k ý ......................................................................................45

3.7.2. Chu ẩ n b ị dung d ị ch .................................................................................45

Chương 4. BÀN LUẬ N …………………………………………………….49

4.1. T ổ ng h ợ p ........................................................................................................49

4.2. Phân l ậ p s ả n ph ẩ m thô....................................................................................49

4.3. Kh ả o sát các h ệ s ắc ký đánh giá mức độ t ạ p ch ấ t c ủ a s ả n ph ẩ m thô và h ệ s ắ c

ký tinh ch ế b ằng phương pháp sắ c ký c ộ t .............................................................49

4.4. Tinh ch ế ..........................................................................................................50

4.5. Đánh giá độ tinh khi ế t c ủ aIBT b ằng TLC và xác đị nh nhi ệt độ nóng ch ả y ..50

4.6. Kh ẳng đị nh c ấ u trúc c ủ a IBT tinh ch ế ...........................................................50

4.7. V ề xác đị nh gi ớ i h ạ n t ạ p ch ấ t liê n quan và hàm lượ ng c ủ a IBT b ằng phương

pháp HPLC............................................................................................................51

4.8. V ề s ử d ụ ng s ả n ph ẩ m tinh ch ế đượ c ki ể m tra gi ớ i h ạ n t ạ p ch ấ t B trong

nguyên li ệ u terazosin.............................................................................................52

Chương 5. KẾ T LU Ậ N VÀ KI Ế N NGH Ị…………………………………53

5.1. K Ế T LU Ậ N ....................................................................................................53

5.2. KI Ế N NGH Ị ...................................................................................................53

TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O

PH Ụ L Ụ C

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CRS (Chemical reference standard)

: Chất chuẩn đối chiếu

DMSO-d₆

: Dimethylsulfoxid deuteri hóa

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC (High-performance liquid

chromatography)

IBT (Impurity B of terazosin)

IR (Infranred)

: Tạp chất B của terazosin

: Hồng ngoại

MS (Mass spectrum)

: Phổ khối lượng

NMR (Nulear magnetic resonance)

PA (Pure analysis)

: Cộng hưởng từ hạt nhân

: Tinh khiết phân tích

: Độ lệch chuẩn tương đối

: Sắc ký lớp mỏng

: Trung bình

RSD (Relative standard deviation)

TLC (Thin layer chromatography)

TB

USP (United States Pharmacopoeia)

: Dược điển Mỹ

DANH MỤC CÁC BẢNG

B ả ng 1.1. M ộ t s ố thành ph ẩ m ch ứ a terazosin trên th ị tr ườ ng ....................................3

B ả ng 1.2. Dãy ch ấ t phenol th ơm đượ c t ổ ng h ợ pt ừ d ẫ n ch ấ t halogenid c ủ a vòng

th ơ m...........................................................................................................................19

B ả ng 3.2. Hi ệ u su ấ tc ủ a các ph ả n ứ ng t ổ ng h ợp khi thay đổ i t ỷ l ệ mol acid sulfuric

...................................................................................................................................25

B ả ng3.3. Hi ệ u su ấ tc ủ a các ph ả n ứ ng t ổ ng h ợp khi thay đổ i t ỷ l ệ mol NaNO₂........27

B ả ng 3.4. Hi ệ u su ấ t c ủ a các ph ả n ứ ng t ổ ng h ợp khi thay đổ i th ờ i gian diazo hóa...28

B ả ng 3.5. Hi ệ u su ấ t c ủ a các ph ả n ứ ng t ổ ng h ợp khi thay đổ i nhi ệt độ th ủ y phân ...30

B ả ng 3.6 . Hi ệ u su ấ t c ủ a ph ả n ứ ng t ổ ng h ợ p kh ả o sát th ờ i gian th ủ y phân ..............31

B ả ng 3.7. Hi ệ u su ấ tc ủ a quá trình t ổ ng h ợ p ..............................................................32

B ả ng 3.8. Nhi ệt độ nóng ch ả y c ủ a s ả n ph ẩ m thô .....................................................33

