Báo cáo tóm tắt Đề tài Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh có hoạt tính xử lý sulfate từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp. được phân lập từ phân trâu bò
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
BÁO CÁO TÓM TẮT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH CÓ HOẠT TÍNH XỬ
LÝ SULFATE TỪ CHỦNG VI KHUẨN DESULFOVIBRIO SP.
ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN TRÂU BÕ
MÃ SỐ: Đ2015-03-75
Chủ nhiệm đề tài: TS. Phạm Thị Mỹ
Đà Nẵng, 09/2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
BÁO CÁO TÓM TẮT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH CÓ HOẠT TÍNH XỬ
LÝ SULFATE TỪ CHỦNG VI KHUẨN DESULFOVIBRIO SP.
ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN TRÂU BÕ
MÃ SỐ: Đ2015-03-75
Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài
Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ và tên, đóng dấu)
(ký, họ và tên)
TS. Phạm Thị Mỹ
Đà Nẵng, 09/2016
NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
Đơn vị công tác và
lĩnh vực chuyên môn
TT
Họ và tên
1
TS. Bùi Xuân Đông
Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa, Đại
học Đà Nẵng
2
ThS. Nguyễn Thị Lan Phương
Khoa Sinh – Môi Trường – Trường Đại học Sư
phạm, Đại học Đà Nẵng
3
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SRB
Cyt C
ATP
ADN
GC
: Sulphate Reducing Bacteria
: Cytochrome C
: Adenosine triphosphate
: Acid deoxyribonucleic
: Guanine and Cytosine
: Phòng thí nghiệm
PTN
OD
: Mật độ quang học
: Colony-forming unit
: Vi sinh vật
CFU
VSV
4
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất chế phẩn vi sinh có hoạt tính xử lý
sulfate từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp. đƣợc phân lập từ phân trâu bò
- Mã số: Đ2015-03-75
- Chủ nhiệm: TS. Phạm Thị Mỹ
- Thành viên tham gia: TS. Bùi Xuân Đông, ThS. Nguyễn Thị Lan Phương
- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm– Đại học Đà Nẵng
- Thời gian thực hiện: từ 01 tháng 10 năm 2015 đến 30 tháng 09 năm 2016
2. Mục tiêu:
- Sản xuất được chế phẩm sinh học có hoạt tính xử lý sulfate từ chủng vi
khuẩn Desulfovibrio sp. phân lập từ phân trâu, bò.
- Khảo sát khả năng xử lý nước nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng thí nghiệm
(PTN)
3. Tính mới và sáng tạo:
Bước đầu phân lập được chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp. có hoạt lực xử lý
sulfate ở điều kiện của Việt Nam. Từ vi khuẩn phân lập được đã tiến hành sản xuất
chế phẩm sinh học để thử nghiệm trong xử lý nước ở quy mô PTN. Kết quả thu
được từ đề tài là tiền đề để nhóm nghiên cứu xây dựng phương pháp xử lý nước
nhiễm sulfate và ion kim loại nặng ở quy mô lớn hơn.
4. Tóm tắt kết quả nghiên cứu:
Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã thu được những kết quả cơ bản
sau đây:
1. Đã phân lập được chủng vi khuẩn có hoạt tính khử sulfate là Desulfovibrio
sp. từ phân trâu, bò. Vi khuẩn đã được định danh tới chi dựa theo khóa phân loại
Bergey (Bergey‘s Manual of SystematicBacteriology), với một số đặc điểm như sau:
vi khuẩn hình dấu phẩy; Gram âm; sinh trưởng tốt trên nguồn cơ chất là lactate;
điều kiện môi trường thích ứng: pH thích hợp từ 6 - 8, tối ưu ở pH 7, phát triển ở
nhiệt độ 300C. Vi khuẩn có khả năng phát triển tốt ở nồng độ muối <5 g/l (tương
5
đương môi trường nước ngọt). Giống vi khuẩn Desulfovibrio sp. có thể được bảo
quản bằng phương pháp giữ giống VSV trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng.
2. Đã khảo sát và xác định được các thông số của quá trình lên men thu sinh
khối Desulfovibrio sp. như sau: Môi trường dinh dưỡng là N92M2; pH môi trường
dinh dưỡng bằng 7; nhiệt độ nuôi cấy t= 30 ± 2ºC; thời gian nuôi cấy = 72 giờ;
khuấy đảo trong suốt quá trình nuôi cấy trên máy lắc; mật độ tế bào ở thời điểm thu
sinh khối đạt 9,5x108 CFU/ml canh trường.
