Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA VI KHUẨN
Bacillus subtilis Natto
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn
: ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT
ThS. PHAN TRUNG HẢI
: NGUYỄN THỊ MINH TRANG
Lớp: 12DSH01
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1211100022
TP. Hồ Chí Minh, 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Như Nhứt và ThS. Phan Trung Hải. Các
nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới
bất kì hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho
việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác
nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích
nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về
nội dung đồ án của mình.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thực tập
NGUYỄN THỊ MINH TRANG
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được
sự quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc
trang bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có
cơ hội được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập
này. Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức
thực tiễn bổ ích cho công việc sau này.
Em xin chân thành biết ơn:
- Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học
Công Nghệ TP.HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã
cho em có cơ hội được đi thực tập.
- Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo
điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình.
- Em xin cảm ơn ThS. Phan Trung Hải đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn
thành đồ án này.
Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của:
Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh
Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi
điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành
luận văn này.
Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi, đã chia sẻ,
giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống.
Sinh viên thực tập
NGUYỄN THỊ MINH TRANG
Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỤC LỤC................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... v
MỞ ĐẦU................................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết.................................................................................................. 1
3. Mục tiêu nghiên cứu....................................................................................... 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ..................................................................................... 3
5. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 3
6. Kết quả đạt được............................................................................................. 3
7. Kết cấu đề tài nghiên cứu............................................................................... 4
1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto.................................................................. 5
1.1.2. Lịch sử phát hiện .................................................................................... 5
1.1.3. Phân bố ................................................................................................... 7
1.2. Enzyme protease ........................................................................................... 10
1.2.1. Khái niệm về protease ........................................................................... 10
1.2.2. Phân loại ................................................................................................ 11
1.2.3. Nguồn thu nhận ..................................................................................... 12
1.4. Ứng dụng của protease.................................................................................. 18
1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease................................................... 19
i
Đồ án tốt nghiệp
1.5.1.Trên thế giới ........................................................................................... 19
1.5.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 20
2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm.................................................. 22
2.1.1. Địa điểm ................................................................................................ 22
2.1.2. Thời gian nghiên cứu............................................................................. 22
2.2. Vật liệu thí nghiệm........................................................................................ 22
2.2.1. Nguồn vi sinh vật................................................................................... 22
2.2.2. Cơ chất dùng trong thí nghiệm.............................................................. 22
2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng.................................................................. 23
2.3. Môi trường nuôi cấy...................................................................................... 23
2.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 25
2.4.2. Phương pháp tăng sinh .......................................................................... 25
2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn .............................................................. 27
2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê.................................................................. 30
2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 30
ii
Đồ án tốt nghiệp
Bacillus subtilis Natto...................................................................................... 32
bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ............................................................ 35
B. subtilis Natto BN2.1 ........................................................................................ 37
hợp protease..................................................................................................... 37
B.subtilis Natto BN2.1 ......................................................................................... 43
4.1. Kết luận......................................................................................................... 45
4.2. Kiến nghị....................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 46
iii
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. candidus
Aspergillus candidus
A.oryzae
B.
