Báo cáo tóm tắt Đề tài Xác định thành phần hóa học và thử nghiệm một số hoạt chất sinh học có khả năng ức chế tế bào ung thư từ hoa đu đủ đực

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC CÓ

KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ TỪ

HOA ĐU ĐỦ ĐỰC

Mã số: B2017.DNA.04 (KYTH-56)

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Giang Thị Kim Liên

Đà Nẵng, 2019

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA

NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

Đơn vị công tác và lĩnh vực chuyên

TT

1

Họ và tên

môn

S TS i ng Thị i iên

Đ i học Đà ng H h u cơ

Viện Hoá học – Viện Hàn lâ

KH&CNVN, Hoá học

2

3

4

5

6

7

8

9

TS Trần Thị hương Thảo

TS h Hải n

Viện Hoá sinh biển – Viện Hàn lâ

KH&CNVN

Trường Đ i học Sư ph – Đ i học

Đà ng Hoá sinh

S TS guyễn Bá Trung

ThS Trần Th nh Hải

Bệnh viện Quân y 17 – Dược học

TS h Văn Vượng

TS guyễn Minh Hiền

ThS h Thị hương Dung

ThS h n Quốc Vinh

Trường Đ i học Sư ph – Đ i học

Đà ng Sinh hoá h u cơ

Trường TH T Chuyên ê Quý

Đôn T Đà ng Hoá

Giáo viên Hoá

DANH SÁCH CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

1. Bệnh viện C17 Đà ng

2. Công ty C phần Dược D n ph Đà ng

MỤC LỤC

Trang

1

2

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Mục tiêu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

h vi nghiên cứu

hương pháp nghiên cứu

ội dung nghiên cứu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1 1 iới thiệu về cây đu đủ

1.2. ghiên cứu về thành phần h học củ cây đu đủ trong nước

1 3 ghiên cứu về thành phần h học củ cây đu đủ ngoài nước

1 4 h ng nghiên cứu về ho t tính sinh học củ cây đu đủ

1 5 h ng vấn đề cần nghiên cứu ti p theo

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2

2 1 guyên liệu h chất và thi t bị

2 1 1 guyên liệu

2

3

2 1 2 H chất dụng cụ và thi t bị

2 2 Sơ đồ nghiên cứu t ng thể

2.3. Các phương pháp nghiên cứu

2 3 1 hương pháp chi t ẫu thực vật và phân lập các chất h học

2 3 2 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc hợp chất

2 3 3 Các phương pháp thử ho t tính sinh học

2 3 4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho c o dược liệu

2.4. Các bước thực nghiệ

3

2.4 1 hảo sát sàng lọc ho t tính gây độc t bào ung thư củ các

phân đo n c o chi t

3

2.4 2 Định tính một số lớp chất hóa học trong ho đu đủ đực

2.4.3 Chi t ẫu và phân lập các chất h học

4

2.4.4. Thử nghiệ ho t tính gây độc t bào ung thư củ các hợp

chất phân lập được từ ho đu đủ đực

5

2 3 5 Chi t xuất c o dược liệu từ ho đu đủ đực

5

6

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3 1 t quả thử ho t tính gây độc t bào ung thư củ các c n chi t

3 1 1 t quả thử ho t tính gây độc t bào ung c n chi t nước t ng

và các phân đo n từ dịch chi t nước

3 1 2 t quả thử ho t tính gây độc t bào ung củ c n chi t

eth nol t ng và các phân đo n từ dịch chi t eth nol

6

7

3 1 3 t quả thử ho t tính gây độc t bào ung thư củ c n chi t

eth nol t ng và các phân đo n từ dịch chi t eth nol

3 2 t quả định tính sơ bộ các lớp chất h học

7

8

9

3 3 Xác định cấu trúc h học và ho t tính gây độc t bào ung thư

củ các hợp chất đã phân lập

3 3 1 Các hợp chất phân lập được từ phân đo n dịch chi t

chloroform

9

3 3 2 Các hợp chất phân lập được từ phân đo n dịch chi t

dichloromethane

11

3 3 3 Các hợp chất phân lập được từ phân đo n dịch chi t ethyl

12

13

acetate

3.3 4 Ho t tính gây độc t bào ung thư củ ột số chất đã phân lập

3.4 t quả bào ch và xây dựng tiêu cuẩn cơ sở cho c o dược liệu

từ ho đu đủ đực

14

3 4 1 C o dược liệu với dung ôi chi t xuất là nước

3 4 2 C o dược liệu với dung ôi chi t xuất là cồn

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

14

15

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Tên bảng

Số hiệu

bảng

Trang

t quả thử ho t tính gây độc t bào của c n

chi t nước t ng và các phân đo n

t quả thử ho t tính gây độc t bào của c n

chi t methanol t ng và các phân đo n

3.1.