3. Tạo chế phẩm vi sinh chứa vi khuẩn Desulfovibrio sp. có hoạt tính khử
sulfate như sau: sinh khối sau khi thu hồi bằng phương pháp ly tâm, đã phối trộn
với chất mang vô trùng (100% than bùn + 5% CaCO3 + vi lượng) với tỉ lệ 10%
4. Đã khảo sát hiệu quả xử lý nước nhiễm phèn sắt bằng chế phẩm sinh học
chứa chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp. ở quy mô PTN. Kết quả thí nghiệm cho thấy
sau 8 ngày xử lý pH của mẫu nước nhiễm phèn sắt tăng từ 3,8 lên 7,4; hàm lượng
H2S trong nước tăng lên gấp 2 lần chứng minh hàm lượng SO42+ đã giảm đi sau quá
trình xử lý bằng vi khuẩn SRB. Bên cạnh đó H2S có thể dễ dàng loại bỏ ra khỏi
nước vì chúng ít tan trong nước (H2S có liên kết cộng hóa trị không phân cực).
Kết quả nghiên cứu cũng chứng minh sau quá trình xử lý bằng vi khuẩn SRB
hàm lượng ion sắt [Fe2+] giảm đi 2 lần. Điểm này giải thích bằng việc vi khuẩn SRB
đã cố định ion Fe2+ và làm chúng lắng xuống bể UASB.
5. Tên sản phẩm:
- Sản phẩm ứng dụng:
500 gr chế phẩm vi sinh dạng khô chứa vi khuẩn Desulfovibrio sp. với mật
độ 10-50.107 CFU/ml
- Sản phẩm khoa học:
Bài báo quốc tế:
Pham Thi My, Bui Xuan Dong, Nguyen Thi Lan Phuong (2015).
Physiological characteristics of the sulphate-reducing bacteria isolated from
cattle manure. Journal: European Applied Sciences (Germany). No: 09/2015.
Pages: 52-55. Year 2015 (ISSN 2195-2183).
6
Bài báo trong nước:
Bùi Xuân Đông, Phạm Thị Mỹ, Trịnh Thị Mỹ Hạnh, Hà Ngọc Tuấn, Lê Thị
6. Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng
áp dụng:
- Hiệu quả về công tác giảng dạy:
Cung cấp thông tin khoa học phục vụ công tác giảng dạy học phần Công
nghệ vi sinh cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học và kĩ thuật môi trường tại
Trường Đại học Sư phạm và các trường thành viên của Đại học Đà Nẵng.
- Kế hoạch chuyển giao kết quả nghiên cứu:
Chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn Desulfovibrio sp. có hoạt tính khử sulfate
sau khi nhiệm thu sẽ được được đăng tải trên chợ trực tuyến: Chợ công nghệ và
đầu tư.
Ngày 10 tháng 09 năm 2016
Cơ quan Chủ trì
Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ và tên, đóng dấu)
(ký, họ và tên)
TS. Phạm Thị Mỹ
7
UNIVERSITY OF DANANG
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
Project title: A study on the production of bioproduct possing bioactivy of
sulfate subtraction from Desulfovibrio sp. isolated from cattle manure
Code number: Đ 2015-03-75
Project Leader: PhD. Pham Thi My
Coordinator: PhD. Bui Xuan Dong, MSc. Nguyen Thi Lan Phuong
2. Objective(s):
-
Producing bio-compound with the ability of desulfurization from
Desulfovibrio sp. isolated from cattle excrements
-
Observing the treatment capability of polluted water that
contaminated by Fe2(SO4)3.nH2O in experimental scale.
3. Creativeness and innovativeness:
Initially isolating Desulfovibrio sp. bacteria that could breakdown sulfate
under Vietnamese conditions, then we produced bio-compound for water treatment
in laboratory scale. The obtained outcome would be the premise for research team
to design the treatment method of sulfate and heavy metal contaminated water in the
large scale in the future.
4. Research results:
- Desulfurized Desulfovibrio sp. (named by Bergey‘s Manual of Systematic
Bacteriology) bacteria was isolated from cattle excrements, having some following
characteristics : the gram-negative bacteria are comma-shaped; it well grows in
lactate medium; optimum pH 6 to 8 (best at 7), temperature at 30oC and salinity at
<5g/l (as fresh water). Desulfovibrio sp. is conserved by solid medium cover with
mineral oil layer.
