Sàng lọc các dòng nấm men mang gen VP28 thích hợp để sản xuất Tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
sÀng lỌc các dÒng nẤm men mang gen VP28 Thích hỢP ĐỂ
sẢn XUẤT ToleRine PhÒng bỆnh ĐỐm TRẮng TRÊn Tôm nUôi
Ngô Thị Ngọc Thủy1*, Đặng Thị Trà My1
TÓM TẮT
Việc sử dụng tế bào nấm men Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp đã được
nghiên cứu và sản xuất nhiều loại vaccine phòng bệnh cho động vật có xương sống nhưng được vận
dụng hạn chế trong nghiên cứu bệnh thủy sản nói chung và bệnh tôm nói riêng. Nghiên cứu này tiến
hành sàng lọc 150 chủng nấm men Pichia pastoris có mang gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus
đốm trắng nhằm tạo nguyên liệu cho sản xuất toreline phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. Các
chủng nấm men được chọn lọc dựa trên kiểu hình (Mut+), số lượng bản sao gen mục tiêu, khả năng
biểu hiện protein và tốc độ sinh trưởng. Quá trình sàng lọc đã chọn được 125 chủng mang kiểu hình
Mut+, 82 chủng có mang 14-16 bản sao của gene VP28-His trong genome và 8 chủng có khả năng
biểu hiện protein tốt. Trong 8 chủng chọn lọc, chủng 11 cho tốc độ sinh trưởng nhanh, đạt mật độ
tế bào cao nhất (3,92x109 tế bào/ml) và lượng protein VP28 nhiều nhất sau 84 giờ kích thích biểu
hiện. Chủng này được dùng làm nguyên liệu để điều chế toreline phòng bệnh đốm trắng trong các
nghiên cứu tiếp theo.
Từ khóa: VP28, Pichia pastoris, bệnh đốm trꢀng.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
tiêm. Việc dùng vaccine bằng cách tiêm ngoài
việc yêu cầu nhiều công lao động, dễ gây stress
cho vật chủ, có thể tạo ổ viêm tại vị trí tiêm,
nó còn không thích hợp trong điều kiện thực tế
nuôi tôm khi số lượng vật chủ thường lớn và
rất mẫn cảm với sự thay đổi của điều kiện môi
trường. Vì vậy, việc nghiên cứu vaccine tái tổ
hợp và quản lý bằng phương pháp cho ăn đã
được trú trọng nhiều hơn, đặc biệt là các protein
hay DNA vaccine chế tạo từ gen VP28 của virus
gây bệnh đốm trắng trên các hệ thống biểu hiện
khác nhau (Caipang et al., 2008; Fu et al., 2011;
Kim et al., 2007; Kumar et al., 2008; Ning et
al., 2011; Musthaq and Jimmy,2011; Satoh et
al.; Witteveldt et al., 2004a; Witteveldt et al.,
2004b; Witteveldt et al., 2006).
Virus gây bệnh đốm trắng là loại virus gây
bệnh nghiêm trọng và phổ biến ở tôm nuôi.
Bệnh này là nguyên nhân chủ yếu gây ra những
tổn hại kinh tế lớn đối với ngành công nghiệp
nuôi tôm trên toàn thế giới. Gần đây, nhiều loại
vaccine phòng bệnh đốm trắng đã được nghiên
cứu như vaccine bất hoạt, vaccine nhược độc
(Namikoshi et al., 2004; Singh et al., 2005)
hoặc vaccine tái tổ hợp dùng để tiêm cho tôm
(Namikoshi et al., 2004; Rout et al., 2007;
Witteveldt et al., 2004b). Những loại vaccine
này có một số nhược điểm như có yếu tố rủi
do tiềm tàng khi vaccine nhược độc trở thành
có độc lực, hay cần bổ sung thêm chất bổ trợ
hoặc phải đưa vào vật chủ vài lần bằng đường
1 Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.
* Email: [email protected]
75
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Trong thực tế, có 4 hệ thống biểu hiện sự 03 chủng đối chứng (chủng nấm men GS115
sống: tế bào vi khuẩn, nấm men, tế bào côn trùng mang plasmid pPICK9K rỗng). Các chủng nấm
và các hệ thống biểu hiện bằng tế bào động vật men này được hình thành từ 03 đợt hóa biến
có vú và tế bào thực vật đã được nghiên cứu sử nạp pPICK9K-VP28 vào tế bào nấm men của
dụng để sản xuất vaccine (Hansson et al., 2000). đề tài cấp Bộ “Bước đầu nghiên cứu, sản xuất
Việc sử dụng tế bào nấm men để điều chế protein tolerin có khả năng hạn chế lây lan của virus
vaccine tái tổ hợp phòng bệnh cho người và gia gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương
súc đã được ứng dụng rộng rãi do nấm men kết phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long». Bên cạnh
hợp được những ưu điểm của sinh vật đơn bào đó, nghiên cứu còn sử dụng một số loại trang
và sinh vật có nhân điển hình. Ví dụ như các thiết bị, dụng cụ, hóa chất dùng trong nghiên
ưu điểm của việc sản xuất protein tái tổ hợp từ cứu sinh học phân tử và nuôi cấy nấm men như
tế bào nấm men Pichia pastoris bao gồm: sinh máy luân nhiệt, máy quang phổ so màu, tủ ấm
trưởng nhanh, cho mật độ tế bào lớn, sản xuất ra lắc, máy ly tâm, bộ điện di đứng, môi trường
nhiều protein, không bị tạp nhiễm với nội độc tố Yeast extract Peptone Dextrose (YPD), YPD-
và thể thực khuẩn, dễ thao tác di truyền, không Agar, YPD- Geneticin, Minimal dextrose (MD),
là vật mang các tác nhân gây bệnh cho người,… Minimal methanol (MM),...