3.2.

6

7

t quả thử ho t tính gây độc t bào củ c n

chi t eth nol t ng và các phân đo n

3.3.

3.4.

3.5.

8

Định tính các lớp chất trong ho đu đủ đực

13

Số liệu ph ¹H và C-NMR của hợp chất C1 và

10

hợp chất thamkhảo

Ho t tính gây độc t bào ung thư củ các hợp

chất đã phân lập

3.12.

13

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Số hiệu

hình

Tên hình

Trang

2.2.

2.3.

2.4.

Sơ đồ nghiên cứu t ng thể

3

4

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đo n c n

chi t chlorofor ho đu đủ đực

Sơ đồ phân lập các chất từ c n

dicholoro eth ne củ ho đu đủ đực

Sơ đồ phân lập các chất từ c n ethyl cet te

củ ho đu đủ đực

h ¹H- MR củ chất C1

5

2.5.

3.2.

3.3.

6

9

h ¹³C- MR củ chất C1

10

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

d:

Doublet (NMR)

J(Hz):

R_f:

Hằng số tương tác ( MR)

Retention factor

s:

Singlet (NMR)

ppm:

Parts per million

δ:

Độ chuyển dịch h học ( MR)

Butanol

Methanol - D

chloroform

Dichlomethane

BuOH:

CD₃OD:

CHCl₃:

D:

DMSO:

EtOAc:

IR:

Dimethyl sunfoxide

Ethyl acetate

Infrared

MS:

Mass spectroscopy

LC-MS:

DEPT:

EtOH:

HMBC:

HSQC:

MeOH:

Me:

Liquid Chromatography - Mass spectroscopy

Distortionless enhancement by polarisation transfer

Ethanol

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Heteronuclear Single Quantum Corelation

Methanol

Methyl

NMR:

NOESY:

UV:

Nuclear magnetic resonance

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Ultraviolet

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung

Tên đề tài: Xác định thành phần hóa học và thử nghiệm một số hoạt chất

sinh học có khả năng ức chế tế bào ung thư từ hoa đu đủ đực

Mã số: B2017.DNA.04 (KYTH-56)

Tổ chức chủ trì đề tài: Đại học Đà Nẵng

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Giang Thị Kim Liên

Thời gian thực hiện: từ 01/2017 đến 12/2018

2. Mục tiêu:

Xác định được cấu trúc các hoạt chất sinh học từ hoa đu đủ đực có

khả năng ức chế tế bào ung thư

3. Tính mới và sáng tạo:

- Phân lập được 24 hợp chất từ hoa đu đủ dực, trong đó có 1 hợp

chất phenol mới và 1 hợp chất lần đầu được phân lập từ thiên nhiên. Công

bố hoạt tính ức chế tế bào ung thư của một số hợp chất phân lập được.

- Bào chế cao dược liệu từ hoa đu đủ đực và xây dựng tiêu chuẩn

cơ sở cho cao dược liệu.

4. Kết quả nghiên cứu:

4.1- ịch chiế ớc, methanol, ethanol 80% của hoa Đu đủ

đự đ h h đ h đoạ h ng lọ hoạ h đ

ế o u h

ết quả thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào

ung thư phổi, ung thư gan và ung thư vú của 11 phân đoạn từ 3 dịch chiết

tổng nói trên cho thấy:

- Các phân đoạn N/E_T, N/N; M/E_T, M/M; E/H, E/E_T, E/E đều không thể

hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm.

- Phân đoạn M/H thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung

thư phổi với phần trăm tế bào sống sót bằng 29,69 ± 1,73 ở nồng độ 100

µg/mL.

- Phân đoạn E/C thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trên dòng tế

bào ung thư gan với phần trăm tế bào sống sót bằng 49,91 ± 2,22 ở nồng độ

100 µg/mL.