8
- Fermentation parameters of Desulfovibrio sp.: medium N92M2; pH 7;
temperature t= 30 ± 2ºC; duration = 72 hours; stirring whole time; cell
concentration at the optimum point was 9,5x108 CFU/ml.
- Bio-compound was made by the following technique: biomass was
harvested by cold centrifugal then mixed with 10% of decontaminated carrier
(100% peat : 5% CaCO3: micronutrients).
- The effectiveness of water treatment using Desulfovibrio sp. bio-
compound was observed in laboratory. As a result, after 8 days of treatment, pH
increased from 3.8 to 7.4; H2S concentration increased double, which proved that
2+
SO4 concentration had decreased by using SRB process. Besides, H2S could be
removed easily from water because it is less-soluble in water.
In addition, the results also proved that Fe2+ reduced half of the initial
concentration which means that SRB bacteria had immobilized Fe2+ and deposit
sediment in UASB tank.
5. Products:
- Application product
Applicable product: 500 gram of the compound contain Desulfovibrio sp.
bacteria with density of 10-50.107 CFU/ml
- Science product
International Journal:
Pham Thi My, Bui Xuan Dong, Nguyen Thi Lan Phuong (2015).
Physiological characteristics of the sulphate-reducing bacteria isolated from
cattle manure. Journal: European Applied Sciences (Germany). No: 09/2015.
Pages: 52-55. Year 2015 (ISSN 2195-2183).
National Journal:
Bui Xuan Dong, Pham Thi My et all (2015). Investigating treating
6. Effects, transfer alternatives of research results and applicability:
9
- Education:
Providing applicable and accessible scientific reports, information for related
subjects such as Micro-biotechnology and Environmental Technoogy at University
of Education and others institutes of Danang’s University.
- Hand over the research results:
The bio-compound contains desulfurized Desulfovibrio sp. bacteria would
Danang, September 10th 2016
IMPLEMENTING INSTITUTION
PROJECT LEADER
10
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nước là một nguồn tài nguyên vô cùng quý giá. Con người và các loài sinh
vật đều cần nước để tồn tại. Trên trái đất, ¾ lãnh thổ là nước, nước trong các đại
dương, ở biển, sông ngòi, ao hồ, nước ngầm ở trong lòng đất, tuy nhiên nguồn nước
sạch không phải luôn luôn dồi dào như chúng ta vẫn nghĩ.
Tốc độ công nghiệp hoá và đô thị hoá nhanh cùng với sự gia tăng mạnh mẽ
dân số, công thêm nhận thức của con người về vấn đề môi trường còn chưa cao…đã
làm cho nguồn nước mặt đang ngày càng bị ô nhiễm một cách trầm trọng. Trong
khi đó khí hậu đang biến đổi thất thường, nắng nhiều, sự bốc hơi nước cũng tăng lên
theo là nguyên nhân của việc thiếu nước trầm trọng. Ở các khu vực miền núi, vùng
sâu vùng xa, lượng nước mặt rất khan hiếm, người dân chủ yếu sử dụng nguồn nước
ngầm để sinh hoạt và sản xuất. Một thực trạng đang diễn ra tại một số huyện của
khu vực Đà Nẵng - Quảng Nam đó là nguồn nước ngầm bị nhiễm phèn sắt nặng,
gây ra những tác động xấu đến sinh hoạt, sản xuất của con người cũng như các vấn
đề môi trường liên quan.
Các phương pháp chủ yếu được ứng dụng để xử lý nước thải nói chung và
nước nhiễm phèn sắt nói riêng là các phương pháp hóa – lý như khử bằng vôi, dùng
tro bếp hay xử lý bằng các chất oxy hóa mạnh (Cl2, KMnO4, O3) đi kèm với dùng
hệ thống lọc nước...tuy nhiên các phương pháp này khá tốn kém và không an toàn,
thường gây ra những vấn đề ô nhiễm thứ cấp. Trong những năm gần đây, sử dụng
các chế phẩm VSV để xử lý nước thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học
và đạt được những thành công nhất định bởi ưu điểm sản xuất chế phẩm đơn giản
mà lại cho hiệu quả sử dụng cao.