B ả ng 3.9 . Hi ệ u su ấ t tinh ch ế IBT thô và toàn b ộ quá trình t ổ ng h ợ p và tinh ch ế IBT

...................................................................................................................................35

B ả ng 3.10. Nhi ệt độ nóng ch ả y c ủ a s ả n ph ẩm đã tinh ch ế .......................................36

B ả ng 3.11. K ế t qu ả ph ổ IR c ủ a s ả n ph ẩ m ................................................................37

B ả ng 3.12. K ế t qu ả phân tích ph ổ ¹H-NMR củ a s ả n ph ẩ m ......................................38

B ả ng 3.13. K ế t qu ả phân tích ph ổ ¹³C-NMR củ a s ả n ph ẩ m .....................................39

B ả ng 3.14. K ế t qu ả phân tích nhi ệ t tr ọ ng l ượ ng c ủ a s ả n ph ẩ m................................40

B ả ng 3.15. K ế t qu ả đánh giá tính thích hợ p c ủ a h ệ th ố ng s ắ c ký.............................41

B ả ng 3.16. Giá tr ị th ờ i gian l ư u c ủ a các pic s ắ c k ý ..................................................41

B ả ng 3.17. Giá tr ị độ phân gi ả i gi ữ a hai pic li ề n k ề .................................................42

B ả ng 3.18. Di ệ n tích pic c ủ a các t ạ p ch ấ t trong IBT................................................42

B ả ng 3.19. Gi ớ i h ạ n các t ạ p ch ấ t trong IB T .............................................................43

B ả ng 3.20. K ế t qu ả xác đị nh hàm l ượ ng IBT tinh ch ế .............................................44

B ả ng 3.21. Đánh giá tính thích hợ p c ủ a h ệ th ố ng s ắ c ký .........................................46

B ả ng 3.22. Giá tr ị th ờ i gian l ư u c ủ a các pic s ắ c k ý ..................................................47

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công th ứ c c ấ u t ạ o c ủ a terazosi n ................................................................2

Hình 1.2. M ộ t vài bi ệ t d ượ c ch ứ a terazosin ..............................................................3

Hình 1.3. Công th ứ c c ấ u t ạ o c ủ a IBT........................................................................4

Hình 3.1. Giai đoạ n 1 ph ả n ứ ng t ổ ng h ợ p IBTd ự ki ế n ...........................................24

Hình 3.2. Giai đoạ n 2 ph ả n ứ ng t ổ ng h ợ p IBTd ự ki ế n............................................24

Hình 3.4. S ắc ký đồ c ủ a ph ả n ứ ng kh ả o sát t ỷ l ệ mol acid sulfuric ........................26

Hình 3.5. S ắc ký đồ c ủ a ph ả n ứ ng kh ả o sát t ỷ l ệ mol natri nitrit .............................27

Hình 3.6. S ắc ký đồ c ủ a ph ả n ứ ng kh ả o sát th ờ i gian diazo hóa.............................29

Hình 3.7. S ắc ký đồ c ủ a ph ả n ứ ng kh ả o sát nhi ệt độ th ủ y phân..............................30

Hình 3.8. S ắc ký đồ c ủ a ph ả n ứ ng kh ả o sát th ờ i gian th ủ y phân ............................31

Hình 3.9 . S ắc ký đồ khi đánh giá sả n ph ẩ m thô .......................................................33

Hình 3.10. S ắc ký đồ kh ảo sát các phân đoạ n tinh ch ế IBT qua c ộ t ........................35

Hình 3.11. S ắc ký đồ s ả n ph ẩ m tinh khi ế t...............................................................37

Hình 3.12. Gi ản đồ nhi ệ t c ủ a s ả n ph ẩ m tinh ch ế .....................................................39

Hình 3.13. S ắc ký đồ m ẫ u tr ắng khi xác đị nh hàm l ượ ng IBT................................43

Hình 3.14. S ắc ký đồ dung d ịch đố i chi ếukhi xác đị nh hàm l ượ ng IB T .................44