- Phân đoạn N/C thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên 2 dòng tế

bào ung thư phổi và tế bào ung thư vú với phần trăm tế bào sống sót lần

lượt bằng 39,73 ± 0,33 và 48,03 ± 1,24 ở nồng độ 100 µg/mL.

- Phân đoạn M/C thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với cả 3

dòng tế bào ung thư phổi, tế bào ung thư gan và tế bào ung thư vú với phần

trăm tế bào sống sót lần lượt bằng 35,76 ± 0,50; 46,81 ± 3,75 và 38,24 ±

1,60 ở nồng độ 100 µg/mL.

4.2- Phân lậ x đị h đ c cấu trúc của 24 h p chất hóa học t 3

cặn chiết chọn lọc t hoa đu đủ đực

a. 2 chất sạch từ cặn chiết chloroform;

b. 15 chất sạch từ cặn chiết dichloromethane (một chất trùng với chất

từ cặn chiết chloroform), trong đó theo tra cứu tài liệu đến thời điêm này,

chất CP12A có cấu trúc của một hợp chất phenolic mới, lần đầu được phân

lập từ thiên nhiên và từ hoa đu đủ đực, được đặt tên là caricapapayin;.

c. 8 chất sạch từ cặn chiết ethyl acetate.

4.3- Kế quả h hoạ h đ ế o u h ủa hấ h ậ

hoa đu đủ đự

ết quả cho thấy các chất CP17A, 19, 21 và CPE1,2 không thể

hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu. Nhóm các chất CP còn lại có hoạt

tính với IC₅₀từ 30,70-86,03 g/ml. Nhóm chất CPE còn lại có hoạt tính

với IC₅₀từ 26,72-91,37 g/ml.

4.4- Đ o hế và xây dự đ c tiêu chuẩ ơ ở cho 2 loại ao c

liệu t u môi ớc và dung môi cồn.

Kết quả cho thấy cao đặc hoa đu đủ đực thể hiện hoạt tính gây độc

tế bào ung thư trên cả 3 dòng tế bào ung thư phổi A549, ung thư gan

Hep3B, ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 30 µg/mL và 100 µg/mL với các

mức độ khác nhau. Kết quả này là cơ sở khoa học cho việc định hướng bào

chế cao dược liệu thử nghiệm invitro và hướng đến ứng dụng trong thực tế.

5. Sản phẩm:

- 01 bài báo đăng trên tạp chí ISI.

- 02 bài báo đăng trên tạp chí chuyên ngành trong nước.

- Hướng dẫn 01 thạc sĩ bảo vệ luận văn thành công đã nhận bằng thạc sĩ.

- Hỗ trợ hướng dẫn 01 NCS đã bảo vệ thành công 3 chuyên đề tiến sĩ

- Quy trình phân lập chất từ hoa đu đủ đực.

- Bộ số liệu phổ xác định cấu trúc các hợp chất.

- Báo cáo kết quả thử nghiệm hoạt chất sinh học ức chế tế bào ung thư của

hoa đu đủ đực

- Hai loại cao chế phẩm từ hoa đu đủ đực với hai loại dung môi khác nhau

là cồn và nước (mỗi loại 120 g).

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information:

- Project title: Study on chemical compounds and cytotoxic activity of

some bioactive compounds extracted from the male papaya flower (carica

papaya l.)

- Code number: B2017.DNA.04 (KYTH-56)

- Coordinator: Ass.Prof.Dr Giang Thi Kim Lien

- Implementing institution: The University of Danang

- Duration: from 01/2017 to 12/2018

2. Objective(s):

Determine structures of the bioactive compounds isolated from the

male papaya flower (carica papaya l.)

3. Creativeness and innovativeness:

- A new phenolic was isolated from male papaya flower named

caricapapayin. Also, compound 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-

2-carbaldehyde has not been reported from natural source.

- The basic standards for 2 types of medicinal herbs with ancohol

and water solvents have been prepared and developed.

4. Research results:

4.1. The study was conducted to determine the cytotoxic activity of some

extracts and fractions from the male papaya flower (Carica papaya L.) for

lung cancer cell lines (A549), liver cancer cells (Hep3B) and breast cancer

cells (MCF-7). Results showed that extracts of water, methanol, ethanol

80% and n-hexane, ethyl acetate and water fractions showed no cytotoxic

activity on all of A549, Hep3B and MCF-7 cell lines excluding the n-

hexane fraction in methanol extracts demonstrating cytotoxic activity on

A549 cell line with survival cell percentage of 29,69 ± 1,73. The

chloroform fractions from water, methanol, ethanol 80% showed very good

cytotoxic activity on all of A549, Hep3B and MCF-7 cell lines.

