Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Trần Yến Tiên

MSSV: 1311100092 Lớp: 13DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2017

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường

của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học

khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn

trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình.

Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trần Yến Tiên

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành được đồ án “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng

ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi

kiến thức. Cũng không ít lần gặp khó khăn trắc trở nhưng nhờ sự hướng dẫn tận tình

của Cô Nguyễn Hoài Hương nay em đã hoàn thành được đồ án của mình.

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của Cô Nguyễn Hoài Hương.

Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ

TPHCM. Chính nhờ Cô đã truyền tải kiến thức và những kỹ năng để em đạt được

thành quả trong đồ án mà em thực hiện hôm nay.

Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy cô giảng viên và Ban lãnh

đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công

nghệ TPHCM đã tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hoàn thành được đồ án

tốt nghiệp đúng thời gian quy định.

Dù hoàn thành được đồ án nhưng cũng khó tránh khỏi những sai sót nhất

định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để

phục vụ quá trình thực hiện đồ án. Kính mong có sự góp ý và hướng dẫn tận tình

của các thầy cô để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học

tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một môi trường làm việc mới sau

này.

Kính chúc Cô Nguyễn Hoài Hương và các Thầy cô giảng viên, Ban lãnh đạo

Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ

TPHCM sức khỏe, thành công và may mắn.

Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trần Yến Tiên

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

DANH M Ụ C CÁC T Ừ VI Ế T T Ắ T ..........................................................................4

DANH M Ụ C CÁC B Ả NG ........................................................................................5

DANH M Ụ C CÁC BI ỂU ĐỒ, ĐỒ TH Ị, SƠ ĐỒ , HÌNH Ả NH..............................7

M Ở ĐẦ U ..............................................................................................................10

1. Tính cấp thiết đề tà i .........................................................................................10

2. Tình hình nghiên c ứ u....................................................................................11

3. M ụ c tiêu nghiên c ứ u ........................................................................................12

4. Nội dung nghiên cứ u........................................................................................12

5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................12

5.1. Phương pháp luậ n .........................................................................................12

5.2. Phương pháp xử lý s ố li ệ u .............................................................................13

6. K ế t c ấu đồ á n .................................................................................................13

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...............................................................................14

1.1. Tổng quan về nấm .........................................................................................14

1.1.1. Giới thiệu chun g ...................................................................................14

1.1.2. Độc tố nấm ............................................................................................15

1.1.3. Tác h ạ i c ủ a n ấ m....................................................................................17

1.1.4. M ộ t s ố ch ủ ng n ấm gây độ c trong th ự c ph ẩ m .......................................18

1.1.5. M ộ t s ố phương pháp khử nhi ễm độ c t ố ................................................19

1.2. T ổ ng quan v ề vi khu ẩ n lacti c .......................................................................21

1.2.1. Gi ớ i thi ệ u vi khu ẩ n lactic......................................................................21

1.2.2. Phân loại ...............................................................................................22

1.2.3. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic. ...............................................23

1.2.4. Đặc điể m sinh lý – sinh hóa..................................................................25

1.2.5. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ..............................................26

1.2.6. Quá trình trao đổi chấ t .........................................................................28

1.2.7. Các y ế u t ố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưở ng và

phát tri ể n c ủ a vi khu ẩ n lacti c .............................................................................31

1.2.8. Ứ ng d ụ ng c ủ a vi khu ẩ n lacti c ...............................................................32

1

Đồ án tốt nghiệp

1.2.9. Hoạt tính sinh học .................................................................................33

CHƯƠNG 2: V Ậ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U....................38

2.1. Địa điểm nghiên cứu .....................................................................................38

2.2. Th ờ i gian th ự c hi ệ n .......................................................................................38

2.3. Vật liệu ...........................................................................................................38

2.3.1. Nguồn phân lập .....................................................................................38

2.3.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................38

2.3.3. Hóa chất ................................................................................................38

2.3.4. Giống nấm .............................................................................................40

2.4. Phương pháp luận .........................................................................................40

2.5. Phương pháp thí nghiệ m ..............................................................................43

2.5.1. Thu thập mẫu ........................................................................................43

2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lacti c .................................................43

2.5.3. Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá. ...................................................45

2.6. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. ....................................49

2.7. Kh ả o sát kh ả năng kháng nấ m c ủ a ch ủ ng vi khu ẩ n lactic b ằng phương

pháp in vitro ..........................................................................................................49