(Eda và Pinar, 2012; Li et al., 2007). Theo
Balamurugan et al., (2007) đã cho thấy, hiệu suất
biểu hiện protein trên tế bào nấm men P. pastoris
cao gấp 10-100 lần so với trên tế bào E. coli. Tuy
nhiên, việc sử dụng tế bào nấm men làm hệ thống
biểu hiện để sản xuất vaccine phòng bệnh đốm
trắngcòn hạn chế và vaccine nàycòn chưa được
thử nghiệm trên tôm (Jha et al., 2007; Jha et al.,
2006a; Jha et al., 2006b; Mavichak et al., 2010;
Sarathi et al., 2008).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chọn lọc dòng nấm men có kiểu
hình Mut+
153 chủng P. pastoris pPIC9K-VP28 nghiên
cứu sẽ được cấy 3 đợt (50 chủng thí nghiệm và
01 chủng đối chứng/đợt) lần lượt trên các môi
trường MM, và MD ở 280
C trong 2-3 ngày để
kiểm tra khả năng sử dụng methanol. Các chủng
Mut+ và MutS được phân biệt dựa vào mức độ
tăng sinh của nấm men: Mut+ tăng trưởng bình
thường trên cả hai môi trường MM và MD;
trong khi đó, MutS chỉ tăng trưởng trên môi
trường MD mà không hoặc tăng trưởng rất yếu
trên môi trường MM. Các chủng có khả năng
mọc tốt trên cả 2 môi trường sẽ được chọn cho
nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu này tiến hành nhằm chọn lọc
được dòng nấm men thích hợp làm nguyên liệu
để điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm
trắng cho tôm nuôi. Đây là nghiên cứu thuộc
đề tài cấp Bộ: "Bước đầu nghiên cứu, sản xuất
tolerine có khả năng hạn chế lây lan của virus
gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương
phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long" thực hiện
năm 2013-2015.
2.2.2. Chọn lọc dòng P. pastoris mang
nhiều gen bản sao của gen mục tiêu
Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 đã chọn
lọc theo 2 phương pháp trên sẽ được cấy chuyển
sang môi trường YPD-Agar có bổ sung Geneticin
(G418) nồng độ 0,25 mg/l; và 4 mg/ml. So sánh
khả năng phát triển của các dòng P. pastoris
pPIC9K-VP28 trên 2 môi trường này. Theo lý
thuyết, dòng nấm men có khả năng mọc trên môi
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu chính là 150 chủng
nấm men Pichia pastoris GS115 (Invitrogen)
mang plasmid pPIC9K-VP28 (Invitrogen) và
76
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
trường có 0,25 mg G418 có và 4 mg G148 lần nitrocellulose bằng máy chuyển màng semi dry
lượt có 01 và 14-16 copy gene VP28-His.
với cường độ dòng điện 1mA/cm2 trong 2 giờ.
Sau đó, màng được giữ ở 4°C trong dung dịch
5% (w/v) sữa gầy hòa tan trong dung dịch đệm
TBS (10 mM Tris-HCl,pH 8,0 ± 0,2, 150 mM
NaCl) có 0,05% Tween. Màng được rửa 03 lần
bằng dung dịch TBS-T; rồi được ủ với kháng
thể sơ cấp - kháng thể đa dòng kháng thỏ
đặc hiệu cho protein VP28 (Genesis, #GB-
10006) - trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với
tỷ lệ pha loãng 1:1.000 trong 2 giờ trên máy
lắc ở nhiệt độ phòng. Sau đó, màng lai được
rửa 3 lần bằng TSB-T và ủ với kháng thể thứ
cấp - kháng thể thỏ kháng His (Santa Cruz,
#sc-803) trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với
tỷ lệ pha loãng 1/500 qua đêm ở 4oC. Cuối
cùng, màng lai được rửa 3 lần trong TBS-T và
được hiện màu bằng hỗn hợp 3,76 ml TBS/T
với một phần tư viên DAB 10 mg cùng 3 µl
H2O2 30% cho đến khi xuất hiện vạch protein
quan tâm với độ đậm mong muốn.