Một trong những chủng vi khuẩn được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên
cứu ứng dụng trong công nghệ xử lý nước nhiễm phèn sắt là chủng vi khuẩn khử
sulfate Desulfovibrio sp., là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí, không hình thành bào tử, tế
bào là đơn vibrios có kích thước 0,5-0,7 μm x 1,5-3 μm. Vi khuẩn có hình dấu phẩy,
duy chuyển nhờ tiên mao, có thể tìm thấy trong bùn đáy ao, trầm tích biển, trong
các giếng khoan khai thác dầu khí, mỏ nước ngầm, trong ruột động vật, trong phân
2-
[23]... Phương pháp này dựa trên khả năng khử ion sulfate (SO4 ) đồng thời oxi hóa
các hợp chất hữu cơ (lactate, acetate, ethanol, methanol) tạo ion sulfide (H2S, HS-,
11
S2-) của vi khuẩn Desulfovibrio sp. Ion sulfide kết hợp với ion sắt hòa tan trong
nước tạo kết tủa dưới dạng sulfide bền vững. Phản ứng loại bỏ sắt của vi khuẩn
Desulfovibrio sp. sử dụng lactate được mô tả như sau:
-
2CH3CHOHCOOH + 3 SO42- → 3H2S + 6 HCO3
Fe2+ + H2S → FeS↓ + 2H+
Ưu điểm của phương pháp này là giá thành xử lý phù hợp, không tạo hóa
chất tồn dư gây ô nhiễm thứ cấp, lượng cặn tạo ra từ kết tủa sulfide không đáng kể.
Đây chính là tiền đề khoa học, là cơ sở để nghiên cứu thành công đề tài
“Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh có hoạt tính xử lý sulfate từ chủng
vi khuẩn Desulfovibrio sp. được phân lập từ phân trâu, bò”.
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
- Sản xuất được chế phẩm sinh học có hoạt tính xử lý sulfate từ chủng vi
khuẩn Desulfovibrio sp. phân lập từ phân bò.
- Khảo sát khả năng xử lý nước nhiễm phèn sắt của chế phẩm sinh học ở quy
mô phòng thí nghiệm.
Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
Về mặt khoa học, kết quả nghiên cứu của đề tài mang tính giáo dục cao, phù
hợp với xu thế tích hợp những nội dung giáo dục bảo vệ môi trường qua dạy học
các môn khoa học mà Bộ GD&ĐT đang triển khai ở các cấp học tiểu học và phổ
thông hiện nay. Đó là việc giải quyết các vấn đề môi trường bằng biện pháp sinh
học, lợi dụng khả năng phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật để ứng dụng vào
xử lý nước theo xu hướng thân thiện với môi trường, thay vì sử dụng các biện pháp
hóa học là giải pháp mang lại hiệu quả tức thời trước mắt nhưng lại gây ảnh hưởng
lâu dài đến cân bằng hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người và các loài động
thực vật khác trong tự nhiên.
Về khía cạnh xã hội, kết quả nghiên cứu của đề tài nếu được ứng dụng sẽ
nhận được sự hoan nghênh hưởng ứng của cộng đồng vì giải pháp này hướng tới
mục tiêu phát triển bền vững, đảm bảo cân bằng giữa lợi ích của thế hệ hiện tại mà
không làm tổn hại đến những ích lợi của các thế hệ tương lai.
12
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Desulfovibrio sp.
Desulfovibrio sp. thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí khử sulfate (Sulfate Reducing
Bacteria – SRB) ưa ấm (20 – 400C). Chúng là nhóm vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt,
gram âm, ưa ấm, có kích thước tế bào khoảng 0,5-0,7 μm x 1,5-3 μm, hình dấu
phẩy, oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ với axetat là sản phẩm cuối
cùng. Chúng được tìm thấy nhiều có trong đất, trong các vùng trầm tích, bùn lắng ở
các đáy ao tù, cống rãnh, sông hồ, biển, trong các vùng có điều kiện sống khắc
nghiệt như áp suất cao, nhiệt độ cao, độ mặn cao, hay môi trường quá kiềm, quá
axit...và thậm chí tồn tại trong cả phân các loài động vật [2; 3].
Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Desulfovibrio sp.
Trong quá trình trao đổi chất để tăng sinh Desulfovibrio sp. thực hiện việc
oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước thải bằng cách sử dụng sulfate làm chất nhận
điện tử cuối cùng. Sự khử sulfate thành sulfide tiêu thụ 8 điện tử và các quá trình
sinh hóa thông qua nhiều bước trung gian với sự tham gia của nhiều enzyme [4; 5].