Specifically, the chloroform fraction from the water extract showed

cytotoxic activity on A549 and MCF-7 cell lines with a survival cell

percentage of 39,37 ± 0,33 and 48,03 ± 1,24, respectively; chloroform

fraction from methanol extract showed cytotoxic activity on all of A549,

Hep3B and MCF-7 cell lines with a survival cell percentage of 35,76 ±

2,50; 46,81 ± 3,75 and 38,24 ± 1,60, respectively; the chloroform fraction

from the ethanol 80% extract only showed cytotoxic activity on the Hep3B

cell line with a survival cell percentage of 49,91 ± 2,22.

4.2. 24 compounds were isolated from a chloroform extract of male Carica

papaya L. flowers.

- Two compounds Kaempferol and β-sitosterol glucoside were

isolated from a chloroform extract of male Carica papaya L.

flowers.

- Fifteen compounds were isolated from dichloromethane extaction

of male Carica papaya L. flowers (one of them is the same as the

compound from chloroform extract).

A

new phenolic

(caricapapayin) and 14 known compounds were isolated from

dichloromethane extract of the C. papaya flowers. Their structures

were determined by analysis of HR-ESI-MS, NMR spectral data,

and comparison with the literature. Among known compounds,

compound 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde

has not been reported from natural source.

- Eight flavonoids, kaempferol, quercetin, quercitrin, kaempferol 3-

O-glucopyranoside, kaempferol 3-O-rhamnopyranoside, quercetin 3-O-β-

D-galactopyranoside, kaempferol 3-O-arabinopyranoside, myricitrin, were

isolated from a ethyl acetate extract of male Carica papaya L. flowers.

Their structures were determined by NMR, MS spectra and in comparison

with the reported data.

4.3- Results of cancer cell toxicity test of isolated substances from male

papaya flowers showed that CP17A, 19, 21 and CPE1,2 did not exhibited

tyrosinase inhibitory activity at the study concentrations. The remaining

group of CP substances exhibited tyrosinase inhibitory activity with IC₅₀at

30.70-86.03 g / ml. The remaining CPE group exhibited tyrosinase

inhibitory activity with IC₅₀from 26.72-91.37 g / ml, respectively.

4.4. The basic standards for 2 types of medicinal herbs with ancohol and

water solvents have been prepared and developed.

The results showed that highly male papaya flowers exhibited

cytotoxic activity on all 3 lung cancer cell lines A549, liver cancer Hep3B,

breast cancer MCF-7 at a concentration of 30 µg / mL and 100 µg / mL

respectively. This result is the scientific basis for orienting high dosage

pharmaceuticals for invitro testing and towards practical applications.

5. Products:

- 01 paper was published on the ISI journal.

- 02 paper was published on the VN journal.

- Successfully supervised one Master thesis.

- Supporting guidance for 01 PhD successfully defended 3 doctoral topics.

- Isolation procedure of compounds.

- Results of cancer cell toxicity test of isolated substances from male

papaya flowers.

- Spectum data for determining structure of compounds.

- Two types of medicinal herbs from male papaya flowers with two

different slovents (120 g for each type).

6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits

of research result:

- Research results can be used as references for PhD, Master student and

other scientists studying on Chemistry – Pharmacy fields.

- Medicinal herbs from male papaya flowers and basic standards are the

scientific basis for the development of practical application of products

supporting for cancer treatment.

- Successfully supervised one Master thesis.

- Supporting guidance for 01 PhD student.

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc

từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở Việt Nam, đu đủ được trồng hầu hết ở các

tỉnh miền Bắc và miền Nam, được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc

theo các con sông, trên các loại đất phù sa. Cây đu đủ có lợi thế là loại cây

dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều

được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Ở nước ta, trong dân gian lá

đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét,

trừ giun sán… Người dân Úc đã dùng lá đu đủ chữa trị bệnh ung thư…

Với công dụng chữa bệnh của cây đu đủ như trên, có rất nhiều đề tài

nghiên c u đã t p trung ác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của loài cây này, nhưng vẫn c n rất ít nghiên c u về bộ ph n hoa của ch ng.