2.2.3. Chọn lọc dòng nấm men có khả
năng sinh tổng hợp protein VP28
• Xác định dꢀng nấm men có khả năng sinh
tổng hợp protein VP28
Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 và đối
chứng P. pastoris pPIC9K được biểu hiện trên
môi trường nuôi cấy sinh khối Buffered glycerol-
complex medium (BMGY) và kích thích 2%
methanol trên môi trường Buffered methanol-
complex medium (BMMY) trong 72 giờ. Quy
trình biểu hiện như sau: Các khuẩn lạc đơn P.
pastoris pPIC9K-VP28 được tăng sinh trong 100
ml môi trường BMGY ở 280C, 250 vòng.phút-1
cho đến khi OD600 2-6. Sau đó dịch được ly tâm
thu sinh khối và huyền phù trong môi trường
BMMY và đo OD600 dịch đạt 1,0. Tiếp theo dịch
chứa chủng được kích thích sẽ thêm methanol
100% để đạt nồng độ 2% và đem lắc ở 280C,
250 vòng.phút-1. Sau 24 giờ nuôi cấy các erlen
chứa dịch được thêm methanol để đạt nồng độ
cuối 2%. Sự hiện diện của protein VP28 trong
xác tế bào được kiểm tra bằng SDS-PAGE và
• Xác định chủng nấm men cho sinh khối
tốt nhất
Các chủng nấm men – kết quả chọn lọc
khẳng định lại bằng phương pháp Western blot theo các phương pháp trên –được nuôi cấy tăng
với kháng thể đặc hiệu VP28 (Invitrogen, Mỹ).
sinh trên môi trường BMGY và kích thích biểu
hiện protein trên môi trường BMMY trong điều
kiện nồng độ methanol 2%, nhiệt độ nuôi cấy
280C và tốc độ lắc ở 150 và 250 vòng.phút-1.
Mỗi chủng được nuôi cấy trong 03 erlen 500
ml khác nhau. Tốc độ sinh trưởng của các dòng
nấm men được xác định bằng cách lấy 1 ml mẫu
theo thời gian nuôi cấy (0, 12, 24, 36, 48, 60 và
72 giờ) pha loãng theo cơ số 10 và cấy trang
trên môi trường YPD-Agar.
Phương pháp phân tích SDS-PAGE và
Western blot: Tế bào nấm men P. pastoris
pPIC9K-VP28 được ly trích protein tổng số
bằng cách bổ sung NaOH 0,4 M ủ ở nhiệt độ
phòng trong 5 – 10 phút. Sau đó dung dịch được
ly tâm 14.000 vòng.phút-1 trong 1 phút để thu
cặn tủa. Huyền phù cặn trong 50 µl dung dịch
đệm tải mẫu (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ± 0,2;
100 mMdithiotreitol; 2% w/v SDS; 0.1% w/v
bromophenol blue and 10% v/vglycerol) rồi đun
sôi hỗn hợp ở 1000C trong 3 phút; cuối cùng
ly tâm lấy 5-12 µl dịch nổi để điện di SDS –
PAGE gel và nhuộm Coomassie Blue R-50. Để
phân tích Western blot, protein đã phân tách
trên bản gel SDS-PAGE được chuyển qua màng
• Xác định lượng protein VP28
Tất cả các chủng nấm men được chọn lọc sẽ
được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường BMGY
và kích thích biểu hiện protein trên môi trường
BMMY trong điều kiện nồng độ methanol 2%,
nhiệt độ nuôi cấy 280C và tốc độ lắc ở 250 vòng.
77
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
phút-1. Tại 84 giờ sau kích thích biểu hiện, các dung dịch nuôi cấy theo thời gian (0, 12, 24, 36,
chủng được thu mẫu, các mẫu thu được cân sinh 48, 60, 72, 84 giờ).
khối (xác tế bào) sao cho khối lượng xác tế bào
là tương đương. Các mẫu này được phân tích sự
hiện diện của protein VP28 bằng phương pháp
SDS-PAGE và Western-Blot, xác định độ lớn
của các vạch thể hiện protein tương ứng để chọn
chủng nghiên cứu tiếp theo. Sau đó, khả năng
sinh protein VP28 theo thời gian của 1 chủng
được chọn cũng được xác định bằng cách phân
tích Western-Blot của xác tế bào trong 1 ml
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris
GS115 có kiểu hình Mut+
153 khuẩn lạc được được dùng để kiểm
tra kiểu hình bằng cách nuôi cấy lần lượt trên
môi trường MM, MD ở 280C trong 3 ngày. Sau
ba ngày nuôi cấy, thu được 125 khuẩn lạc mọc
tốt trên môi trường có và không có bổ sung
methanol (Bảng 1).