Hình 1.2: Quá trình khử sulfate thành sulfide
13
Phản ứng có thể được tóm tắt như sau:
2
SO42 → SO3 → HSO3 → HS → S2
1.2. Lƣợc sử nghiên cứu về chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp.
Nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn khử sulfate, đặc biệt là chủng
Desulfovibrio sp. được nhiều nhà khoa học trên thế giới cũng như trong nước quan
tâm và là vấn đề có tính thời sự và ý nghĩa khoa học cao.
1.3. Chế phẩm vi sinh vật và các vấn đề liên quan
Desulfovibrio sp. là chủng vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu trình
cacbon và lưu huỳnh cũng như tham gia bảo vệ môi trường. Trong quá trình trao đổi
chất để tăng sinh Desulfovibrio sp. thực hiện việc oxy hóa các chất hữu cơ có trong
nước thải bằng cách sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử cuối cùng [3], nhờ đó mà
giảm hàm lượng sulfate cũng như hấp thụ được các ion kim loại trong nước. Chính
vì thế nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn này là
một vấn đề mang tính cấp thiết cao.
1.4. Tổng quan về nƣớc nhiễm phèn sắt và các vấn đề liên quan
Phương pháp xử lý nước nhiễm phèn sắt bằng vi khuẩn SBR được dự đoán
có giá thành xử lý phù hợp, không tạo hóa chất tồn dư gây ô nhiễm thứ cấp, lượng
cặn tạo ra từ kết tủa sulfide không đáng kể. Vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi
tiến hành khảo sát hiệu quả xử lý nước sinh hoạt bị nhiễm phèn sắt ở địa bàn xã Hòa
Nhơn, Hòa Vang, Đà Nẵng bằng chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn khử sulfate
được phân lập từ phân gia súc.
14
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng
2.1.1. Vật liệu
- Phân bò nhận tại khu vực Hòa Nhơn – Hòa Vang – Đà Nẵng.
- Mẫu nước thải để làm giàu vi khuẩn được thu nhận từ kênh Phú Lộc – Hòa
Minh – Đà Nẵng.
- Mẫu nước bị nhiễm phèn sắt trên địa bàn Hòa Vang – Đà Nẵng.
- Chế phẩm vi sinh thu nhận được từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp.
- Mô hình khảo sát khả năng xử lý nước bị nhiễm phèn sắt ở quy mô phòng
thí nghiệm.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng để nghiên cứu
a) Thiết bị
Trong nghiên cứu này sử dụng một số thiết bị chính sau:
Bảng 2.1: Các loại biết bị sử dụng chính
STT
Tên thiết bị
Cân phân tích
Máy đo pH
Bếp đun
Model
AUY220
MP220
HP-2100
ESCO
Nhà sản xuất
Xuất xứ
Nhật
Thụy Sỹ
Trung Quốc
Australia
Shimadu
1
2
3
4
pH Metter
Gali electric
Esco
Tủ cấy vô trùng
SMART
CONTROL
INB500
CX31RTSS
CL-40L
2104
MicroPte.Ltd
Tủ ấm
Memmert
Olympus
ALP
GFL
Alaska
Đức
Phillipine
Nhật
Đức
Nhật
5
6
7
8
9
Kính hiển vi quang học
Nồi hấp (Autoclave)
Máy cất nước một lần
Tủ mát
LC-300D
Và các thiết bị thông dụng khác trong phòng thí nghiệm Vi hóa sinh và Công
nghệ sinh học.
b) Dụng cụ
- Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 250 ml, lọ penicillin, lọ serum, ống
đong 100 ml và 200 ml, cốc thủy tinh 100 ml và 250 ml.
- Bình tia chứa nước vô trùng, bình xịt chứa cồn 900.
- Que cấy: que cấy vòng, que trang…
- Đèn cồn, bật lửa, eppendorf.
- Bông thấm nước và bông không thấm nước.
- Giấy báo, giấy kít nylon, găng tay, khẩu trang, viết.
15
c) Hóa chất
Để thực hiện các thí nghiệm trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng các hóa chất
chính như:
- Nước cất vô trùng, cồn 700 và cồn 900
- Thuốc nhuộm Gram: gồm dung dịch tím kết tinh (Crystal violet), dung dịch
iốt, dung dịch tẩy màu Etanol, dung dịch nhuộm bổ sung Safranin.
- Thuốc thử 1,10-Phenantrolin.
