Xác định một số nấm gây bệnh trên trứng cá bá chủ (Pterapogon kauderni) trong quá trình ấp bằng phương pháp PCR và SEM
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN TRỨNG CÁ BÁ CHỦ
(Pterapogon kauderni) TRONG QUÁ TRÌNH ẤP BẰNG PHƯƠNG
PHÁP PCR VÀ SEM
Nguyễn Thị Thủy Tiên1, Võ Minh Sơn2, Lê Quỳnh Loan3, Nguyễn Hoàng Dũng3,
Hoàng Quốc Khánh3, Ngô Đức Duy3*
TÓM TẮT
Nghiên cứu này tập trung phân lập và định danh chủng nấm tꢀ mẫu bệnh phẩm thu nhận tꢀ 4 mẫu
trứng cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) bị hỏng trong quá trình ấp trứng và xác định sự tái nhiễm
lại nấm với mẫu trứng cá thông qua kĩ thuật SEM (Scanning Electron Microscope). Kết quả hình
thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử cho thấy có 3 chủng nấm sợi (M1, M1.1 và M4.1). Chủng
M1.1 có khả năng thuộc chi Fusarium, chủng M1 thuộc chi Lecanicillium và chủng M4.1 thuộc
chi Neurospora. Kết quả thu nhận bộ gene DNA và nhân bản vùng bảo tồn ITS của 3 chủng M1.1,
M1 và M4.1 cùng với so sánh các dữ liệu gene của các chủng trên ngân hàng gene NCBI cho thấy
chủng M1.1 có mức độ tương đồng với loài Fusarium incarnatum là 100%, chủng M1 có mức độ
tương đồng với loài Lecanicillium tenuipes là 100% và tương tự chủng M4.1 với loài Neurospora
crassa là 99%. Cảm nhiễm của 3 chủng nấm trên với trứng cá Bá Chủ thông qua kỹ thuật hình ảnh
SEM ghi nhận chỉ có chủng Neurospora crassa có khả năng xâm nhiễm vào trứng cá Bá Chủ gây
hỏng trứng trong quá trình ấp. Tꢀ các kết quả nghiên cứu cho thấy nấm Neurospora crassa có khả
năng gây bệnh và làm hỏng trứng cá Bá Chủ.
Tꢀ khóa: cá Bá Chủ, trứng cá, gene ITS, nấm, SEM.
Chủ hiện đang được người chơi cá cảnh trên
thế giới ưa chuộng. Cá Bá chủ hiện đang khai
thác quá mức ngoài tự nhiên và được liệt vào
danh sách đỏ của tổ chức IUCN (International
Union for Conservation of Nature and Natural
Resources). Ngoài ra, trong quá trình xây dựng
quy trình sinh sản trong bể, nấm bệnh là một
trong những tác nhân gây hư hỏng trứng cá làm
tỉ lệ trứng nở giảm mạnh, ảnh hưởng nghiêm
trọng đến quy trình sản xuất. Do vậy, việc xác
định chủng nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ
nhằm tìm ra biện pháp khắc phục mang tính
cấp thiết.
I. MỞ ĐẦU
Việt Nam có tiềm năng lớn cho phát triển
cá cảnh do thuộc vùng khí hậu nhiệt đới, nguồn
lợi thủy sinh tự nhiên phong phú và đa dạng,
đặc biệt phù hợp cho sự sinh sản và phát triển
các loài cá cảnh. Tuy nhiên, hầu hết các loài
cá biển được đánh bắt ngoài tự nhiên bằng
hóa chất đã dẫn đến nhiều loài cá có nguy
cơ tuyệt chủng nằm trong sách đỏ. Cá Bá
chủ (Pterapogon kauderni) thuộc họ cá Sơn
Apogonidae, tuy nhiên về di truyền loài cá
này tiến hoá một nhánh khác và có tên khoa
học riêng biệt (Cites, 2007) và là loài cá này
phân bố ở đảo Banggai, Indonesia (Vagelli,
2007). Với màu sắc đẹp và dễ nuôi nên cá Bá
Hiện nay, cá Bá Chủ được ưa chuộng và
đã xuất đi nhiều nước thuộc Châu Âu, Mỹ và
1 Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2 Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
3 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. Hồ Chí Minh
*Email: [email protected]
58
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Châu Á với mục đích phục vụ cho người chơi được phát hiện là nguyên nhân gây bệnh cho
cá cảnh. Do nhu cầu tiêu thụ loài cá này càng P. kauderni (Weber et al., 2009). Iridovirus gây
tăng trên thế giới. Ở Việt Nam có tiềm năng lớn bệnh cho cá Bá chủ (BCIV) có liên quan gần
cho phát triển cá cảnh do có khí hậu nhiệt đới gũi với virus gây bệnh hoại tử lá lách và thận
phù hợp cùng với nguồn lợi thủy sinh tự nhiên (ISKNV) và loài Megalocytivirus này cũng gây
phong phú và đa dạng trên hệ thống kênh, sông bệnh cho cá vền biển đỏ, cá vền đá, cá đù vàng
và hơn 3.000 km bờ biển trải dài là điều kiện lớn và cá Mú chấm cam (Weber et al., 2009).