Bảng 1: Kết quả kiểm tra tốc độ tăng trưởng trên môi trường chứa methanol
Nấm men kiểm tra
(chủng)
Chủng mọc tốt trên 2 môi trường
TT
Tên nhóm thí nghiệm
(chủng)
1
2
3
4
5
6
2 (pPICK9K-VP28)
ĐC 2 (pPICK-9K)
3 (pPICK9K-VP28)
ĐC 3 (pPICK9K)
7 (pPICK9K-VP28)
ĐC 7 (pPICK9K)
50
1
42
0
50
1
45
0
50
1
38
0
3.2. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris
Theo tính toán lý thuyết cấu trúc pPICK9K-
VP28 được biến nạp vào nấm men sẽ xảy ra
hiện tượng tái tổ hợp vật chất di truyền giữa cấu
trúc gen AOX1 của vector pPIC9K với AOX1
ở genome của nấm men, có thể tạo thành 2
dạng kiểu hình nấm men Mut+ và Muts. Ở kiểu
hình Mut+, gen AOX1 tự nhiên của nấm men
còn nguyên vẹn nên nó có thể phát triển mạnh
trên môi trường có methanol do biến dưỡng
methanol tốt. Ngược lại, ở kiểu hình Muts gen
AOX1 bị bất hoạt làm nấm men phát triển kém
trên môi trường có methanol.
GS115 mang nhiều bản sao gen mục tiêu
Quá trình sàng lọc dòng P. pastoris có mang
nhiều bản sao gen mục tiêu được thực hiện bằng
cách cấy chuyển 125 khuẩn lạc sang môi trường
YDP-Agar có bổ sung G418 ở các nồng độ 0,25
mg/l và 4 mg/l. Kết quả sàng lọc đã xác định
được 113/125 khuẩn lạc có khả năng kháng
Geneticin 418 ở nồng độ 0,25 mg/l và 82/125
khuẩn lạc có khả năng kháng G418 ở nồng độ 4
mg/l. Theo lý thuyết, 82 khuẩn lạc này có chứa
14-16 copy gene VP28-His trong genome và
chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu
hiện protein VP28.
78
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 2: Kết quả sàng lọc các dòng nấm men trên môi trường có bổ sung Geneticin G418
Tên nhóm thí
nghiệm
Số khuẩn lạc
kiểm tra
Số khuẩn lạc kháng
0,25 mg G418/l
Số khuẩn lạc kháng 4 mg
G418/l
TT
1
2
3
4
5
6
2 (pPICK9K-VP28)
ĐC 2 (pPICK9K)
3 (pPICK9K-VP28)
ĐC 3 (pPICK9K)
7 (pPICK9K-VP28)
ĐC 7 (pPICK9K)
42
1
40
0
26
0
45
1
42
0
28
0
38
1
31
0
26
0
3.3. Kết quả chọn lọc dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp protein VP28
• Khả năng sinh tổng hợp protein VP28
Hình 1: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 bằng SDS-PAGE (A) và Western-Blot (B)
M1: Thang protein opti protein marker G252 ; M2: Thang protein Bio basic BSM0671
ĐC, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143: chủng nấm men đối chứng, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143
82 chủng nấm men mang pPIC9K-VP28 kích thước khoảng 30 KDa bằng cả hai phương
đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm men mang pháp phân tích SDS-PAGE và Western Blot
pPICK9K rỗng (đối chứng âm) được cảm ứng (Hình 1); các chủng này được dùng để nghiên
biểu hiện protein trên môi trường nuôi cấy cứu tiếp theo.
sinh khối BMGY và kích thích methanol 2%
• Xác định sinh khối của các dꢀng nấm men
trên môi trường BMMY trong 72 giờ. Sự hiện
8 chủng nấm men đã qua sàng lọc và 1
chủng đối chứng được tiến hành nuôi cấy, kích
thích biểu hiện protein bằng methanol 2% ở
nhiệt độ 280C và tốc độ lắc 150 vòng/phút. Kết
quả cho thấy, tốc độ sinh trưởng của các chủng
nấm men nghiên cứu khác nhau. Chủng 11 có
tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế
bào nấm men cao nhất ở 108 giờ sau kích thích
biểu hiện bằng methanol 2% (2,99*109tế bào/
diện của protein VP28 trong xác tế bào và dịch
nuôi cấy được phân tích bằng kỹ thuật SDS-
PAGE và Western Blot với kháng thể đặc hiệu
của VP28. Kết quả biểu hiện protein đã xác
định được 55 chủng có sự hiện diện của protein
VP28 bằng kỹ thuật Western Blot. Tuy nhiên,
chỉ có 8 chủng: (3 chủng của nhóm 2 (1, 11,
42); 2 chủng của nhóm 3 (57, 100) và 03 chủng
của nhóm 7 (126, 143, 147) cho vạch rõ ràng ở
79
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
ml), sau đó là chủng 57 (2,59*109tế bào/ml). và 168 giờ cho chủng 120 (Hình 2). Bên cạnh
Các chủng còn lại có tốc độ sinh trưởng chậm đó, mật độ tế bào nấm men thu được trong 1 ml
hơn – thời gian cho sinh khối tối đa lâu hơn – môi trường nuôi cấy tại thời điểm sinh trưởng
120 giờ cho chủng 1, 132 giờ cho chủng 42, cao nhất của các chủng này cũng thấp hơn giá
chủng 126, chủng 143; 157 giờ cho chủng 147, trị đạt được của chủng 11 ở 108 giờ (P<0,05).