- Các hóa chất như: BaCl2, KI, Na2S2O3, NaOH, HCl, hồ tinh bột, hoá chất
pha các loại môi trường…
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Làm giàu và khảo sát sơ bộ sự hiện diện của vi khuẩn khử sulfate
trong phân bò
a) Thí nghiệm làm giàu
Vi khuẩn khử sulfate (SRB) trong mẫu phân bò thu thập về được làm giàu
bằng cách cấy vào bình serum chứa môi trường dịch thể nước ngọt (nước kênh Phú
Lộc) với tỷ lệ 10%, nuôi trong tủ ấm 30oC. Các lần cấy truyền tiếp theo được tiến
hành sau mỗi 5 – 7 ngày nuôi cấy theo tỷ lệ 10% thể tích. Qua mỗi lần cấy truyền,
số lượng SRB trong mẫu được tăng lên.
b) Thí nghiệm nhận biết sự xuất hiện của khí H2S
-Nhận biết bằng cảm quan thông qua mùi của khí thoát ra.
-Nhận biết bằng hóa chất: dùng dung dịch SO2.
2.2.2. Phân lập chủng vi khuẩn khử sulfate
Mẫu làm giàu lần 2 được dùng để phân lập vi khuẩn SRB.
Thành phần môi trường N92M1 dùng để phân lập vi khuẩn SRB.
Điều kiện kỵ khí được tạo ra bằng cách sử dụng túi Anaerocult A® (Merck)
16
Bảng 2.2: Thành phần môi trƣờng N92M1 [44]
STT
1
2
3
4
Thành phần
Số lƣợng
Đơn vị
K2HPO4
NH4Cl
CaCl2
KCl
0,5
15
0,1
0,5
g
g
g
g
5
6
MgSO4x7H2O
Na2SO4
1,5
1,0
g
g
7
NaHCO4
0,5
g
8
9
Axit thioglycolic
FeSO4 x 7H2O
Axit ascobic
Chiết xuất nấm men
Axit lactic (40%)
Nước cất
0,1
0,5
0,1
0,5
g
g
g
ml
ml
ml
ml
%
10
11
12
13
14
15
1
800
200
1,5 -2
Nước biển
Agar
Môi trường được chỉnh ở pH 7 -7,2; tiệt trùng ở 1210C, lấy ra ở 800C. Phân
phối môi trường vào các đĩa petri ở điều kiện vô trùng.
Cấy mẫu làm giàu (10%) vào đĩa petri và nuôi trong điều kiện kỵ khí.
Khuẩn lạc đơn phát triển được chuyển sang môi trường dịch thể N92M2
Thành phần môi trường N92M2 dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn.
Bảng 2.3. Thành phần môi trƣờng N92M2 [45]
STT
Thành phần
Số lƣợng
Đơn vị
1
K2HPO4
0,2
g
2
NH4Cl
0,3
g
3
NaCl
1,0
g
4
5
CaCl2x2H2O
KCl
0,16
0,5
g
g
6
7
MgSO4x7H2O
Na2SO4
0,4
3,0
g
g
8
NaHCO3
1,0
g
9
Na2Sx9H2O
FeSO4x7H2O
Chiết xuất nấm men
Axit lactic (40%)
Nước cất
0,3
0,4
0,1
1
g
g
ml
ml
ml
10
11
12
13
1000
2.2.3. Phương pháp nhuộm Gram, quan sát hình thái khuẩn lạc dưới kính
hiển vi quang học
2.2.4. Thử nghiệm tính di động của vi khuẩn
2.2.5. Xác định đặc điểm sinh lý của chủng vi khuẩn phân lập được
Để xác định được đâu là điều kiện tối ưu cho khả năng sinh trưởng của chủng
vi khuẩn Desulfovibrio sp. các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cơ chất,
17
yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, nồng độ muối và nguồn cơ chất đã tuần tự
được thực hiện.
Nhiệt độ.Các chủng SRB thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch
thể kỵ khí có pH = 7, ở các nhiệt độ:15ºC, 20ºC, 25ºC, 30ºC, 37ºC. Sinh trưởng của
SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối (OD600) theo
thời gian.
pH. Chủng vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường dịch thể kỵ
khí có pH khác nhau: pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 trong tủ ấm 30oC. Sinh trưởng
của vi khuẩn được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và sinh khối
(OD600).