rất thuận lợi cho sự phát triển nghề cá cảnh, Loài Megalocytivirus là một trong những loài
đặc biệt phù hợp cho sự sinh sản và phát triển virus gây bệnh nguy hiểm nhất với tỉ lệ gây chết
các loài cá cảnh nhiệt đới. Người chơi cá cảnh lên đến 100%. Chúng được ghi nhận là tác nhân
ở nước ta đang có xu hướng chuyển dần sang gây bệnh trên một số loài cá biển và cá nước
chơi các loài cá cảnh biển do chúng có nhiều ngọt kể cả cá cảnh được xuất khẩu tꢀ vùng biển
màu sắc đẹp, đa dạng về thành phần loài. Cá Nam Trung Quốc và một vài nước Đông Nam
Bá Chủ là loài có giá trị kinh tế cao, chúng có Á (Wang et al., 2007). Tuy nhiên, cho đến nay
màu sắc đẹp và dễ nuôi nên đang được người vẫn chưa có nghiên cứu về sự nhiễm nấm bệnh
chơi cá cảnh ngày càng ưa chuộng. Điều này trên trứng trong giai đoạn ấp trứng. Vì vậy trong
sẽ giúp gia tăng số lượng và giá trị của cá nhân nghiên cứu này nhằm xác định nấm gây hỏng
nuôi sinh sản nhân tạo và làm giảm áp lực cho trứng trong quá trình ấp trứng của cá Bá Chủ
nguồn cá tự nhiên, đồng thời đem lại nguồn lợi hiện nay.
to lớn cho nghề nuôi trồng cá cảnh của nước ta.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Trên thế giới có nhiều công trình nghiên
cứu về bệnh nấm ở động vật thủy sản như
một số loài nấm bất toàn thuộc các giống
trứng cá Bá Chủ bị hỏng trong quá trình ấp
như Fusarium, Acremonium, Plectosporium,
Ochroconis, Phoma, Exophiala và nhóm nấm
II. Vật liệu tꢀ đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công
thủy mi như Saprolegnia, Achlya, Leptolegnia
và Aphanomyces là tác nhân gây bệnh chính
ở động vật thủy sản. Trong đó các bệnh chủ
2.1. Vꢀt liꢁu
Các chủng nấm đã được phân lập tꢀ 4 mẫu
trứng tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản
nghệ sản xuất giống cá Bá chủ (Pterapogon
kauderni)” thuộc Sở Khoa Học Tp. Hồ Chí
Minh.
yếu trong thủy sản như bệnh nấm Thủy Mi
2.2. Cꢂc phương phꢂp nghiên cꢃu
(Saprolegnia, Aphanomyces và Achlya)
(Yanong, 2003), bệnh do nấm Lagenidium (Đỗ
Thị Hòa và ctv., 2004), bệnh nấm Haliphthoros
và Plectosporium (Đặng Thị Hoàng Oanh và
ctv., 2005) và bệnh do nấm Fusarium (Khoa
và ctv., 2004). Riêng cá Bá Chủ được phát
hiện lần đầu tiên vào năm 1996 và được xem
là một loài cá có khả năng kháng bệnh rất tốt.