Hình 3.15. S ắc ký đồ dung d ị ch th ửkhi xác đị nh hàm l ượ ng IBT ..........................44

Hình 3.16. S ắc ký đồ m ẫ u tr ắ ng khi ki ể m tra gi ớ i h ạ n t ạ p B trong nguyên li ệ u

terazosin ....................................................................................................................46

Hình 3.17. S ắc ký đồ dung d ịch đố i chi ế ukhi ki ể m tra gi ớ i h ạ n t ạ p B trong nguyên

li ệ u terazosin .............................................................................................................47

Hình 3.18. S ắc ký đồ m ẫ u nguyên li ệ u terazosinkhi ki ể m tra gi ớ i h ạ n t ạ p B trong

nguyên li ệ u terazosin.................................................................................................47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phì đại lành tính tuyến tiền liệt là một bệnh thường gặp ở đàn ông trung niên. Biện

pháp phẫu thuật như mở tuyến tiền liệt đóng một vai trò quan trọng ở những bệnh

nhân có triệu chứng. Tuy nhiên tỷ lệ phẫu thuật đã giảm kể từ khi thuốc chẹn kênh

α-adrenergic và thuốc ức chế 5α-reductase trở nên phổ biến để điều trị phì đại lành

tính tuyến tiền liệt [35], [40]. Một số nghiên cứu dịch tễ học đã đánh giá việc sử

dụng thuốc chẹn kênh α-adrenergic trong điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và

chứng minh rằng thuốc chẹn kênh α-adrenergic có khả năng giảm nhiều chi phí liên

quan đến phẫu thuật [31], [34].

Thuốc chẹn kênh α-adrenergic terazosin hydroclorid được sử dụng rộng rãi cho

bệnh nhân phì đại lành tính tuyến tiền liệt, đặc biệt là những người có kèm tăng

huyết áp do thuốc làm giảm sự co thắt cơ trơn tuyến tiền liệt và làm giảm huyết áp

[33].

Một trong những yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả điều trị bệnh chính là chất lượng

của nguyên liệu làm thuốc và thành phẩm thuốc. Khi kiểm tra chất lượng nguyên

liệu và thành phẩm chứa terazosin, trong dược điển Mỹ quy định về giới hạn tạp

chất B của terazosin. Tuy nhiên, hiện nay việc kiểm nghiệm ở nước ta còn gặp

nhiều khó khăn do còn phụ thuộc vào nguồn tạp chất chuẩn nước ngoài với giá

thành cao và thời gian đặt hàng lâu. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên

cứu tổng hợp tạp chất B của terazosin dùng trong kiểm nghiệm thuốc” với các mục

tiêu sau:

1. Xây dựng phương pháp tổng hợp và tinh chế tạp chất B của terazosin quy mô

phòng thí nghiệm.

2. Xác định hàm ẩm, giới hạn tạp chất liên quan, bước đầu xác định hàm lượng của

sản phẩm và sử dụng sản phẩm để xác định giới hạn tạp chất B trong nguyên

liệu terazosin.

1

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Terazosin

1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin

- Công thức phân tử: C₁₉H₂₅N₅O₄

- Phân tử lượng: 387,43

- Công thức cấu tạo:

O

N

O

N

H₃CO

N

H₃CO

NH₂

Hình 1.1.Công thức cấu tạo của terazosin

- Tên khoa học: (RS)-6,7-dimethoxy-2-[4-(tetrahydrofuran-2-ylcarbonyl)piperazin-1-

yl]quinazolin-4-amin.

- Tính chất:

+ Tinh thể màu trắng, không mùi, tan tốt trong methanol, nước, ít tan trong

ethanol 96% và cloroform, không tan trong aceton và n-hexan.

+ Có khả năng hấp thụ UV và IR [42].

