Khả năng kháng khuẩn và phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) của tỏi (Allum sativum) lên men
Khoa học Nông nghiệp
Khả năng kháng khuẩn và phòng bệnh
hoại tử gan tụy cấp ở tôm thẻ chân trắng
(Penaeus vannamei) của tỏi (Allum sativum) lên men
Nguyễn Thị Hạnh, Phan Thị Vân, Phạm Thị Yến, Lê Thị Mây, Trương Thị Mỹ Hạnh*
Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 1
Ngày nhận bài 16/11/2020; ngày chuyển phản biện 20/11/2020; ngày nhận phản biện 2/1/2021; ngày chấp nhận đăng 6/1/2021
Tóm tắt:
Nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm tra khả năng kháng khuẩn của tỏi lên men đối với các chủng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus KC.13.14.2 và Vibrio harveyi KC.13.17.5 gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic
necrosis disease - AHPND), đồng thời đánh giá khả năng phòng AHPND cho tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)
trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả chỉ rõ, sản phẩm tỏi lên men có độ nhạy cao đối với cả 2 chủng vi khuẩn gây
AHPND khi thử nghiệm ở 25 µl và 30 µl. Khi bổ sung dịch tỏi lên men với liều 15 ml/kg thức ăn/ngày vào thức ăn để cho
tôm ăn trong 10 ngày liên tục đã có khả năng phòngAHPND cho tôm. Thức ăn trộn dịch tỏi lên men bao ngoài bằng dầu
mực có hiệu quả cao nhất khi nâng tỷ lệ sống của tôm lên 53%, cao hơn so với không sử dụng chất bao ngoài (51%), bao
ngoài bằng bột nếp (42%) và không sử dụng dịch tỏi lên men (14%).
Từ khóa: AHPND, dịch tỏi lên men, kháng khuẩn, phòng bệnh, tôm thẻ chân trắng.
Chỉ số phân loại: 4.5
tỏi đã không kích thích cho động vật thủy sản bắt mồi. Đối
với tỏi tươi ép, mùi đặc trưng của tỏi không kích thích động
vật thủy sản bắt mồi. Phương pháp lên men tỏi đã khắc phục
được các hạn chế nêu trên. Phương pháp này thực hiện không
quá cầu kỳ, giá thành rẻ, thuận lợi cho bà con nông dân khi sử
dụng cho động vật thủy sản nuôi, đặc biệt sản phẩm có mùi
thơm kích thích động vật thủy sản bắt mồi. Đây là một hướng
nghiên cứu đầy hứa hẹn, có giá trị ứng dụng cao.
Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây,AHPND là một trong những bệnh
phổ biến, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm trên
thế giới, trong đó có Việt Nam. Tác nhân gây AHPND được xác
định là do vi khuẩn V. parahaemolyticus [1]. Kết quả nghiên cứu
sâu về tác nhân gây AHPND cho thấy, bản chất gây ra AHPND
là vi khuẩn mang Plasmid có chứa gen độc lực gây hoại tử gan
tụy cấp [2, 3]. Ở Việt Nam, đã xác định có ít nhất 2 chủng vi
khuẩn (V. parahaemolyticus và V. harveyi) gây AHPND ở tôm
nuôi nước lợ, trong đó có tôm thẻ chân trắng [4, 5].
Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá khả năng kháng
vi khuẩn gây AHPND và hiệu quả phòng AHPND trên tôm
thẻ chân trắng trong điều kiện phòng thí nghiệm của sản
phẩm tỏi lên men.
Tỏi có vai trò kích thích tiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch,
gia tăng kiểm soát tác nhân gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn và
nấm [6-8]. Một số nghiên cứu về hiệu quả của dịch chiết tỏi,
tỏi tươi ép, tỏi bột đối với phòng trị bệnh nhiễm khuẩn ở động
vật thủy sản đã được thực hiện [6-8]. Tuy nhiên, mỗi phương
pháp đều có hạn chế, cụ thể phương pháp tách chiết đòi hỏi
trang thiết bị và hóa chất chuyên dùng, người thực hiện cần
được đào tạo bài bản, chi phí thực hiện cao, dẫn đến giá thành
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
Củ tỏi ta (Allium sativum L.) thu tại Hải Dương, bóc bỏ
lớp vỏ lụa bên ngoài, sau đó cắt nhỏ các tép tỏi, phối trộn
cùng với rượu và mật ong theo tỷ lệ 10 kg tỏi : 10 lít rượu :
sản phẩm cao, ngoài ra còn không thuận tiện trong cách bảo 1 lít mật ong. Chuyển nguyên liệu đã phối trộn vào thùng/xô
quản lẫn sử dụng tại các nông hộ. Đối với tỏi bột, cần có đầu nhựa có nắp đậy ủ cho lên men trong thời gian 25-30 ngày
tư về hệ thống máy sấy, nghiền bột. Bên cạnh đó, bột tỏi để ở 30-35oC. Sau thời gian ủ, lọc bỏ phần bã của củ tỏi, phần
trộn vào thức ăn thường bám dính kém và mùi đặc trưng của dịch tỏi lên men được sử dụng để thử khả năng kháng khuẩn
* Tác giả liên hệ: Email: [email protected]
49
63(2) 2.2021
Khoa học Nông nghiệp
và hiệu quả phòng AHPND cho tôm.