Aspergillus oryzae
Bacillus
B. subtilis
BDN
CB
Bacillus subtilis
Bã đậu nành
Cám bắp
CG
Cám gạo
CM
Cám mì
CFU
DX
Colony Foming Unit
Đậu xanh
kDa
kiloDalton
nKat
OD
nanoKatal
Optical Density
Điểm đẳng điện của protein
Penicillium roqueforti
Đơn vị hoạt độ
pI
P. roquerti
UI
SPSS
Phần mềm xử lý thống kê
(Statistical Package for the Social Science)
Trọng lượng phân tử
TLPT
iv
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis ................................... 8
Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus
licheniformis N-2................................................................................... 15
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng
Bacillus licheniformis N-2..................................................................... 16
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng
Bacillus licheniformis N-2..................................................................... 17
Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu............................................................ 22
Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine................................................................... 28
Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu ........................... 29
Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn ........ 31
Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng
B. subtilis Natto ..................................................................................... 34
Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần
nuôi cấy khác nhau ................................................................................. 35
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ
protease................................................................................................... 38
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease......................... 40
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease....... 41
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease.................. 43
v
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Sản phẩm Natto ....................................................................................... 6
Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto.................................................. 7
Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. ................................................... 10
Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease................................................... 11
Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng
Bacillus subtilis Natto........................................................................... 33
Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng
B. subtilis Natto................................................................................ 34
Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử
dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau......................................... 36
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ
protease............................................................................................. 38
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease.................... 40
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt
độ protease........................................................................................ 42
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease............ 43
vi
Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và
được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus[40]. Bacillus subtilis Natto là
một chủng vi khuẩn có ích, rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có khả năng phát
triển rất nhanh và sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân như amylase,
protease, phytase, hemicellulase, glucannase… Chủng vi khuẩn này đã được sử
dụng trong món ăn truyền thống của Nhật Bản từ lâu. Khi ủ ấm với hạt đậu nành,
chúng sẽ sản sinh ra enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả năng phòng và
chữa các bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả[54]... Nhiều nghiên cứu về B. subtilis Natto
đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều
[45]
enzyme nhóm protease như nattokinase[33], elastase[32], bacillopeptidase F
…
Chủng vi khuẩn này có thể đáp ứng nhu cầu lớn về protease của ngành chăn nuôi và
nuôi trồng thủy sản trong lĩnh vực chế biến thức ăn chăn nuôi, bổ sung men tiêu
hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh... Tuy nhiên, việc
nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn này tạo sản phẩm protease ở Việt Nam chưa
nhiều. Do đó nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto”.
Ý nghĩa đề tài nghiên cứu:
- Về khoa học: Cung cấp thông tin về khả năng sinh tổng hợp protease của
Bacillus subtilis Natto trên môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần là các phế
phụ liệu của ngành nông nghiệp Việt Nam.
- Về thực tiễn: Góp phần xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm giàu protease,
giúp đa dạng hóa sản phẩm.
1
Đồ án tốt nghiệp
2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
Do có những ưu điểm vượt trội, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto vẫn luôn
được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt
Nam, một số công trình và ứng dụng tiêu biểu:
- Đinh Thu Hương (2013) nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme
protease từ vi khuẩn B. subtilis Natto. Kết quả cho thấy, môi trường kết hợp có 2%
maltose, 0,5% casein, CaCl2 0,05% giúp tăng tiết enzyme protease 21,7% so với
môi trường canh thang , nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa là nồng độ tối ưu để thu
được tủa enzyme có hoạt độ protease cao nhất: 172,5 nKat. Sau khi tinh chế bằng
phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75, lựa chọn được phân đoạn 10 là phân
đoạn có hoạt độ protease cao nhất 27,2 nKat. Đã xác định được phân đoạn này có
khả năng phân giải mạnh cơ chất fibrin và có trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa
nên có thể là enzyme nattokinase, hoạt độ enzyme khoảng 300 FU/5 ml [5].
- Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh
dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng B. subtilis Natto NLSSE. Kết
quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành[27].
- LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase từ vi
khuẩn B. subtilis Natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%,
CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành: 3%[24].
- Ứng dụng khả năng làm tan và chống hình thành máu đông của chủng B.
subtilis Natto vào các lọai thực phẩm chức năng trên thị trường Việt Nam như:
Nattospes của Công ty TNHH dược phẩm Á Âu; Đậu tương Lên Men Natto Kinaza
của công ty TNHH Khoa Học Xanh Đức Thanh Mai; DOSAKA của Công ty cổ
phần xuất nhập khẩu y tế DOMESCO…
3. Mục tiêu nghiên cứu
Chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme
protease cao từ các chủng nghiên cứu.
2
Đồ án tốt nghiệp
Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B. subtilis Natto sinh
tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất.
Xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B.
subtilis Natto.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh protease cao.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis Natto
khi được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các điều kiện khác nhau như thành
phần cơ chất, tỉ lệ cơ chất, độ ẩm và thời gian nuôi cấy.
Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng
Bacillus subtilis Natto.
5. Phương pháp nghiên cứu
Thu thập thông tin từ sách báo và các trang mạng điện tử.
Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0.
Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài:
- Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
- Phương pháp tăng sinh.
- Phương pháp xác định mật độ tế bào (Phương pháp đếm khuẩn lạc).
- Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease.
- Phương pháp nuôi cấy bán rắn.
- Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn.
- Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson).
- Phương pháp tủa enzyme protease.
6. Kết quả đạt được
Đề tài với mục đích nghiên cứu thu nhận protease từ chủng cho hoạt độ enzyme
protease cao nhất trong năm chủng nghiên cứu là BN1, BN2.1, BN2.2, BN2.3 và
BN3. Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng
sinh tổng hợp protease cao hơn so với các chủng còn lại. Môi trường nuôi cấy thích
3
Đồ án tốt nghiệp
hợp cho hoạt độ protease tốt nhất là bã đậu nành và cám bắp. Với các điều kiện ảnh
hưởng đến khả năng tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 như: tỉ lệ cơ chất bã
đậu nành: cám bắp là 5:5, thời gian nuôi cấy là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu
thích hợp nhất là 60%. Chế phẩm enzyme protease tinh sạch sơ bộ từ chủng
Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng xúc tác tốt nhất tại pH 7.
7. Kết cấu đề tài nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu bao gồm 3 chương:
Chương 1: TỔNG QUAN
- Sơ lược về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto và enzyme protease.
- Giới thiệu ứng dụng và tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme protease trong
và ngoài nước.
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU
- Trình bày địa điểm, thời gian thí nghiệm, vật liệu thí nghiệm, môi trường
nghiên cứu, các phương pháp tiến hành và các phương pháp nghiên cứu.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
- Trình bày kết quả đạt được và nêu ý kiến thảo luận về đề tài nghiên cứu.
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
- Nêu kết luận và kiến nghị của nhóm thực hiện đề tài.
4
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto
1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto
Giới
Ngành
Lớp
Bacteria
Firmicutes
Bacilli
Bộ
Bacillales
Bacillaceae
Bacillus
subtilis
Họ
Giống
Loài
Phân loài Bacillus subtilis Natto.
“Nguồn: Keith H. Steinlraus (2004)”
1.1.2. Lịch sử phát hiện
B. subtilis Natto được sử dụng trong sản xuất thương mại thực phẩm Natto của
Nhật Bản. Chúng được tìm thấy bởi tiến sĩ Sawamura vào năm 1906 và được đặt
tên là Bacillus Natto Sawamura. Kể từ đó B. subtilis Natto được chấp thuận để dùng
cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc tác dụng lên hệ thần kinh vào năm 1968,
thuốc thú y vào năm 1990, phụ gia dinh dưỡng vào năm 1996. Và hiện đang thu hút
sự chú ý vì gần đây đã bắt đầu được sử dụng làm thực phẩm dành cho sức khỏe[55].
Khi mới được phát hiện ra, B. subtilis Natto được coi như là một loài vi sinh
vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. subtilis của
Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [28], [50], các khóa phân loại đã xếp B. subtilis
Natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác nhờ khả
năng lên men tạo sản phẩm Natto [40]. Trong dòng B. subtilis Natto còn có nhiều loại
như B. subtilis Natto B – 12 [21], B. subtilis Natto OK2 [47], B. subtilis Natto NRRL
3666 [39]
…
5
Đồ án tốt nghiệp
Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, những hạt đậu nành đã luộc
chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng
14 - 18 giờ[25],[46]. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được
hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis Natto có vai trò lên men hạt đậu,
gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn B. mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt
đặc trưng và vị ngọt. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình
qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis
Natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh
dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi
khuẩn B. subtilis Natto[46].