1.1.2. Chỉ định của terazosin

- Sử dụng đường uống để điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở người lớn. Có thể sử

dụng cùng các thuốc lợi tiểu, thuốc điều trị tăng huyết áp khác hoặc sử dụng độc

lập nếu các phác đồ điều trị không hiệu quả hoặc không phù hợp. Tác dụng hạ

huyết áp hiệu quả nhất là trên huyết áp tâm trương.

- Sử dụng để giảm triệu chứng trong phì đại lành tính tuyến tiền liệt [30], [32], [36],

[38], [39], [41].

1.1.3. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường

Các thành phẩm chứa terazosin trên thị trường khá đa dạng về hãng sản xuất, dạng

bào chế, hàm lượng hoạt chất (bảng 1.1 và hình 1.1).

2

Bảng 1.1. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường

STT Biệt dược

Hàm lượng

Hãng sản xuất Nước sản xuất

1mg, 2 mg,

5 mg

1

2

3

Hytrin

Vicard-T

Teraz

Abbott

Ấn Độ

2 mg

1 mg,2 mg,

5 mg

Unichem

Laboratories

1 mg, 2 mg,

5mg

4

5

6

7

8

Olyster

Teradip

Terakare

Teralfa

Zydus Alidac

Ấn Độ

Glenmark

Pharmaceuticals

Medley

1 mg

2 mg

Pharmaceuticals

Torrent

2 mg,5 mg

2 mg

Pharmaceuticals

Intas

Terapress

Pharmaceuticals

9

Unoter

2 mg, 5 mg

10mg

Pharmacia India

Apotex

Ấn Độ

10

Terazosin

Mỹ

Hình 1.2. Một vài biệt dược chứa terazosin

3

1.2. Tạp chất B của terazosintheo USP 37

1.2.1. Một số thông tin chung về tạp chất B của terazosin

- Công thức phân tử: C₁₉H₂₄N₄O₅

- Phân tử lượng: 388,42

- Công thức cấu tạo:

O

N

O

N

H₃CO

N

OH

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của IBT

- Tên khoa học: 1-(4-Hydroxy-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-[(tetrahydro-2-

furanyl)carbonyl]piperazin.

1.2.2. Quy định về giới hạn tạp chất B của terazosin trong nguyên liệu và thành

phẩm chứa terazosin

- Trong chuyên luận terazosin hydroclorid của USP 37, giới hạn tạp chất B trong

terazosin hydroclorid là không quá 0,1% [42].

- Trong chuyên luận viên nén terazosin của USP 37, giới hạn tạp chất B trong viên

nén terazosin là không quá 0,2 % [42].

1.2.3. Phương pháp xác định tạp chất B trong nguyên liệu terazosin theo USP 37

- Pha động: hỗn hợp đệm citrat pH 3,2 và acetonitril (1685:315).

- Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan một lượng chính xác khoảng 100,0 mg terazosin

chuẩn trong bình định mức 200 ml bằng pha động, trộn đều.

- Dung dịch chuẩn gốc (1): Hòa tan một lượng chính xác tạp chuẩn B của terazosin

trong methanol để được nồng độ 0,5 mg/ml.

- Dung dịch chuẩn: Pha loãng 5 ml dung dịch chuẩn gốc và 4 ml dung dịch chuẩn

gốc(1) thành 100 ml bằng hỗn hợp nước:acetonitril:methanol (60:30:10), trộn đều.

Pha loãng 10 ml dung dịch trên thành 100 ml bằng pha động.

4

- Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 125,0 mg chế phẩm trong 25,0 ml hỗn

hợp nước:acetonitril (1:1).

- Cột: L7 (25cm x 4,6 mm; 5 μm)

- Nhiệt độ phân tích: 30°C

- Thể tích tiêm: 20 µl

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Detector: UV 254 nm

- Thời gian chạy: 60 phút

- Yêu cầu giới hạn tạp chất B: Không quá 0,1% [43].

1.3. Tổng quan về một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài

1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

1.3.1.1. Nguyên tắc

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất khi cho pha động di chuyển qua pha

tĩnh mà trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được

lựa chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất

và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung

môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng

chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp

mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha độngvới những tốc độ khác

nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là

cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời

của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha

động.