Antimicrobial activity
and prevention acute hepatopancreatic
necrosis disease in brackish
whiteleg shrimp (Penaeus vannamei)
of the fermented garlic (Allium sativum)
Các chủng vi khuẩn thử nghiệm bao gồm V.
parahaemolyticus KC.13.14.2 và V. harveyi KC.13.17.5
gây AHPND ở tôm nuôi nước lợ tại Nghệ An. Các chủng
này hiện đang được lưu giữ tại Trung tâm Quan trắc môi
trường và bệnh thủy sản miền Bắc (CEDMA), Viện Nghiên
cứu nuôi trồng thủy sản 1.
Tôm thẻ chân trắng có khối lượng khoảng 3-4 g/con, kích
thước đồng đều, phản xạ nhanh, ruột đầy thức ăn, có kết quả
âm tính với vi rút gây bệnh đốm trắng và các loài vi khuẩn gây
AHPND.
Thi Hanh Nguyen, Thi Van Phan, Thi Yen Pham,
Thi May Le, Thi My Hanh Truong*
Research Institute for Aquaculture No 1
Received 16 November 2020; accepted 6 January 2021
Abstract:
Bể composit có thể tích 200 l/bể, muối biển nhân tạo
dùng để pha nước nuôi tôm ở độ mặn 15‰.
The study was conducted to screen the antibacterial
activity of fermented garlic against V. parahaemolyticus
KC.13.14.2 and V. harveyi KC.13.17.5, the causal agent
of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND).
The results showed that fermented garlic products had
a high sensitivity to both strains of screened bacteria
at concentrations of 25 and 30 µl. Then the effect of
fermented garlic as an agent for the prevention of
AHPND was evaluated in vivo. When adding fermented
garlic at a dose of 15 ml/kg food/day to feed shrimp for
10 consecutive days, it was possible to prevent AHPND
disease for shrimp. Food mixed with fermented garlic
with squid oil was the most effective when it increased
Phương pháp nghiên cứu
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của sản phẩm tỏi lên
men:
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm: các chủng vi khuẩn V.
parahaemolyticus KC.13.14.2 và V. harveyi KC.13.17.5 từ
tủ -80oC được nuôi cấy thuần lại trên đĩa TCBS (Thiosulfate
citrate bile salts), chọn 1 khuẩn lạc đơn đem nuôi cấy tăng sinh
trong môi trường NB có bổ sung 2% NaCl để thu dịch vi khuẩn.
Mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ
the survival rate of shrimp to 53%, significantly higher quang (OD) ở bước sóng 600 nm, mật độ vi khuẩn sử dụng để
khảo sát hoạt tính kháng khuẩn là 108 cfu/ml, tương ứng với
than treatment using supplementary feed without a
coating of 51%, coated with glutinous rice of 42%, and
no fermented garlic of 14%.
OD=0,1.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm tỏi lên men
bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch
Kirby-Bauer [9]. Nhỏ sản phẩm tỏi lên men lên các khoanh
giấy vô trùng với 6 thể tích để tiến hành thử nghiệm bao gồm
5,10, 15, 20, 25 và 30 µl/khoanh giấy. Khoanh giấy tẩm kháng
sinh Doxycyclin (30 µg) được sử dụng như đối chứng dương,
khoanh giấy nhỏ nước cất được sử dụng như đối chứng âm.
Dùng que trang trang đều 100 µl vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml
lên thạch Mueller Hinton, đặt các đĩa giấy đã thấm sản phẩm
tỏi lên men và đối chứng vào, sau đó ủ trong tủ ấm ở 29oC. Sau
24h nuôi cấy, đĩa thạch được lấy ra để đo đường kính vòng vô
khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn ≥16 mm: nhạy (dịch tỏi lên
men có độ nhạy với vi khuẩn) [10].
Keywords: AHPND, antibacterial, disease prevention,
fermented garlic, whiteleg shrimp.
Classification number: 4.5
Đánh giá hiệu quả phòng AHPND: thí nghiệm đánh giá
hiệu quả phòng bệnh đối với tôm gây nhiễm vi khuẩn gây
AHPND được mô tả chi tiết trong bảng 1.