Hình 2: Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm men ở tốc độ lắc 150 vòng/phút
Khi được kích thích biểu hiện protein
ở tốc độ lắc cao hơn (250 vòng.phút-1), chủng nghiên cứu đều cho mật độ lớn hơn 109
Cụ thể, tại 84 giờ sau kích thích, tất cả các
tế
hầu hết các dòng nấm men có tốc độ sinh bào/ml (Hình 3). Đặc biệt, chủng 11 cho sinh
trưởng nhanh hơn và cho sinh khối lớn hơn khối lớn nhất 3,92*109 tb/ml. Chủng 11 được
(Bảng 3).
chọn làm chủng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3: Mức độ tăng trưởng tối đa của các dòng nấm men theo tốc độ lắc
Tốc độ lắc 150 vòng/phút
Tốc độ lắc 250 vòng/phút
Chủng
nấm men
Thời gian
Mật độ (tế bào/ml)
1,87*109
Thời gian
Mật độ (tế bào/ml)
2,68*109
1
120
108
132
108
168
132
132
120
120
84
11
2,99*109
3,92*109
42
1,90*109
84
2,36*109
57
2,59*109
96
2,75*109
120
126
143
147
2,00*109
108
120
120
108
2,13*109
2,39*109
2,68*109
1,96*109
2,14*109
1,77*109
2,01*109
80
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 3: Tốc độ sinh trưởng của các dòng nấm men ở tốc độ lắc 250 vòng.phút-1
3.4. Khả năng sinh protein của các dòng
tế bào nấm men chọn lọc
và Western blot (Hình 4). Kích thước vạch
protein của chủng nấm men không khác nhau
rõ rệt trên bản gel SDS-PAGE; song vạch thể
hiện protein VP28 được quan sát thấy rõ ở
các chủng 11, 42 và 147 trên bản gel Western-
blot. Từ kết quả này, chủng 11 được chọn để
nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả phân tích protein trong cùng
một lượng xác nấm men ở 9 mẫu chọn lọc
cho thấy các chủng đều có khả năng biểu
hiện protein VP28 – đều cho 1 vạch rõ ở kích
thước khoảng 30 kDatrên bản gel SDS-PAGE
Hình 4: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 trong 9 chủng nấm men chọn lọc
M1: Thang protein Bio basic BSM0671; M2: PageRuler #26619
ĐC, 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147: chủng đối chứng, chủng 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147
81
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Lượng protein VP28 được chủng 11 biểu
Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protein
hiện theo thời gian được xác định theo thời gian vỏ VP 28 đã được dòng hóa vào tế bào nấm men
sau kích thích biểu hiện: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 và việc sàng lọc 150 chủng nấm men từ 03 đợt
và 84 giờ. Kết quả cho thấy lượng protein VP28 dòng hóa khác nhau đã cho 9 chủng có biểu
được tạo ra tăng dần theo thời gian kích thích; hiện protein VP28 tốt trong tế bào. Chín chủng
lượng protein cao nhất đạt tại 84 giờ (Hình 5).
này đều cho vạch protein đặc hiệu cho VP28
ở khoảng 30 kDa trên bản gel SDS-PAGE và
Western-blot. Kết quả này tương tự như kết quả
của Wang (2009) khi tác giả đã xác định được
vạch khoảng 30 kDa trên bản gel của các dòng
nấm men P.pastoris có chứa gen mã hóa protein
vỏ VP28. Trong khi đó Jha et al., (2007) lại
xác định được vạch ở vị trí 35 kDa trên bản gel
phân tách protein của SDS-PAGE và Western-
blot. Sự khác biệt về giá trị trọng lượng thực
của protein (28 kDa) và giá trị được xác định
(30 kDa, hoặc 35 kDa) có thể do việc gắn thêm
các nucleotide mã hóa các axit amin của histaq
hoặc do quá trình đường hóa (glycosylation)
hay phospo hóa (phosphorylation) – những hiện
tượng thường gặp khi sử dụng tế bào nấm men
làm hệ thống biểu hiện.