Tuy nhiên, tꢀ năm 2002-2003 đến nay có một số
báo cáo tꢀ những người nuôi cá cảnh về những
cái chết đột ngột của cá Bá chủ được đánh bắt
tꢀ tự nhiên. Triệu chứng bệnh được ghi nhận
như sau: chúng trở nên biếng ăn, thái độ thờ ơ
bất bình thường, màu sắc trở nên đen sậm hơn
một cách rõ ràng và sau một vài ngày, cá chết
(Vagelli, 2011). Đến năm 2005, virus thuộc
loài Megalocytivirus (thuộc họ Iridoviridae)
2.2.1. Phương pháp quan sát hình thái các
chủng nấm sợi
Quan sát hình thái học trên môi trường
thạch đĩa theo phương pháp làm phòng ẩm
(chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc
ở dưới và thanh thủy tinh chữ “u” bên trên và
môi trường PDA, tất cả hấp khử trùng. Dùng
pipetman hút môi trường và trải lớp thật mỏng
trên lame, sau đó dùng que cấy tế bào nấm trên
lame rồi đậy lamelle lại, nhỏ nước cất vô trùng
cho thấm đều giấy thấm lọc tạo độ ẩm trong đĩa
petri, ủ đĩa ở nhiệt độ phòng sau 2 ngày kiểm tra
và quan sát chụp ảnh dưới kính hiển vi.
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA
Quy trình tách chiết DNA được thực hiện
59
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl thiết lập cây phát sinh loài bằng các phần mềm
Ammonium Bromide). Hút 200µl dịch nuôi ChromasPro, MEGA 5, Seaview 4 và Ngân
cấy nấm trong môi trường PDB sau 2 ngày vào hàng gene NCBI.
eppendorf 1,5ml, thêm vào 800µl đệm CTAB
sau đó đem ủ 60oC trong 60 phút, ly tâm 1.300
rpm trong 5 phút, hút dịch nổi khoảng 600µl cho
vào 1 tube 1,5ml, thêm một thể tích chloroform-
isoamylalcohol (24:1) tương đương với thể tích
phần dịch lấy ra (600µl), trộn đều sau đó đem
ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở 4oC và thu
dịch nổi bên trên màng phân cắt. Chuyển phần
dịch thu được vào 1 tube 1,5ml mới (phần dịch
khoảng 400µl). Thêm vào isopropanol lạnh (tỉ
lệ thể tích 1:1). Trộn đều, để lạnh -80oC trong
60 phút, ly tâm 1.300 rpm trong 20 phút ở 4oC,
Thu tủa và rửa tủa DNA với 700µl ethanol 70%,
90%, 99% lắc nhẹ rồi đem ly tâm 13.000 rpm
trong 1 phút. Hòa tan tủa DNA trong 50µl nước
cất tinh khiết, bảo quản -4oC.
2.2.5. Cảm nhiễm
Phương pháp nuôi cấy để thu bào tử:
nấm được nuôi cấy trong môi trường Peptone
Yeast extract Glucose Salt Agar (PYGSA) gồm
0,125% Bacto peptone; 0,125% Bacto yeast
extract; 0,3% glucose; 1,2% agar và 3,8%
muối); thời gian nuôi cấy là 7-10 ngày tùy vào
tốc độ phát triển của tꢀng loài nấm; ủ ở nhiệt độ
25°C. Thu hoạch bào tử nấm bằng cách cho 10
ml nước muối sinh lí (0,85% NaCl) đã tiệt trùng
vào đĩa petri nuôi cấy nấm, dùng que cấy cào
nhẹ trên bề mặt của đĩa thạch để cho các bào tử
tách ra tꢀ các khuẩn ty. Sau đó dung dịch này
được lọc qua phễu lọc đã tiệt trùng (phễu bằng
thủy tinh có lót 2 lớp vải mùng dùng trong y
khoa) để thu bào tử. Số lượng bào tử nấm được
xác định bằng cách sử dụng buồng đếm hồng
cầu, xác định mật độ là 5x106 bào tử/ml dùng
cho thí nghiệm gây cảm nhiễm.
2.2.3. Nhân bản vùng gene ITS bằng
phương pháp PCR
Trước tiên là thành phần chính nhân
bản vùng gene phản ứng PCR bao gồm; Taq
DNA polymerase, mồi ITS1F, mồi ITS4R,
bộ gene DNA của cá Bá Chủ. Khuếch đại
vùng gene ITS được thực hiện với 2 cặp mồi
ITS1-F (M.Gardes, 1993) và ITS4 (T. J White,
1990) cho nhóm vi nấm có trình tự ITS1F
Trứng được thu tꢀ miệng cá đực (P.
kauderni) sau khi cá cái đẻ và được thụ tinh
được 3 giờ. Sau khi trứng được kiểm tra không
nhiễm nấm, tiến hành bố trí thí nghiệm cảm
nhiễm với 3 chủng nấm đã phân lập (M1.1, M1
và M4.1) bằng phương pháp ngâm với bào tử
có mật độ 5x105 bào tử/ml. Sau thời gian ngâm
7 ngày, tiến hành thu mẫu kiểm tra khả năng
nhiễm của 3 chủng nấm trên bằng phương
pháp SEM.