63(2) 2.2021
50
Khoa học Nông nghiệp
Bảng 1. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng bệnh đối với tôm gây
nhiễm vi khuẩn gây AHPND.
mực nhỏ từng giọt một cho đến khi thấm đều các viên thức ăn,
đối với bột nếp đun chín rồi trộn từng thìa một cho đến khi đủ
bao ngoài các viên thức ăn. Thức ăn sau đó được rải mỏng ra
giấy rồi để khô nửa ngày trong tủ lạnh trước khi cho tôm ăn.
Đối chứng
dương
Đối chứng
âm
CT1
CT2
CT3
Thức ăn trộn
Cách bổ sung cùng tỏi lên
Thức ăn trộn
cùng tỏi lên
men có bao
ngoài bằng
dầu gan mực
Thức ăn
trộn cùng
tỏi lên men không có
không bao
ngoài
Thức ăn
thường
Thức ăn
thường
không có
chất bổ sung
Trong quá trình thí nghiệm, tôm vừa chết hoặc yếu
không phản xạ bơi khi có vật chạm vào được thu để tái phân
lập lại tác nhân gây nhiễm bằng phương pháp nuôi cấy và
định danh vi khuẩn theo phương pháp của Nicky B. Buller
[12], sử dụng bộ kít API 20E để thử sinh hóa, sau đó tra
servlet/Authenticate?action=prepareLogin.vĐồngvthời,
xác định tác nhân gâyAHPND bằng kỹ thuật PCR: sử dụng
cặp mồi AP3 (F: ATGAGTAACAATAAAACATGAAAC;
R: GTGGTAATATTGTACAGAA) được công bố bởi
Sirikharin và cs [13]. Cặp mồi AP3 để khuyếch đại đoạn
gen 336 bp của gen Toxin gây AHPND ở tôm, chu kỳ
nhiệt của phản ứng PCR được áp dụng như sau: 95oC (5
phút), [35 chu kỳ (94oC trong 1 phút, 53oC trong 30 giây
và 72oC trong 40 giây)], 72oC (5 phút) và 4oC (∞). Sản
phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1% trong dung
dịch 1X TBE và đọc kết quả dưới đèn UV, sản phẩm xuất
hiện vạch có kích thước 336 pb.
tỏi lên men
cho tôm
men có bao
ngoài bằng
bột nếp
chất
bổ sung
Trộn 15 ml dịch tỏi lên men/kg thức ăn/ngày
cho tôm ăn liên tục trong vòng 10 ngày, từ ngày
thứ 11 cho ăn thức ăn viên công nghiệp không
có tỏi lên men
Cách cho ăn
và liều lượng
bổ sung
Cho ăn thức ăn thường công
nghiệp không bổ sung dịch
tỏi lên men
Không có
bất kỳ tác
động nào của
vi khuẩn.
Tôm nuôi
bình thường
Mật độ vi
khuẩn ngâm
khi công
1x106 (cfu/ml)
Ngày thứ 11
cường độc
Thời điểm
ngâm vi khuẩn
Không ngâm
vi khuẩn
Thời gian
ngâm tôm
trong vi khuẩn
1 ngày, sau đó thay toàn bộ nước trong tất cả các bể thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí kéo dài 21 ngày, các nghiệm thức thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần,
mỗi bể 30 con tôm có kích cỡ khoảng 3-4 g và được theo dõi ghi chép số tôm chết tích lũy
theo thời gian, tái phân lập tác nhân vi khuẩn gây AHPND
Kết thúc thí nghiệm tôm còn sống ở các nghiệm thức
cũng được thu để định danh vi khuẩn V. parahaemolyticus
KC.13.14.2 trong gan tụy tôm và kiểm tra AHPND.
Tôm trước khi thí nghiệm được kiểm tra âm tính với
AHPND.
Phương pháp xử lý số liệu
Thí nghiệm được bố trí trong khoảng nhiệt độ 25-28oC,
pH 7,3-7,9, sục khí hoạt động liên tục ở các bể trong quá
trình thí nghiệm, độ mặn 15‰.
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần.
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và xử lý
thống kê bằng phần mềm SPSS với sự sai khác có ý nghĩa
p<0,05.