2.7.1. Khảo sát khả năng đối kháng nấm trực tiếp theo phương pháp in vitro.

49

2.7.2. Kh ả o sát kh ả năng sinh enzyme ngoạ i bào...........................................53

2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản

hạt.55

2.8.1. Ứ ng d ụ ng b ả o qu ả n h ạt đậ u ph ộng với mật độ nấm mốc 10²/12g hạt:55

2.8.2. Ứ ng d ụ ng b ả o qu ả n h ạt đậ u ph ộng với mật độ nấm mốc 10¹/12g hạt:57

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .......................................................60

3.1. Kết quả khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá...............................................60

3.1.1. Thử nghiệm Catalas e ............................................................................61

3.1.2. Nhuộm Gram .........................................................................................62

3.1.3. Nhuộm bào tử ........................................................................................63

3.1.4. Khả năng lên men đường và khả năng sinh khí ....................................64

3.1.5. Th ử nghi ệ m kh ả năng di độ ng b ằng phương pháp thạ ch m ề m. ...........66

2

Đồ án tốt nghiệp

3.2. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. ....................................71

3.3. Kh ả o sát kh ả năng kháng nấ m c ủ a ch ủ ng vi khu ẩ n lactic b ằng phương

phap in vitro. ........................................................................................................73

3.3.1. Khảo sát khả năng kháng nấm trực tiếp của chủng vi khuẩn lactic.....73

3.3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào. ........................................................76

3.4. Ứ ng d ụ ng b ả o qu ả n h ạt đậ u ph ộng với mật độ nấm mốc 10²/12g hạt: ...78

3.5. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 10¹/12g hạt: ...87

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................94

4.1 K ế t lu ậ n...........................................................................................................94

4.2 Ki ế n ngh ị .........................................................................................................94

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................95

PHỤ LỤC .................................................................................................................1

3

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales

VK Vi khuẩn

MRS de Man, Rogosa and Sharpe

PDA Potato Detrose Agar

ĐC Đối chứng

TN Thí nghiệm.

4

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của các chi vi khuẩn lactic .........................25

B ả ng 1.2 . M ộ t s ố h ợ p ch ất được xác đị nh có ti ềm năng kháng nấ m m ố c và n ấ m

men (Corsetti và c ộ ng s ự , 1998) ...............................................................................34

B ả ng 1.3 . Các s ả n ph ẩm trao đổ i ch ấ t c ủ a vi khu ẩ n lactic có tính kháng sinh.

(Holzapfel và c ộ ng s ự , 1995 )....................................................................................35

B ả ng 1.4 Kh ả năng đố i kháng c ủ a các s ả n ph ẩ m bi ến dưỡ ng c ủ a vi khu ẩ n LAB.

(Holzapfel và c ộ ng s ự , 1995 )....................................................................................37

B ả ng 2.1: Kí hi ệ u các ngu ồ n phân l ậ p......................................................................43

Bảng 3.1 : B ả ng kí hi ệ u các ch ủ ng vi khu ẩ n phân l ậ p ...............................................61

Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các vi khuẩn phân

lập ..............................................................................................................................67

Bảng 3.3 . Trình bày tóm tắt về các chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi

khuẩn lên men lactic..................................................................................................70

Bảng 3.4 : B ả ng x ử lý s ố li ệ u kh ả năng sinh acid và giá trị OD c ủ a 11 ch ủ ng v i .....71

khuẩn phân lậ p. .........................................................................................................71

Bảng 3.5 : Phân nhóm các chủng vi khuẩn lacti c ......................................................72

Bảng 3.6 .Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế của 11 chủng vi khuẩn phân lập

được với 2 chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn .....................74

Bảng 3.7 . Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩ n ..........................76

Bả ng 3.8 . Kh ả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trườ ng nuôi c ấy các chủng vi

khuẩn ứ ng d ụng trên đậ u ph ộng với mật độ nhiễm 10²bào tử/g đậu phộng. ...........78

Bảng 3.9. Kh ả năng kháng nấm CĐP2 củ a Canh trườ ng nuôi c ấy các chủng vi

khuẩn ứ ng d ụng trên đậ u ph ộng với mật độ nhiễm 10²bào tử/g đậu phộng. ...........82

Bảng 3.10. Kh ả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trườ ng nuôi c ấy các chủng vi

khuẩn ứ ng d ụng trên đậ u ph ộng với mật độ nhiễm 10¹bào tử/g đậu phộng. ...........87

Bảng 3.11. Kh ả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trườ ng nuôi c ấy các chủng vi

khuẩn ứ ng d ụng trên đậ u ph ộ ng với mật độ nhiễm 10¹bào tử/g đậu phộng. ...........89