5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
và
ITS4R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’).
Chu trình phản ứng PCR 98oC trong 3 phút,
35 chu kỳ (94oC trong 45 giây, 55oC trong 50
giây, 72oC trong 1giây) và chu kỳ 72oC kéo dài
10 phút Sau khi PCR, kết quả sản phẩm nhân
bản đoạn gene ITS sẽ được kiểm tra trên gel
agarose 1%, với nguồn điện 100 vol trong thời
gian 45 phút với thang 100bp (hãng Thermo).
Sau cùng nhuộm gel với Ethidium Bromide
trong 15 phút và xem kết quả sản phẩm PCR
dưới UV.
2.2.6. Phân tích hình ảnh tái nhiễm bằng kỹ
thuật hình ảnh SEM
Hình ảnh SEM được chụp tại Viện Công
nghệ Hóa học.
III. KẾT QUẢ
3.1. Hình thꢂi của mẫu trꢃng cꢂ Bꢂ Chủ
2.2.4. Giải trình tự và định danh nấm sợi
Kết quả hình ảnh trứng cá Bá Chủ phát triển
bình thường có màu đỏ cam (Hình 1A) sau khi
nhiễm bệnh trứng chuyển sang màu trắng đục
(Hình 1B và 1C) trứng dai và cứng hơn so với
trứng phát triển bình thường.
Sản phẩm giải trình tự gene được thực hiện
bởi công ty Nam Khoa, Thành phố Hồ Chí
Minh.
Kết quả giải trình tự được phân tích và
60
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 1. Hình ảnh mẫu trứng cá Bá Chủ, A: Mẫu trứng cá chưa bị nhiễm, B: Mẫu trứng cá nhiễm một
phần và C: mẫu trứng cá bị nhiễm hoàn toàn. Độ phóng đại ảnh 20X.
3.2. Kết quả hình thꢂi học cꢂc nấm gây
hỏng trꢃng cꢂ Bꢂ Chủ
sản II, đã được phân lập, làm thuần và chọn lọc
được 3 chủng nấm bệnh kí hiệu là M1.1, M1 và
M4.1 (Hình 2).
Tꢀ 4 mẫu trứng bị hỏng trong quá trình
ấp trứng tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy
Hình 2. Hình ảnh mẫu nấm bệnh của chủng M1.1, M1 và M4.1 trên môi trường PDA trong 48 giờ và
sợi khuẩn ty và bào tử dưới vật kính 40X.
61
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Chủng nấm M1.1 được nuôi trên môi sự hình thành vách ngăn và tạo tế bào phân đốt.
trường PDA ở nhiệt độ 28oC trong thời gian Kết hợp với hình thái khuẩn lạc cho phép kết
48 giờ có kích thước khuẩn lạc là 20 – 24 mm, luận sơ bộ về chủng M1 có thể thuộc vào chi
sợi nấm màu trắng, mặt trên màu trắng ở giữa Lecanicillium.
màu vàng nhạt, mặt dưới có màu vàng cam,
hơi hồng, rìa khuẩn lạc có dạng răng cưa. Dựa
vào hình ảnh sự hình thành sợi khuẩn ty cho
thấy sợi có dạng phân nhánh, hình thành vách
ngăn và tạo tế bào phân đốt, cuống bào tử đính
hình thành cấu trúc bó sợi và bào tử hơi cong
với một tế bào đỉnh nhọn và một tế bào hình
chân thể bình đơn. Kết hợp với hình thái khuẩn
lạc cho phép kết luận sơ bộ về chủng M1.1 có
thể thuộc chi Fusarium (dựa vào hệ thống phân
loại nấm của CBS Course of Mycology).
Còn chủng nấm M4.1 phát triển nhanh và
mọc tràn khắp đĩa peptri, khuẩn lạc không có
hình dạng rõ rệt, màu trắng tơi như bông gòn.
Sau 48 giờ, chủng M4.1 sinh bào tử có màu
vàng cam. Kết hợp với hình thái khuẩn lạc
cho phép kết luận sơ bộ về chủng M4.1 có thể
thuộc vào chi Neurospora (Amita Pandey, et
al., 2004).