Vì v y, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là ch ng minh được

thành phần hoạt chất cụ thể của hoa đu đủ đực là cần thiết, tạo cơ sở khoa học

cho việc ng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam trong thực tiễn.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được cấu tr c các hoạt chất sinh học từ hoa đu đủ đực có khả

năng c chế tế bào ung thư .

3. Đối tƣợng nghiên cứu

Hoa đu đủ đực thu hái tại Quảng Nam-Đà Nẵng; Các dịch chiết từ hoa

đu đủ đực; Các hợp chất phân l p từ hoa đu đủ đực.

4. Phạm vi nghiên cứu

Chiết uất hoa đu đủ đực bằng các dung môi khác nhau, lựa chọn một

số cao chiết để phân l p các hợp chất. Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào

ung thư, chiết uất và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cao chiết.

5. Phƣơng pháp nghiên cứu

* Các phương pháp nghiên cứu lý thuyết

* Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

5. Nội dung nghiên cứu

5 ghiên cứu t ng qu n

5 2 ghiên cứu thành phần hó học củ ho đu đủ đực

- Định danh một số nhóm hợp chất chính trong hoa đu đủ đực

- Nghiên c u sàng lọc các dịch chiết, phân đoạn dịch chiết theo định

hướng c chế dòng tế bào ung thư

- Nghiên c u phân l p, ác định cấu trúc của các chất tinh sạch.

2

5 3 Thử độc tính ức chế tế bào ung thư

Thử tác dụng c chế tế bào ung thư in vitro của cao chiết và các chất

tinh khiết phân l p được.

5.4. Chiết xuất c o có khả năng ức chế tế bào ung thư từ ho đu đủ đực

- Nghiên c u xây dựng quy trình chiết xuất cao dược liệu với hai loại

dung môi khác nhau là nước và cồn.

- Chiết xuất tối thiểu 100g cao theo quy trình đã ây dựng.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về cây đu đủ

Đu đủ (Carica Papaya Linn), thuộc họ đu đủ (Caricaceae), nguồn gốc

Châu Mỹ được trồng khắp nơi ở nước ta. Họ đu đủ trên thế giới gồm có 4

chi và 45 loài. Ở Việt Nam, một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng

bao gồm: đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ

Thái Lan và đu đủ Đài Loan.

1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây đu đủ trong nƣớc

Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết uất và ác định

được alkaloid carpaine trong lá đu đủ. Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã

sử dụng kỹ thu t HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá đu đủ.

Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân l p được 4 chất từ phân đoạn chiết

n-he an của lá đu đủ. Năm 2014, Hồ Thị Hà từ cặn chiết CH₂Cl₂phân l p

được 6 hợp chất. Năm 2015, Giang Thị Kim Liên và cộng sự khảo sát sơ

bộ thành phần hóa học của hoa đu đủ đực.

1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây đu đu ngoài nƣớc

Các kết quả nghiên c u công bố các hợp chất alcaloid, phenol có trong

lá đu đủ. Một số nghiên c u cho thấy trong hoa đu đủ đực có ch a một số

triterpenoids/steroid, flavonoid, tannin, và glycosides, saponin.

1.4. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đu đủ

Các công bố về hoạt tính của cây đu đủ gồm: Tác dụng trị giun sán, hạ

huyết áp; kháng sinh, kháng nấm; trị u bướu, ung thư; chống o i hóa.

1.5. Những vấn đề cần nghiên cứu tiếp theo

Xác định được cấu tr c các hoạt chất sinh học từ hoa đu đủ đực có khả

năng c chế tế bào ung thư.

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2 guyên liệu

3

Hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) được thu hái tại Quảng Nam – Đà

Nẵng khoảng từ tháng 12 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017, rửa sạch sấy

khô, bảo quản để sử dụng cho nhiều quá trình thực nghiệm.