5

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.12. Thời gian bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày) của 11 chủng vi khuẩn với

mật độ cảm nhiễm 10¹bt/g đậu phộng và 10²bt/g đậu phộng....................................90

Bảng 3.13. So sánh khả năng tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro và in

vivo của các chủng vi khuẩn phân lập. .....................................................................91

6

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 : Một số vi khuẩn lactic điển hình ..............................................................24

Hình 1.2 . Sơ đồ các con đườ ng lên men lactose c ủ a vi khu ẩ n lactic .......................29

Hình 2.1 Sơ đồ phân l ập và định danh sơ bộ vi khu ẩ n lacti c ...................................42

Hình 2.2 : Cách pha loãng m ẫ u .................................................................................44

Hình 2.3 : Sơ đồ kh ả o sát kh ả năng đố i kháng c ủ a các ch ủ ng vi khu ẩ n v ớ i n ấ m m ố c

theo phương pháp cấy 2 đườ ng vi khu ẩ n ..................................................................50

Hình 2.4 : Mô t ả cách đo đườ ng kính vòng ứ c ch ế c ủa phương pháp vạch 2 đườ ng vi

khu ẩ n .........................................................................................................................52

Hình 2.5: Sơ đồ thí nghi ệ m kh ả năng sinh enzyme củ a các ch ủ ng LAB.................53

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lacti c ...........................................................60

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên môi trường có chứa chất chỉ thị 61

Hình 3.3 : Th ử nghi ệ m catalase ch ủ ng vi khu ẩ n (T ừ trái qua ph ả i): Th ử nghi ệ m âm

tính c ủa chủng vi khuẩn KC1A, Đố i ch ứng âm là nướ c c ấ t, th ử nghi ệm dương tính

đố i v ớ i Bacillus spp ...................................................................................................62

Hình 3.4 Kết quả nhuộm gram của chủng vi khuẩn: A. Vi khuẩn Bacillus subtilis

bắt màu tím. B . Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng. C. Vi khuẩn phân lập ...................63

Hình 3.5 Kết quả nhuộm bào tử của chủng vi khuẩn. A. Vi khuẩn Bacillus subtilis

sinh bào tử. B. Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử. C. Vi khuẩn phân lập không sinh

bào tử .........................................................................................................................64

Hình 3.6 . Thử nghiệm lên men đường. Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường. Ống

2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí. Ống 3: Vi khuẩn lên men đường nhưng

không sinh khí ..........................................................................................................65

Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập được có khả năng lên men đường. ....................66

Sau thử nghiệm lên men đường, thu được kết quả cho thấy trong số 11 chủng phân

lập thì có 10 chủng là vi khuẩn lên men đồng hình, 1 chủng còn lại là lên men dị

hình. Các chủng phân lập từ Kim chi đều lên men đồng hình sinh acid lactic, còn

với các chủng phân lập từ Nem chua có duy nhất 1 chủng là lên men dị hình, 4

7

Đồ án tốt nghiệp

chủng còn lại đều lên men đồng hình. Chủng lên men dị hình đó thường mang lại

cho Nem chua nhiều giá trị cảm quan hơn do hình thành sản phẩm phụ ngoài acid

lactic. .........................................................................................................................66

Hình 3.8. Kiểm tra tính di động của vi khuẩn. Ống a: Vi khuẩn có khả năng di

động. Ống b: Vi khuẩn không có khả năng di động. Ống c: Vi khuẩn phân lập được

không có khả năng di động. ......................................................................................67

Hình 3.9 : Đồ thị biểu diễn %Acid tổng và sinh khối của 11 chủng vi khuẩn sau 24h

nuôi cấy. ....................................................................................................................72

Hình 3.10. Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của chủng vi khuẩn phân lập ..............74

Hình 3.11 . Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của chủng vi khuẩn phân lậ p ..............74

Hình 3.12 . Biểu đồ thể hiện phần trăm tỉ lệ ứ c ch ế n ấ m c ủ a các ch ủ ng vi khu ẩ n. ..75

Hình 3.13 . Khả năng đối kháng CĐP1 của NC412 sau 3 ngày................................75

Hình 3.14 . Khả năng đối kháng CĐP2 của KC1A sau 3 ngày.................................75

Hình 3.15. Khả năng đối kháng CĐP1 của KC242 sau 3 ngày................................76

Hình 3.16 . Khả năng phân giải Tinh bột của chủng vi khuẩn KC13 ......................77

Hình 3.17. Khả năng phân giải Protein của chủng vi khuẩn KC1B ........................77

Hình 3.18 . Khả năng phân giải Chitin của chủng vi khuẩn KC1 A .........................77