3.3. Kết quả thu nhꢀn bộ gene và sản
phầm PCR của vùng gene ITS
Sau khảo sát hình thái học, tiếp tục li trích
và thu nhận bộ gene DNA theo phương pháp
CTAB rồi nhân bản đoạn gene ITS trên cặp
mồi ITS1-F và ITS4-R, có kết quả sản phẩm
trên gel agarose 1% ở Hình 3 với kích thước
trong khoảng 500bp.
Tương tự với chủng nấm M1 cho thấy kích
thước khuẩn lạc là 12 – 15 mm, sợi nấm màu
trắng dạng mặt nhung mịn, mặt trên màu trắng,
mặt dưới ở giữa màu hơi vàng, mép mỏng.
Chủng M1 cũng có dạng sợi phân nhánh và có
Hình 3. Kết quả thu nhận bộ gene (A) và (B) sản phẩm PCR của gene ITS của chủng nấm
M1.1. M1 và M4.1 trên gel agarose 1% và thang 100bp (hãng Thermo).
Tꢀ kết quả sản phẩm nhân bản vùng gene (ChromasPro, MEGA 5) và BLAST các dữ liệu
ITS, các mẫu DNA được gởi giải trình tự gene gene khác có trên ngân hàng gene NCBI. Kết
tại công ty Nam Khoa, sau đó các trình tự gene quả thu được cây phát sinh loài (Seaview 4)
được sử dụng các phần mềm sinh học phân tử (Hình 4).
62
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 4. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gene ITS chủng được phân M1, M1.1 và
M4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gene NCBI.
Tiến hành so sánh vùng gene của các mẫu cứu về đặc điểm hình thái thì chủng M1 là loài
phân lập được với vùng gene bảo tồn ITS của Lecanicillium tenuipes.
các chủng nấm sợi trên ngân hàng gene NCBI,
các đặc điểm hình thái học của các chủng tương
đồng và có được kết quả như sau.
Chủng M4.1 có mối quan hệ gần nhất
với loài Neurospora Crassa FJ360521.1,
Neurospora pannonica KF881757.1 và
Chủng M1.1 có mối quan hệ gần nhất Neurospora tetrasperma FJ904922.1 với mức
với loài Fusarium incarnatum KM519192.1, độ gene tương đồng là 99%. Kết quả so sánh
Penicillium expansum FJ008994.1 và Fusarium trình tự gene là 99% trình tự DNA giống nhau
longipes AB820724.1 có mức độ tương đồng với 3 chủng trên và kết hợp đặc điểm hình thái
của trình tự vùng gene chủng M1.1 và 3 chủng thì chủng M4.1 là chủng Neurospora crassa.
trên đều là 100%.
Để kiểm chứng sự hiện diện và nguyên
Chủng M1 có mối quan hệ gần nhất với nhân gây nhiễm nấm trong trứng của chủng nấm
loài Lecanicillium fusisporum KF766521.1 M1, M1.1 và M1.4 trong quá trình ấp trứng cá
và Lecanicillium tenuipes JN036556.1 với Bá Chủ. Mẫu trứng cá Bá Chủ được cảm nhiễm
mức độ tương đồng là 100%. Kết quả so sánh theo phương pháp Koch (Koch, R. 1876) với 3
trình tự gene giống nhau trên và các nghiên chủng trên tꢀ hình ảnh SEM.
63
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
3.4. Kết quả hình ảnh kĩ thuꢀt SEM của bề mặt mẫu trꢃng cꢂ Bꢂ Chủ
Kết quả hình ảnh bề mặt của trứng cá Bá Chủ được chụp qua kĩ thuật SEM xem Hình 5.
Hình 5. Hình ảnh SEM bề mặt của trứng cá Bá Chủ với 100X (a) và 500x (b).
Hình 6. Hình ảnh SEM của bề mặt của trứng cá Bá Chủ với 500X (a) và 1.000X (b) của mẫu nhiễm
chủng nấm M4.1. Mẫu chủng M1(c) với độ phân giải là 1.000x và chủng M1.1 (d) với độ phân giải
là 1.000X.