1.3.1.2. Đại lượng đặc trưng

- Hệ số lưu trữ R_fđặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích. Trị số của

nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng

cách di chuyển của pha động:

5

푑_푅

푅_푓=

푑_푀

Trong đó:

d_Rlà khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích(cm).

d_Mlà khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng

đường đi của vết, cm).

R_fcó giá trị dao động giữa 0 và 1.

- Hệ số lưu trữ tương đối R :

r

푑_푅,푋

푅_푟=

푑_푅,퐶

Trong đó:

d_R,Xlà đường đi của chất phân tích (cm)

d_{R, C}là đường đi của chất chuẩn (cm)

Giá trị R càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất.

r

1.3.1.3. Ứng dụng

- Định tính: Thường dựa vào trị số R_fcủa mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong

cùng điều kiện.

- Thử tinh khiết: Mức độ tinh khiết của hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ.

- Định lượng: Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký. Một là tách chiết

chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp và định lượng chất phân

tích bằng một kỹ thuật thích hợp. Hai là định lượng trực tiếp trên bản mỏng [2],

[3], [4].

1.3.1.4. Một số ví dụ về xác định tạp chất không định danh bằng TLC

Ví dụ 1: Xác định tạp chất liên quan trong viên nén ibuprofen [3]

- Bản mỏng: silicagel GF₂₅₄.

- Dung môi khai triển: n-hexan:ethyl acetat:acid acetic khan (15:5:1)

- Dung dịch thử: Chiết một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,250 g ibuprofen với

cloroform, chiết 3 lần, mỗi lần 10,0 ml cloroform, bay hơi dịch chiết còn khoảng 1

ml, thêm cloroform cho vừa đủ 5,0 ml.

6

- Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml

bằng cloroform.

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt 5 ml mỗi dung dịch trên lên bản mỏng. Sau khi

triển khai xong sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí và phun dung

dịch kali permanganat 1% trong acid sulfuric loãng, sấy bản mỏng ở nhiệt độ

120^oC trong khoảng 20 phút. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại khả kiến ở bước

sóng 365 nm. Bất kỳ vết phụ nào xuất hiện trên sắc ký đồ của dung dịch thử không

được đậm màu hơn vết chính của dung dịch đối chiếu.

Ví dụ 2: Xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu cloroquin phosphat [28]

- Bản mỏng: silicagel GF₂₅₄.

- Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 0,50 g mẫu thử trong nước, pha loãng

thành 10,0 ml bằng dung môi hòa tan.

- Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử tới 100,0 ml với nước.

- Dung dịch đối chiếu (b): Pha loãng 5,0 ml dung dịch đối chiếu (a) tới 10,0 ml với

nước.

- Phát hiện vết bằng soi đèn UV 254 nm.

- Cách đánh giá kết quả: Bất kỳ vết nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử, ngoài vết

chính, không đậm hơn vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a) (1,0%) và

không nhiều hơn một vết đậm hơn vết sắc ký trong sắc ký đồ của dung dịch đối

chiếu (b) (0,5%).

1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.2.1. Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn hợp

phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn dưới

dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng hấp phụ trên một chất mang rắn, hay một chất

mang đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên

cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ.

1.3.2.2. Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

7

- Thời gian lưu t_R: Là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống

sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ đạt cực đại của nó.

푡

푡 −푡

0

푡

푅′

푅

- Hệ số dung lượng k’: 푘^′=

=

^푅− 1

푡

0

푡

0

- Hệ số chọn lọc α:

푡

−푡

푘′

푅,퐵

0

퐵

훼 =

=

(k’_B> k’_A)

푡

푅,퐴

−푡

퐴

0

α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất thường

chọn α nằm trong khoảng 1,05 đến 2.

- Hiệu lực cột: Hiệu lực cột được đánh giá thông qua số đĩa lý thuyết (N) và chiều

cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự

phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả

định như một pha tĩnh có chiều cao H.