Hình 5: Sự hiện diện của protein VP28 theo
thời gian trong xác tế bào nấm men chủng 11
M: Thang PageRuler #26619
ĐC: chủng đối chứng ở 84 giờ
0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 chủng 11 ở các giờ 0,
12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 sau biểu hiện
IV. THẢO LUẬN
Kết quả biểu hiện protein của các chủng
nấm men chọn lọc đã cho thấy chủng 11 có tốc
độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế bào lớn
Việc sử dụng tế bào nấm men để sản xuất
vaccine phòng bệnh cho động vật trên cạn đã
được nghiên cứu rộng rãi như bệnh Gumboro
trên gà (infectious bursal disease), dịch tiêu
chảy cấp trên lợn (porcine epidemic diarrhea),
bệnh sốt lợn cổ điển (classical swine fever),
bệnh do virus viêm gan B trên người,…(Eda
Celik và Pinar Calik, 2012; Rabert et al., 2013;
Shin và Yoo, 2013); tuy nhiên ứng dụng này còn
chưa được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy
sản, đặc biệt là trong việc chế tạo vaccine phòng
bệnh cho tôm nuôi. Hiện nay, mới chỉ có hai
nhóm nghiên cứu sử dụng tế bào nấm men P.
pastoris để dòng hóa gen mã hóa protein vỏ:
VP19, VP28, VP26 (Jha et al., 2007; Jha et al.,
2006a; Wang, 2009), VP37 (Liu et al., 2006),
và protein PmRab7 – a shrimp WSSV-binding
protein - (Jupatanakul et al., 2010) trong phòng
bệnh đốm trắng cho crayfish và tôm nuôi.
trong thời gian ngắn. Cụ thể, ở điều kiện 280
C,
nồng độ methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250
vòng.phút-1, chủng nấm men 11, nuôi cấy trong
erlen 500 ml đạt mật độ tế bào tối đa tại 84 giờ
sau kích thích biểu hiện. Trong các trường hợp
nuôi cấy trong nồi lên men ở tốc độ khuấy tương
tự (250 vòng/phút), tốc độ sinh trưởng của nấm
men nhanh hơn, đạt mật độ tế bào tối đa ở 72
giờ (Asada et al., 2011; Cai et al., 2014). Trong
phần lớn các nghiên cứu về tốc độ sinh trưởng
của nấm men, tốc độ sinh trưởng của nấm men
được tính toán dựa trên giá trị OD600 của dung
dịch nuôi cấy theo thời gian; trong nghiên cứu
này giá trị OD600 của các chủng cũng được xác
định (không trình bày trong bài) nhưng không
tìm thấy sự sai khác giữa các chủng nghiên cứu,
82
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
vì vậy tốc độ tăng trưởng được xác định bằng bình hoặc các chất phụ gia (axit casamino,
cách đếm trực tiếp khuẩn lạc nấm men thông qua sorbitol, EDTA),… (Peng et al., 2011; Rabert
phương pháp trang đĩa dịch nuôi cấy ở các nồng et al., 2013; Shi et al., 2003). Song, trong điều
độ pha loãng khác nhau. Hơn thế nữa, phần lớn kiện thực tế của phòng thí nghiệm, các nghiên
các tài liệu đều xác định việc tăng trưởng của cứu về ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả
chủng nấm men sau dòng hóa trong điều kiện năng lên men của chủng nấm men chọn lọc còn
sử dụng nồi lên men trong khi nghiên cứu này chưa được thực hiện.
được tiến hành trên erlen 500 ml nên một số yếu
tố môi trường như pH, nồng độ methanol, hàm
lượng oxy… không được kiểm soát chặt chẽ,
do đó có thể làm ảnh hưởng đến mật độ tế bào
cũng như làm giảm khả năng biểu hiện protein
của dòng nấm men. Đó có thể là các lý do khiến
mật độ tế bào nấm men cao nhất mà nghiên cứu
này tìm được (3,92x109 tế bào/ml) khác với mật
độ nấm men ở các nghiên cứu khác – như 2,4 x
109 tế bào/ml với chủng nấm men chứa gen quy
định protein CHRM2 (Asada et al., 2011).
KẾT LUẬN
Chủng nấm men P. pastoris GS115 số 11
có tốc độ sinh trưởng nhanh cho 3,92x109 tế
bào/ml sau 84 giờ kích thích biểu hiện ở điều
kiện lên men trong bình lắc ở 280C, nồng độ
methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 vòng/
phút đã được chọn lọc từ 150 chủng nấm men
sau dòng hóa. Đây cũng là chủng có khả năng
biểu hiện protein VP28 tốt nhất – kết quả chạy
điện di phân tách protein trên SDS-PAGE và
kết quả phân tích Western-blot bằng kháng thể
đặc hiệu của VP28 cho vạch rõ ở khoảng 30
kDa. Chủng này được chọn làm nguyên liệu
điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm
trắng cho tôm nuôi.