Tꢀ kết quả ban đầu phân lập được 3 chủng
nấm M1., M1.1 và M4.1 trong các mẫu sản
phẩm trứng bị hỏng tiếp tục kiểm tra nguyên
nhân gây hỏng thực sự bằng thí nghiệm cảm
nhiễm theo phương pháp Koch cho thấy chỉ có
chủng nấm M1.4 có thể gây hỏng trứng và có
64
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
khả năng xâm nhiễm vào bên trong trứng thông kết quả chủng M1.1 có mức độ tương đồng với
qua hình ảnh SEM trên bề mặt trứng và bên loài Fusarium incarnatum là 100%, chủng M1
trong trứng xem Hình 6.
có mức độ tương đồng với loài Lecanicillium
tenuipes là 100% và tương tự chủng M4.1 với
loài Neurospora crassa là 99%.
IV. THẢO LUẬN
Theo kết quả so sánh trình tự gene và đặc
điểm hình thái thì chủng M1.1 là loài Fusarium
incarnatum. Chủng F. incarnatum được phân lập
tꢀ tổn thương mang của tôm sú nuôi (Penaeus
monodon), mỗi vụ thu hoạch trong thời gian
2000 - 2002 tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Tôm
bị nhiễm bệnh cho thấy dấu hiệu điển hình của
bệnh mang đen và tỷ lệ chết khoảng một tháng
trước khi thu hoạch (Khoa và ctv., 2004). Chủng
L. tenuipes được phân lập tꢀ 0,82% xác B.
piniaria được tìm thấy trong đất và được phân
loại như là một nấm Keratinophylic. Nó có thể
được kết hợp với côn trùng hoặc tuyến trùng
trong đất (Dalė Pečiulytė và ctv., 2010).
Kết quả cảm nhiễm của 3 chủng nấm với
trứng cá Bá Chủ tꢀ những hình ảnh bằng kĩ
thuật SEM cho thấy rằng chủng Neurospora
crassa có khả năng xâm nhiễm vào trứng cá Bá
Chủ gây hỏng trứng trong quá trình ấp.
LỜI CẢM ƠN
Có được những kết quả trong nghiên cứu
này, tôi xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học
và Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, các anh
chị đồng nghiệp tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản II và Phòng Vi sinh, Viện Sinh học
Nhiệt đới đã hỗ trợ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liꢁu tiếng Viꢁt
Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm
chủng M1, M1.1 và M4.1 cho thấy sự thay đổi
tꢀ vùng không nhiễm sang vùng nhiễm nấm với
độ phân giải 500X (Hình 6a) và vùng nhiễm
nấm với độ phân giải 1000X (Hình 6b) so sánh
với bề mặt trứng mẫu không nhiễm của chủng
M1 (Hình 6c) và chủng M1.1 (Hình 6d) trong
thời gian cảm nhiễm trong 3 ngày. Tꢀ hình ảnh
SEM và kết quả hình ảnh cảm nhiễm cho kết
luận rằng chủng M4.1 (Neurospora crassa) là
nấm có khả năng gây nhiễm và làm hỏng trứng
cá Bá Chủ trong giai đoạn ấp trứng so với chủng
M1 và M1.1.
Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề và
Đỗ Thị Muội, 2004. Giáo trình Bệnh học thủy
sản. Đại họcThủy sản Nha Trang, 2004, NXB
Nông Nghiệp.
Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa,
2005. Giáo trình bệnh học thủy sản. Đại học
Cần Thơ. Trang 73.
Tài liꢁu tiếng Anh
Pandey A., M. Gabriela Roca, Nick D. Read and
N. Louise Glass, 2004. Role of a mitogen-
activated protein kinase pathway during conidial
germination and hyphal fusion in Newrospora
crassa. American society for Microbiology.
doi: 10.1128/EC.3.2.348-358.2004.
KẾT LUẬN
Cites, 2007. Convention on international trade
in endangered species of wild fauna và flora.
Fourteenth meeting of the Conference of the
Parties The Hague (N etherlvàs), 3-15.
Qua chọn lọc sơ bộ tꢀ 4 mẫu trứng cá bị
hỏng thu được kết quả 3 mẫu nấm trên trứng
cá Bá Chủ là M1.1, M1 và M4.1. Kết quả hình
thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử cho
thấy rằng chủng M1.1 có khả năng thuộc chi
Fusarium, chủng M1 thuộc chi Lecanicillium và
chủng M4.1 thuộc chi Neurospora.
Pečiulytė D., I. Nedveckytė, V. Dirginčiūtė-
Volodkienė, V. Būda, 2010. Pine defoliator
Bupalus piniaria L. (Lepidoptera: Geometridae)
and its entomopathogeneic fungi. Ekologija.