Hình 3.19 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ

trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngà y 7. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước

cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A ............79

Hình 3.20 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ

trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13,

KC106, KC242..........................................................................................................80

Hình 3.21 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ

trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12,

NC172, NC412..........................................................................................................81

Hình 3.22 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ

trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: ĐC (-) –

8

Đồ án tốt nghiệp

Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK

KC1A. .......................................................................................................................83

Hình 3.23 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ

trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng

VK KC1B, KC13, KC106, KC242 ...........................................................................84

Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ

trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng

VK NC2, NC12, NC172, NC412..............................................................................85

Hình 3.25. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6

và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng

Ca rbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. .......................................................92

Hình 3.26. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6

và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng

Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. .......................................................93

9

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết đề tài

Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì bên cạnh đó lĩnh

vực Công nghệ sinh học cũng đang dần phát triển ngày càng rộng mở.

Ngày nay con người ta đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào

trong cuộc sống, áp dụng trên tất cả các loại hình từ công nghiệp, nông nghiệp, an

ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v... Công nghệ sinh học chính là kết quả của các

quá trình nghiên cứu khoa học công nghệ.

Các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu

trên toàn Thế Giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật để cho ra đời các giống cây

trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các loại giống hiện có. Bên

cạnh đó còn có thể tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, chất

xét nghiệm bệnh, những mầm móng mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh

tế - xã hội và bảo vệ môi trường.

Đặc biệt hơn là áp dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm. Các nghiên cứu

Công nghệ sinh học cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến và bảo quản

thực phẩm, điều tiết các loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thực phẩm. Hạn chế mầm

bệnh và sự lây lan đến môi trường sống.

Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển

đó. Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử

dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến

sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân

thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch

bệnh hiện nay. Mặc dù áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ

sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP…), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật

gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Theo Besselink, et

al., 2008).

Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản

hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất

10

Đồ án tốt nghiệp

phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng

còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại

hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử

dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và

sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm.

Theo đó tôi đã dựa trên những nghiên cứu, những tài liệu mà các thầy cô cung

cấp, và tìm hiểu thêm trên các trang thông tin khoa học để thực hiện đề tài “Phân

lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin”. Loại vi khuẩn

này có khả năng kháng lại các loại nấm mốc dùng trong chế biến và bảo quản thực

phẩm. Đảm bảo thực phẩm đạt chất lượng dinh dưỡng hợp lý, nâng cao chất lượng

sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trên thị trường nội địa lẫn quốc tế.

Do đó, tôi đã thực hiện đề tài này nhằm phục vụ quá trình làm đồ án tốt nghiệp

cũng như là tìm tòi, học hỏi, tích lũy các kinh nghiệm thực tiễn trong quá trình tham

khảo, nghiên cứu các ứng dụng của khuẩn lên men lactic cùng với các phương pháp

xử lý nguyên liệu và chế biến hợp lý nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, tạo ra sự

đồng nhất của sản phẩm sau khi lên men, kéo dài thời gian bảo quản góp phần vào

việc đáp ứng nhu cầu sử dụng đa dạng sản phẩm và đảm bảo hợp vệ sinh cho người

sử dụng.

2.

Tình hình nghiên cứu

Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng nấm chống bệnh

than (Asma Saleh Elmabrok et al…,2012)

Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic mới phân lập (Nora LAREF*,

Bettache GUESSAS, 2013)

Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất

kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum (Lê Ngọc Thùy Trang và cộng sự,

2014)

Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng

Probiotic từ người (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự)

11

Đồ án tốt nghiệp

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản

thưc ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại (Đào Thị Lương

và các cộng sự, 2010)

Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế

biến Probiotic (Trần Thị Ái Liên, 2011)

Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu khác về vi khuẩn lactic trong và

ngoài nước

3. Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men

truyền thống có khả năng kháng nấm mốc gây nhiễm độc trên thực phẩm.

4. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như kim chi và

nem chua.

- Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic của các chủng phân lập.

- Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin in vitro.

- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của cac chủng phân lập.

- Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng.

5. Phương pháp nghiên cứu

5.1. Phương pháp luận

- Lựa chọn nguồn phân lập là các loại thực phẩm lên men truyền thống như

kim chi, nem chua, vì các nguồn này chứa các vi khuẩn sống và có tiềm năng

kháng nấm cao.

- Phân lập vi khuẩn lên men lactic bằng môi trường chuyên biệt có bổ sung

NaN₃và khăng định khả năng sinh acid bằng chỉ thị, dựa vào khoá phân loại

của Bergey’s Manual (Theo Benson Lab Manual, 2001) và định danh sơ bộ

vi khuẩn lên men lactic.