Theo các nhà nghiên cứu, ngoài tốc độ lắc,
nhiều yếu tố khác nữa có thể ảnh hưởng đến việc
biểu hiện protein ở nấm men P. pastoris như pH,
nhiệt độ, nồng độ methanol, thành phần trung
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Asada, H., Uemura, T., Yurugi-Kobayashi, T.,
Shiroishi, M., Shimamura, T., Tsujimoto, H.,
Ito, K., Sugawara, T., Nakane, T., Nomura, N.,
Murata, T., Haga, T., Iwata, S., Kobayashi, T.,
2011. Evaluation of the Pichia pastoris expression
system for the production of GPCRs for structural
analysis. Microbial Cell Factories 10.
Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo,
H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y.,
2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus
(Marsupenaeus) japonicus from white spot
syndrome disease after oral administration of
recombinant VP28 expressed in Brevibacillus
brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320.
Balamurugan, V., Reddy, G.R., Suryanarayana, V.V.S.,
2007. Pichia pastoris: A notable heterologous
expression system for the production offoreign
proteins—Vaccines Indian J. Biotechnol. 6, 175-
186
EdaCelik,PinarCalik,2012.Productionofrecombinant
proteins by yeast cells. Biotechnology Advances
30, 1108-1118.
Fu, L.L., Wang, Y.B., Wu, Z.C., Li, W.F., 2011. In vivo
assessment for oral delivery of Bacillus subtilis
harboring a viral protein (VP28) against white
spot syndrome virus in Litopenaeus vannamei.
Aquaculture 322, 33-38.
Cai, F., Li, T., Xie, Y., He, X., 2014. Expression of
functional single-chain variable domain fragment
(scFv) antibody against Metolcarb in Pichia
pastoris. Annals of Microbiology 64, 589-597.
83
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hansson, M., Nygren, P., Stahl, S., 2000. Design and
Mavichak, R., Takano, T., Kondo, H., Hirono, I.,
Wada, S., Hatai, K., Inagawa, H., Takahashi, Y.,
Yoshimura, T., Kiyono, H., Yuki, Y., Aoki, T.,
2010. The effect of liposome-coated recombinant
protein VP28 against white spot syndrome virus in
kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus. Journal
of Fish Diseases 33, 69-74.
production of recombinant sub-unit vaccines.
Biotechnology and Applied Biochemistry 32, 95-
107.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, W.F., Shen,
J., 2007. Protection of Procambarus clarkii against
white spot syndrome virus using recombinant
oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish &
Shellfish Immunology 22, 295-307.
Namikoshi, A., Wu, J.L., Yamashita, T., Nishizawa,
T., Nishioka, T., Arimoto, M., Muroga, K., 2004.
Vaccination trials with Penaeus japonicus to
induce resistance to white spot syndrome virus.
Aquaculture 229, 25-35.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006a. Protection of
Procambarus clarkii against white spot syndrome
virus using recombinant subunit injection vaccine
expressed in Pichia pastoris. Fisheries Science 72,
1011-1019.
Ning, D., Leng, X., Li, Q., Xu, W., 2011. Surface-
displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce
protection against white spot syndrome virus in
crayfish by oral administration. J.Appl. Microbiol.
111, 1327-1336.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Shen, J., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li,
W.F., 2006b. The efficacy of recombinant vaccines
against white spot syndrome virus in Procambarus
clarkii. Immunology Letters 105, 68-76.
Peng, H., Liu, H.P., Chen, B., Hao, H., Wang, K.J.,
2011. Optimized production of scygonadin in
Pichia pastoris and analysis of its antimicrobial
and antiviral activities. Protein Expr. Purif. 82,
37-44.
Jupatanakul, N., Wannapapho, W., Eurwilaichitr, L.,
Flegel, T.W., Sritunyalucksana, K., 2010. Cloning
and expression of recombinant shrimp PmRab7 (a
virus-binding protein) in Pichia pastoris. Protein
Expr. Purif. 76, 1-6.
Rabert, C., Weinacker, D., Pessoa Jr, A., FarÃas, J.G.,
2013. Recombinants proteins for industrial uses:
Utilization of Pichia pastoris expression system.
Braz. J. Microbiol. 44, 351-356.
Kim, C.S., Kosuke, Z., Nam, Y.K., Kim, S.K., Kim,
K.H., 2007. Protection of shrimp (Penaeus
chinensis) against white spot syndrome virus
(WSSV) challenge by double-stranded RNA. Fish
& Shellfish Immunology 23, 242-246.
Rout, N., Kumar, S., Jaganmohan, S., Murugan, V.,
2007. DNA vaccines encoding viral envelope
proteins confer protective immunity against
WSSV in black tiger shrimp. Vaccine 25, 2778-
2786.