Vol. 56. No. 1–2. P. 34–40.
Dựa vào kết quả thu nhận bộ gene DNA và
nhân bản vùng bảo tồn ITS của 3 chủng M1.1,
M1 và M4.1cùng với so sánh các dữ liệu gene
của các chủng trên ngân hàng gene NCBI cho
IUCN, 2007. Banggai cardinalfish (Pterapogon
kauderni), 2007 IUCN Red lish of threatened
species. IUCN The word conservation union.
Khoa, L. V., K. Hatai, và T. Aoki, 2004. Fusarium
65
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
incarnatum isolated from black tiger shrimp Yanong, R. P. E., 2003. Fungal diseases of fish. Vet
Penaeus monodon Fabricius, with black gill
disease cultured in Vietnam. Journal of Fish
Diseases 27: 507-515.
Clin Exot Anim. 6: 377–400.
Wang, Y., Lu, L., Weng, S., Juang, J., Chan, S.-M.,
and He, J., 2007. Molecular epidemiology and
phylogenetic analysis of a marine fish infectious
spleen and kidney necrosis virus-like (ISKNV-
like) virus. Arch. Virol. 152, 763-773.
Koch, R., 1876. Investigations into bacteria: V. The
etiology of anthrax, based on the ontogenesis
of Bacillus anthracis. Cohns Beitrage zur
Biologie der Pflanzen (2): 277–310.
Weber, S., Waltzek, T., Young, D., Twitchell, E.,
Gates, A., Vagelli, A., Risatti, G., Hedrick,
R., and Frasca, S., 2009. Systemic iridovirus
infectionintheBanggaicardinalfish(Pterapogon
kauderni). J. Vet. Diag. Invest. 21, 306-320.
Vagelli, A., 2007. Synopsis of the biology và
conservation status of the Banggai cardinalfish
Pterapogon kauderni. Indonesian CITES
Authorities, Jakarta.
IDENTIFICATION OF FUNGI CAUSING INFECTION
IN Pterapogon kauderni EGG DURING INCUBATION USING
PCR AND SEM METHODS
Nguyen Thi Thuy Tien1, Vo Minh Son2 , Le Quynh Loan3, Nguyen Hoang Dung3,
Hoang Quoc Khanh3, Ngo Duc Duy3*
ABSTRACT
The goal of this study is to isolate and identify fungi strains from four specimen samples of
Pterapogon kauderni eggs which were infected during incubation. The results were confirmed from
the challenge test of fungi with eggs by technical SEM. Based on morphology, mycelium and spore
characteristics, three filamentous fungi strains (M1, M1.1 and M4.1) were identified. The M1 strain
belongs to Fusarium species, M1.1 strain belongs to Lecanicillium species and M4.1 strain belongs
to Neurospora. The results of sequencing analysis of ITS (Internal Transcribed Spacer) gene
region of M1, M1.1 and M4.1 strains and comparison with database on NCBI (National Center
for Biotechnology Information ) showed that there was 100% similarity between M1 strain and
Lecanicillium tenuipes, 100% similarity between M1.1 strain and Fusarium incarnatum and 99%
similarity between M4.1 strain and Neurospora crassa. The results from the challenge of these three
strains with Pterapogon kauderni eggs on technical SEM (Scanning Electron Microscope) pictures
showed that only Neurospora crassa species can penetrate inside Pterapogon kauderni eggs during
incubation. It can be concluded that Neurospora crassa species may cause infection and stop the
hatching of Pterapogon kauderni eggs.
Keywords: fish eggs, fungi, ITS gene, Pterapogon kauderni, SEM.
Người phản biện: TS. Nguyễn Ngọc Du
Ngày nhận bài: 02/11/2017
Ngày thông qua phản biện: 20/11/2017
Ngày duyệt đăng: 12/12/2017
1 Biotechnology Center of Ho Chi Minh City
2 Research Institute for Aquaculture No.2
3 Insititute of Tropical Biology, Vietnam Academy Sciences and Technology
*Email: [email protected].
66
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
9 trang
16900
Free
Bạn đang xem tài liệu "Xác định một số nấm gây bệnh trên trứng cá bá chủ (Pterapogon kauderni) trong quá trình ấp bằng phương pháp PCR và SEM", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- xac_dinh_mot_so_nam_gay_benh_tren_trung_ca_ba_chu_pterapogon.pdf