2 2 Hó chất, dụng cụ và thiết bị

Dung môi dùng để chiết mẫu và triển khai sắc kí: n-hexan, CH₃Cl,

CH₂Cl₂, EtOAc, MeOH và BuOH. Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng

nhôm tráng sẵn silica gel 60GF₂₅₄, độ dày 0,2mm. Cột sắc ký với chất hấp

phụ là silicagel cỡ hạt 0,040 – 0,063mm Merck; cột sắc ký silicagel pha

đảo RP-18, cột sắc kí Sephadex. Các thiết bị ác định cấu tr c chất: Phổ

cộng hưởng từ hạt nhân NMR, khối phổ MS,…

2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng thể

Bột hoa đu đủ đực

1. Khảo sát, sàng lọc hoạt tính sinh học

2. Định tính một số lớp chất hóa học

3. Chiết tổng (CH₃OH-H₂O)/chiết lần lượt với các

dung môi: n-hexane, CH₃Cl/CH₂Cl₂, ethyl

acetate, n-butanol; Cất loại dung môi

6. Bào chế cao dược liệu bằng dung

môi nước và dung môi cồn

7. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của các

cao dược liệu – chế phẩm

4. Lựa chọn cao chiết để phân l p chất; Xác

định cấu trúc các hợp chất

8. Thử hoạt tính sinh học, khả năng c

chế ung thư của các chế phẩm

5. Thử hoạt tính sinh học, khả năng c

chế ung thư của các hợp chất

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tổng thể

2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu

2 3 Phương pháp chiết mẫu thực vật và phân lập các chất hó học

2 3 2 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc hợp chất

2 3 3 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học

2 3 4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho c o dược liệu

2.4. Các bƣớc thực nghiệm

2.4 Khảo sát sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư củ các phân

đoạn c o chiết

a. Điều chế các dịch chiết và phân đoạn từ hoa đu đủ đực:

4

Lấy 3 mẫu, mỗi mẫu 100 gam hoa đu đủ đực khô, chiết với 3 dung môi

khác nhau là nước (N), methanol (M), ethanol 80% (E) cất loại dung môi

thu được 3 cao chiết. Phân bố 3 cao chiết vào nước và chiết phân đoạn lần

lượt với n-hexane (H), chloroform (C), ethyl acetate (E_T) thu được 11

phân đoạn dịch chiết và cao chiết tương ng.

b. Khảo sát sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cặn

chiết: Các d ng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: tế

bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư gan (Hep3B) và tế bào ung thư

vú (MCF-7). Quá trình thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng

phương pháp thử MTT, được thực hiện tại Ph ng thử hoạt tính sinh học –

Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.4.2. Định tính một số lớp chất hóa học trong ho đu đủ đực:

Các hợp chất: alkaloid, flavonoid, coumarin, saponin, đường khử,

polyphenol, steroid, a it hữu cơ, chất béo, carotene, polysaccairid, iridoid.

2.4.3 Chiết mẫu và phân lập các chất hó học

a Chiết mẫu và lự chọn c o chiết để phân lập chất

b. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết chloroform

Sơ đồ phân l p các hợp chất từ cao chiết chloroform được trình

bày trên hình 2.3.

Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn cặn chiết

chloroform hoa Đu đủ đực

c Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane

5

Sơ đồ phân l p các hợp chất từ cao chiết dichloromethane được

trình bày trên hình 2.4.

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn dicholoromethane của hoa

đu đủ đực

d Phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate

Sơ đồ phân l p các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate được trình bày

trên hình 2.5.

e Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ ho đu đủ đực

2.4.4. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất

phân lập đƣợc từ hoa đu đủ đực

Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân

l p được từ hoa đu đủ đực bằng phương pháp thử SRB, thực hiện tại Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Hàn làm KH&CN Việt Nam.

2.4.5. Chiết xuất cao dƣợc liệu từ hoa đu đủ đực

Chiết uất cao dược liệu bằng 2 loại dung môi nước và cồn, ây dựng

tiêu chuẩn cơ sở theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam.

6

Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn ethyl acetate

của hoa đu đủ đực

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các cặn chiết

3.1.1 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung cặn chiết nước t ng và

các phân đoạn từ dịch chiết nước

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết nước tổng và các

phân đoạn được trình bày trên Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết nƣớc tổng

và các phân đoạn

TB sống sót (%)

N. độ

Mẫu

(µg/mL)

A549

% TB

sống

Hep3B

% TB

sống

MCF-7

% TB

Sai

số

Sai

số

Sai

số

sống

100,00

70,25

60,28

54,68

48,03

70,13

100,00 2,40 100,00 1,89

3,76

1,77

2,87

2,11

1,24

0,65

30

100

30

100

30

78,50

95,71

57,26

39,73

98,02

2,18

3,24

1,25

0,33

2,21

75,28

57,12

86,89

77,53

65,10

1,40

1,75

0,30

2,67

1,54

N/T

N/C

N/E_T