Kumar, S.R., Ahamed, V.P.I., Sarathi, M., Basha,
A.N., Hameed, A.S.S., 2008. Immunological
responses of Penaeus monodon to DNA vaccine
and its efficacy to protect shrimp against white
spot syndrome virus (WSSV). Fish & Shellfish
Immunology 24, 467-478.
Musthaq S Syed, Jimmy Kwang., 2011. Oral
Vaccination of Baculovirus-Expressed VP28
Displays Enhanced Protection against White Spot
Syndrome Virus in Penaeus monodon. PLoS ONE
6.
Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G., Ilangovan, K.,
Suzara, V.V., Duzgunes, N., Renugopalakrishnan,
V., 2007. Expression of recombinant proteins in
Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142,
105-124.
Sarathi, M., Simon, M.C., Venkatesan, C., Hameed,
A.S.S., 2008. Oral administration of bacterially
expressed VP28dsRNA to protect Penaeus
monodon from white spot syndrome virus. Marine
Biotechnology 10, 242-249.
Liu, Q.H., Huang, J., Han, W.J., Liang, Y., Lu, C.L.,
Wang, Q.Y., 2006. Expression, purification
and characterization of WSSV-VP37 in Pichia
pastoris. Aquaculture 258, 55-62.
Satoh, J., Kim, H.J., Matsui, T., Nishizawa, T.,
Optimization of WSSV rVP Expression in E.
84
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
coli Cells and Minimum Dose of rVPs for Oral
Virus (WSSV) and the Expressions in Pichia
Pastoris. Master’s thesis, Jimei University. China.
Vaccination in Kuruma Shrimp. Fish Pathology
45, 169-174.
Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., van Hulten,
M.C.W., 2004a. Protection of Penaeus monodon
against white spot syndrome virus by oral
vaccination. Journal of Virology 78, 2057-2061.
Shi, X., Karkut, T., Chamankhah, M., Alting-Mees, M.,
Hemmingsen, S.M., Hegedus, D., 2003. Optimal
conditions for the expression of a single-chain
antibody (scFv) gene in Pichia pastoris. Protein
Expr. Purif. 28, 321-330.
Witteveldt, J., Vlak, J.A., Van Hulten, M.C.W., 2004b.
Protection of penaeus monodon against white spot
syndrome virus using a WSSV subunit vaccine.
Fish & Shellfish Immunology 16, 571-579.
Shin, M.K., Yoo, H.S., 2013. Animal vaccines based
on orally presented yeast recombinants. Vaccine
31, 4287-4292.
Witteveldt, J., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2006.
Increased tolerance of Litopenaeus vannamei
to white spot syndrome virus (WSSV) infection
after oral application of the viral envelope protein
VP28. Diseases of Aquatic Organisms 70, 167-
170.
Singh, I.S.B., Manjusha, M., Pai, S.S., Philip, R., 2005.
Fenneropenaeus indicus is protected from white
spot disease by oral administration of inactivated
white spot syndrome virus. Diseases of Aquatic
Organisms 66, 265-270.
Wang, L., 2009. Cloning of Envelope Protein Genes
vp26 and vp28 of Shrimp White Spot Syndrome
85
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
scReening sUiTable Pichia PasToRis sTRains caRRied VP28 gene
To PRodUce ToleRine againsT WhiTe sPoT disease in shRimP
Ngo Thi Ngoc Thuy1*, Dang Thi Tra My1
ABSTRACT
The use of Pichia pastoris as the expression system to produce recombinant proteins for disease
prevention in inverterbrate has been published widely; however, it has been limited used in aqua-
culture, especially in preventation of shrimp diseases. This study is aimed to find a suitable strain
from 150 strains of P. pastoris carrying pPick9K-VP28 vectors to produce tolerine against white
spot disease in shrimp. Those strains were screened based on the phenotype (Mut+), copy number
of VP 28 gene, the ability to express VP28 protein and growth rate of yeast strains. The selection
process figured 125 strains of phenotype Mut+, in which, 82 strains have got 14-16 copy gene of
VP28-His in genome. Further screening showed that recombinant VP28 protein was well expressed
in 8 P.pastoris strains; the expressing protein was given a clear specific band of about 30kDa on
SDS-PAGE gel and Western-blot cellulose membrane. Finally, one strain – strain 11 – revealed
quick growth with the highest cell density of 3.92 x 109cfu/ml at 84 hours post stimulation and ef-
fectively expressed rVP28 the protein was selected to produce tolerine against white spot disease
in future studies.
Keywords: VP28, Pichia pastoris, White spot disease.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015
Ngày duyệt đăng: 15/6/2015
1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research,Research Institute for Aquaculture No 2.
* Email: [email protected]
86
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
12 trang
15940
Free
Bạn đang xem tài liệu "Sàng lọc các dòng nấm men mang gen VP28 thích hợp để sản xuất Tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- sang_loc_cac_dong_nam_men_mang_gen_vp28_thich_hop_de_san_xua.pdf