Hình 1.1. Sản phẩm Natto.
(Nguồn: healthplus.vn)
Chức năng của B. subtilis Natto[55]:
-
-
-
-
Tăng cường vi khuẩn có lợi.
Ức chế vi khuẩn đường ruột có hại.
Sản xuất các enzyme phân hủy protein và tinh bột
Xây dựng hệ thống vitamin nhóm B
6
Đồ án tốt nghiệp
1.1.3. Phân bố
B. subtilis Natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn
truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis Natto có nhiều
trong rơm rạ, cỏ khô... và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương. Vi
khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác
như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua... [40]
.
1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto
1.1.4.1. Đặc điểm hình thái
B. subtilis Natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào
tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với
nhau thành chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn
và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề
mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [22],[23]
.
Bào tử
Tế bào vi khuẩn
Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto (độ phòng đại 100 lần).
“Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]”
1.1.4.2. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis Natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể
phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis Natto phát triển trong khoảng nhiệt
độ rộng (30 – 50oC), tối thích là 37oC. Ở 55oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly
7
Đồ án tốt nghiệp
giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40oC,
bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0oC. B. subtilis Natto phát triển ở pH
trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6. Sự nảy
chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [23]
.
1.1.4.3. Đặc điểm sinh hoá
B. subtilis Natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose..., đường đôi như maltose, lactose,
saccharose..., polysaccharid như tinh bột... Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển
của vi khuẩn là protein và amino acid. B. subtilis Natto có thể sử dụng dễ dàng acid
glutamic, arginin, acid aspartic... nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan,
phenylalanin và methionin [23]
Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis
.
Phản ứng sinh hóa
Hoạt tính catalase
Sinh indol
Kết quả
+
-
MR
+
+
+
+
+
+
+
+
+
VP
Sử dụng citrate
Khử nitrate
Tan chảy gelatin
Phân giải tinh bột
Arabinose
Xylose
Saccharose
8
Đồ án tốt nghiệp
Mannitol
Glucose
Lactose
Maltose
+
+
-
+
(Theo Holt, 1992)
1.1.4.4. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis Natto
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis Natto có khả năng sinh
tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ–
transpeptidase theo Noda năm 1989[30] và Ogawa năm 1991[52]; amylase theo
Yamane K năm 1974 [31]; phytase theo Kerovuo J năm 1998 [29], Shimizu M năm
1992 [36]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [48]; và nhóm enzyme được nghiên cứu
nhiều nhất là protease [21],[ [33],[34],[50],[53]
.
Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis Natto như sau:
o Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay
subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có
275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7 kDa đến
29 kDa [21],[33]. Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được
nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học.
o Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [42]
.
Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt
tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50oC; bị bất hoạt bởi diisopropyl
fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [32]
.
o Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba
xúc tác: Ser, His, Asp[45].
o Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho hoạt
động của enzyme là 55oC, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33,
His81, Ser259 [49],[53]
.
9
Đồ án tốt nghiệp
1.2. Enzyme protease
1.2.1. Khái niệm về protease[1]
Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO - NH) trong
phân tử protein và các cơ chất tương tự.
Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide.
“Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]”
Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên
kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là
các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este
và vận chuyển amino acid.
Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm
phụ:
Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch
polypeptit
Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của
mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase.
Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.
Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
10
Đồ án tốt nghiệp
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.
Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease.
“Nguồn: Tống Ngọc Triêm(2010)[16]”
1.2.2. Phân loại [9]
Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh
vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động
thích hợp… các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm
như sau:
o Protease – xerin
o Protease – thiol
o Protease – kim loại
o Protease – acid
Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao
gồm:
o Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
11
Tải về để xem bản đầy đủ
74 trang
12720
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- do_an_khao_sat_cac_yeu_to_anh_huong_den_kha_nang_sinh_tong_h.pdf