- Tuyển chon

̣

các chủng vi khuẩn phân lập qua khảo sát sinh khối và acid tổng

̣

tạo thành.

12

Đồ án tốt nghiệp

- Tuyển chon

̣

các chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro của các chủng

̣

phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn).

- Tuyển chon các chủng vi khuẩn phân lập qua kháng nấm in vivo qua thí

̣

nghiệm bảo quản đậu phộng.

5.2. Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị

- Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu

6.

Kết cấu đồ án

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung

liên quan đến tài liệu nghiên cứu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập

đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.

Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.

Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt

được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.

13

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

Tổng quan về nấm

1.1.1. Giới thiệu chung

Giới Nấm (tên khoa học : Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị

dưỡng có thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa

bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm khác lại

phát triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm

thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể. Một số loài

lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình

thức sinh sản sinh dưỡng .

Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc , nấm men và nấm lớn (nấm quả

thể). Giới Nấm là nhóm sinh vật đơn ngành (monophyletic) mà có nguồn gốc hoàn

toàn khác biệt với những sinh vật có hình thái tương tự như nấm

nhầy (myxomycetes) hay mốc nước (oomycetes). Nấm có mối quan hệ gần

với động vật hơn thực vật, cho dù thế thì môn học về nấm, hay nấm học, lại thường

được xếp vào thành một nhánh của thực vật học .

Trên Trái Đất, đa phần các nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt

thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng

sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng một vai trò

quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể

thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Một số loài nấm có thể

nhận thấy được khi ở dạng quả thể, như nấm lớn và nấm mốc. Nấm được ứng dụng

rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất. Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ

thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men . Nấm còn được dùng

để sản xuất chất kháng sinh , hoóc môn trong y học và nhiều loại enzyme. Tuy vậy,

nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin

như ancaloit và polyketit-là những chất độc đối với động vật lẫn con người. Một số

loại nấm được sử dụng để kích thích hoặc dùng trong các nghi lễ truyền thống với

vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người. Vài loại nấm có thể gây ra các

14

Đồ án tốt nghiệp

chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa

màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương thực và kinh tế .

Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào

không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại

sinh, kí sinh, cộng sinh), quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế

bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose và một số thành phần khác có

hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi

nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium). Có 2 loại sợi: Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong

lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm. Sợi

nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử).

1.1.2. Độc tố nấm

1.1.2.1. Các loại độc tố do nấm tiết ra

Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối

lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc

đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người.

Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát

hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở

mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi

nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:

- Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin

A, stermatocystin, acid cyclopianxoic.

- Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và

axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.

- Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin.

- Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl ether

alternarion.

- Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay

hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố.

15

Đồ án tốt nghiệp

Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể. Nhiều độc tố như

aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai.

Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột

biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng

hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác

động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể

gây tổn thương não và chết.

Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiện

tổn thương ở gan và thận. Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế

bào nhu mô gan, xơ hoá. Mycotoxin còn phá hủy tế bào gan và thận, ảnh hưởng

trực tiếp lên hệ miễn dịch, ăn mòn thành ruột và dạ dày. Ngoài ra còn có các dấu

hiệu tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận.

1.1.2.2. Độc tố Aflatoxin

Độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi

nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm

trên một số hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu

mức độ nhiễm độc thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản

của động vật và nặng hơn sẽ gây ung thư.

Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự nhiên.

Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá

trình bảo quản. Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài

trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán.

Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục nát và

ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất

hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của nó. Điều kiện

thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao.

Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa

miến , gạo , lúa mì), hạt có dầu (lạc , đậu tương , hạt hướng dương , hạt bông), gia vị

(ớt , hạt tiêu đen , rau mùi, nghệ , gừng ) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ,

16

Đồ án tốt nghiệp

dừa…Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng

thức ăn nhiễm aflatoxin.

Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều

lượng cao trong thời gian ngắn. Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm:

Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong.

Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian

dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoá

thức ăn kém, sụt cân, nhưng rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư

gan.

Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua

các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật. Sự nhiễm độc mãn tính

aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến. Hậu quả

của việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh

dưỡng và mức độ tiếp xúc. Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm

với tác nhân càng cao.

Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium

do nấm Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm

Fusarium tiết ra. Độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết.

1.1.3. Tác hại của nấm

1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật

Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành

nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây

bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago,

Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây

trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị

ẩm mốc,...

1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật

Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm

sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong nhà hay

17