Độ muối. Chủng vi khuẩn thuần khiết được nuôi trong môi trường dịch thể
kỵ khí ở pH 7, có độ muối khác nhau là 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25 g/l, nuôi trong tủ ấm
300C. Sinh trưởng của SRB được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide và
sinh khối (OD600).
Nguồn cơ chất. Chủng vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy trong môi trường
dịch thể kỵ khí có bổ sung các nguồn cơ chất khác nhau như lactate, acetate. Sinh
trưởng của vi khuẩn được đánh giá thông qua xác định nồng độ sulfide.
2.2.6. Khảo sát đường cong sinh trưởng của Desulfovibrio sp.
a) Phương pháp đếm khuẩn lạc
b) Phương pháp định lượng tế bào bằng đo mật độ quang học
2.2.7. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
2.2.8. Phương pháp sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn khử
sulfate
Công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp.
được tóm tắt theo sơ đồ sau (hình 2.1).
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn chất mang cho chủng vi khuẩn
Desulfovibrio sp. là than bùn và CaCO3 bổ sung thêm vi lượng. Trước khi đưa vào
sử dụng chất mang được hấp ở 121ºC trong thời gian 20 phút để tiêu diệt các VSV
có hại. Nhóm nghiên cứu thành lập 3 công thức phối trộn chất mang theo các tỉ lệ
khác nhau và tiến hành khảo sát để tìm ra công thức tốt nhất sản xuất chế phẩm. Các
công thức phối trộn như sau:
18
- NT1: 100% than bùn + 5 % CaCO3+ vi lượng + 10% VSV
- NT2: 80% than bùn + 5 % CaCO3+ vi lượng + 10% VSV
- NT3: 60% than bùn + 5 % CaCO3+ vi lượng + 10% VSV
Giống gốc
(Desulfovibrio sp.)
Hoạt hóa giống
Nhân giống
Lên men
(Nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí)
Thu sinh khối tế bào
Phối trộn sinh khối vi khuẩn với
Phụ gia
Chất mang
chất mang
Bao gói
Chế phẩm
Hình 2.1: Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ chủng
Desulfovibrio sp. mới phân lập
19
2.2.9. Lập mô hình khảo sát khả năng xử lý nước nhiễm phèn sắt của chế
phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp.
35 cm
20 cm
20 cm
Hình 2.2: Mô hình xử lý nƣớc nhiễm phèn sắt trong phòng thí nghiệm
(1)- Bể điều hòa chứa nước nhiễm phèn sắt đầu vào;(2) Bể UASB xử lý nước
nhiễm phèn sắt bằng chế phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp.; (3) Bể
lắng chứa nước đầu ra sau khi xử lý
Các thông số của bể UASB được thiết kế như trên hình 1 với tổng chiều dài
của bể là 75cm, chiều rộng 40cm và chiều cao 40 cm.
Nước bị nhiễm phèn sắt được cho vào bể điều hòa số 1 để làm lắng một số
cặn sỏi, cát có trong nước. Sau đó nước bị nhiễm phèn sắt được chuyển sang bể kỵ
khí (UASB) số 2 có chứa sẵn chế phẩm sinh học từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio
sp.
2.2.10. Xác định sự thay đổi pH của mẫu nước nhiễm phèn sắt bằng máy
đo pH (Hanna Hi 2210)
2.2.11. Phân tích hoá học
a) Định lượng sulfate [6]
Nguyên lý: SO42- kết hợp với Ba2+ tạo kết tủa BaSO4 theo phương trình: Ba2+ +
SO42- → BaSO4 kết tủa trắng. Hàm lượng sulfate được xác định thông qua hàm lượng chất
kết tủa BaSO4 tạo thành.
b) Xác định nồng độ sulfide [7]
Nguyên lý
Dựa vào phản ứng oxi hóa khử giữa S2-và I2 khi cho một lượng dư iot đã biết
trước thể tích và nồng độ vào trong mẫu nước có chứa H2S.
I2 + H2S = 2HI + S
Sau đó chuẩn độ ngược lượng dư iot bằng dung dịch natrithiosunfat
20
Tải về để xem bản đầy đủ
40 trang
13420
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Báo cáo tóm tắt Đề tài Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh có hoạt tính xử lý sulfate từ chủng vi khuẩn Desulfovibrio sp. được phân lập từ phân trâu bò", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- bao_cao_tom_tat_de_tai_nghien_cuu_san_xuat_che_pham_vi_sinh.pdf