푡

퐿

푅

푁 = 16[ ]²hay푁 = 5,54[

]²hay 퐻 = _푁

푊

1

⁄

2

Trong đó

L là chiều cao cột sắc ký.

W là chiều rộng đáy pic.

W_1/2là chiều rộng đo ở ½ chiều cao pic.

- Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.

푊

1/20

퐴퐹 =

2푎

Trong đó:

W_1/20: Là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.

a: Là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong

phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2. Giá trị của AF càng gần 1 thì pic

càng cân đối.

- Độ phân giải : Đặc trưng cho mức độ tách 2 chất khác nhau trên một điều kiện sắc

ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức :

8

2(푡_푅,퐵− 푡_푅,퐴

)

1,18(푡_푅,퐵− 푡_푅,퐴

)

푁 훼 − 1

푘′_퐵

√

푅_푆=

Trong đó:

=

(

) (

)

푊_퐵+ 푊

푊

+ 푊

1/2퐴

4

훼

1 + 푘′_퐵

퐴

1/2퐵

R_S= 1,5 : Hai pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3%.

R_S= 1,0: Hai pic chưa tách hẳn nhau còn xen phủ nhau 0,4%.

R_S= 0,75: Hai pic chưa tách nhau.

1.3.2.3. Ứng dụng

- Định tính: Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc

chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.

- Định lượng: Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc

diện tích pic của nó. Có 3 phương pháp định lượng được sử dụng :

+ Phương pháp chuẩn ngoại: Hai dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thửđược tiến

hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic

thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn đã biết nồng độ sẽ tính ra nồng độ các chất

có trong mẫu thử.

+ Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất

chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và

sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa vào

sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng diện tích (hoặc

chiều cao) pic.

+ Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần

trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần

trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần

trên sắc ký đồ.

- Xác định giới hạn tạp chất: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm của một

chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic

của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Do đó, có

thể tính được giới hạn của từng tạp chất trong mẫu thử hoặc giới hạn tổng tạp chất

trong mẫu thử [3], [4], [6], [9], [18].

9

1.3.2.4. Một số ví dụ về xác định tạp chất không định danh bằng HPLC

Ví dụ 1: Xác định tạp chất liên quan trong viên nén tenoxicam [3]

- Pha động: 0,12 g natri dodecyl sulfat trong 700,0 ml methanol, trộn với 100,00 ml

dung dịch KH₂PO₄0,05 M và điều chỉnh đến pH 2,8 bằng H₃PO₄.

- Dung dịch (1): Lượng bột viên chứa khoảng 0,1 g tenoxicam trong 100,0 ml

acetonitril 50 %, hút 5,0 ml dung dịch trên pha loãng thành 200 ml với pha động.

- Dung dịch (2): Pha loãng 1 ml dung dịch (1) thành 200,0 ml với pha động .

- Điều kiện sắc ký

+ Cột: C8 (25 cm x 4 mm; 10 µm)

+ Detector: UV 254 nm

+ Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút

- Cách đánh giá kết quả: Trong sắc ký đồ của dung dịch (1), không được có bất kỳ

pic phụ nào có diện tích lớn hơn pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch (2)

(0,5%) và tổng diện tích của các pic phụ đó không được lớn hơn bốn lần diện tích

của pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch (2) (2%).

Ví dụ 2: Xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu niclosamid monohydrat

[42]

- Pha động: acetonitril:KH₂PO₄2 g/l:Na₂HPO₄1 g/l:tetrabutylamoni hydrosulfat 2

g/l (1:1:1:1)

- Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 50,0 mg chế phẩm trong methanol, pha

loãng tới 50,0 ml với methanol.

- Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng

acetonitril. Pha loãng 1,0 ml dung dịch trên thành 20,0 ml với acetonitril.

- Điều kiện sắc ký:

+ Cột: 12,5 cm x 4 mm; 5 μm

+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Detector: UV 230 nm

+ Thời gian chạy: gấp hai lần thời gian lưu của niclosamid

- Cách đánh giá kết quả:

10