Sản phẩm tỏi lên men do chúng tôi tạo ra trước đó đã
được thử tại nông hộ nuôi tôm với mục đích để phòng bệnh
cho tôm nuôi. Kết quả được nông hộ phản ánh, các ao nuôi
tôm khi sử dụng dịch tỏi lên men bổ sung vào thức ăn cho
tôm ăn với liều lượng 15 ml/kg thức ăn/ngày, cho ăn 10 ngày
liên tục là có hiệu quả phòng bệnh so với các ao nuôi tôm
không sử dụng dịch tỏi lên men. Chính vì vậy, để kiểm chứng
lại kết quả một cách có ý nghĩa khoa học chúng tôi đã chọn
liều lượng 15 ml tỏi lên men/kg thức ăn/ngày, cho ăn 10 ngày
liên tục để phòng AHPND cho tôm trong thí nghiệm này.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Khả năng diệt khuẩn của tỏi lên men đối với các chủng
vi khuẩn gây AHPND
Kết quả thử nghiệm ở nồng độ 5 µl, sản phẩm tỏi lên
men không tạo được vòng vô khuẩn đối với cả 2 chủng vi
khuẩn thử nghiệm là V. parahaemolyticus KC.13.14.2 và
V. harveyi KC.13.17.5. Khi thử nghiệm ở các nồng độ cao
hơn là 10, 15 và 20 µl, sản phẩm tỏi lên men tạo ra vòng
kháng khuẩn trung bình dao động từ 7,2-13,8 mm (chủng
V. parahaemolyticus KC.13.14.2) và 8,0-14,6 mm (chủng
V. harveyi KC.13.17.5). Chỉ khi nâng nồng độ thử nghiệm
lên 25 và 30 µl thì sản phẩm tỏi lên men mới tạo ra vòng
kháng khuẩn có độ nhạy cao đối với cả 2 chủng vi khuẩn
thử nghiệm. Đường kính vòng vô khuẩn trung bình đạt được
lần lượt là 16,8-18,2 mm (V. parahaemolyticus KC.13.14.2)
và 17,2-18,8 mm (V. harveyi KC.13.17.5). Trong khi đó, đối
Công cường độc vi khuẩn bằng hình thức ngâm, vi khuẩn sử
dụng để gây nhiễm là chủng V. parahaemolyticus KC.13.14.2
gây AHPND đã được chúng tôi sử dụng làm vật liệu nghiên
cứu cho nhiều nghiên cứu trước đó. Mật độ vi khuẩn khi ngâm
là 1x106 cfu/ml [9, 11]. Xác định mật độ vi khuẩn ban đầu theo
phương pháp đo OD ở bước sóng l=600 nm, khi đo OD=0,1
tương đương với mật độ vi khuẩn ban đầu là 108 cfu/ml.
Sử dụng thức ăn tôm cao cấp của Công ty Thức ăn thủy
sản Việt Nam, bổ sung sản phẩm tỏi lên men thấm đều vào chứng Doxycyclin cũng chỉ tạo ra đường kính vòng vô khuẩn
thức ăn. Nghiệm thức sử dụng chất bao ngoài, dùng dầu gan trung bình 22,8-24,0 mm giữa hai chủng (bảng 2, hình 1).
51
63(2) 2.2021
Khoa học Nông nghiệp
là cồn 70o khi thử nghiệm ở 5 nồng độ (10, 15, 20, 25 và
30 µl) đều không có khả năng diệt khuẩn đối với các chủng
vi khuẩn V. parahaemolyticus (KC.12.020, KC.13.14.2) gây
AHPND trên tôm [14]. Trong khi đó, nghiên cứu này lại cho
thấy tỏi lên men có tính nhạy đối với cả 2 chủng vi khuẩn gây
AHPND là V. harveyi KC.13.17.5 và V. Parahaemolyticus
KC.13.14.2 khi thử nghiệm ở thể tích ≥25 µl (đường kính
vòng vô khuẩn >16 mm) (bảng 2).
Bảng 2. Khả năng diệt khuẩn của sản phẩm tỏi lên men đối với các
chủng gây AHPND.
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Nồng độ thử nghiệm
V. parahaemolyticus
KC.13.14.2
V. harveyi
KC.13.17.5
(µl)
5
0
0
10
7,2±0,8a
11,4±0,9b
13,8±1,3c
16,8±1,6d
18,2±1,4e
0
8,0±0,7a
9,8±0,8b
14,6±0,9c
17,2±0,8d
18,8±1,1d
0
15
Khả năng phòng bệnh của tỏi lên men đối với AHPND
trên tôm thẻ chân trắng
20
25
Trong 10 ngày đầu, tôm thẻ chân trắng ở các thí nghiệm
được ăn thức ăn có bổ sung dịch tỏi lên men để phòng
AHPND, từ ngày thứ 11 đến cuối thí nghiệm tôm ăn thức
ăn viên công nghiệp không bổ sung dịch tỏi lên men, các
bể ở thí nghiệm đối chứng tôm ăn thức ăn viên công nghiệp
không trộn dịch tỏi lên men trong suốt thời gian thí nghiệm.
Riêng các bể đối chứng âm và dương tôm ăn thức ăn viên
công nghiệp, không bổ sung dịch tỏi lên men. Kết quả cho
thấy, tôm ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều ăn hết
thức ăn, phản xạ nhanh nhẹn, màu sắc sáng và không thấy
có tôm chết. Đến ngày thứ 11 (ngày đầu tiên gây nhiễm), tất
cả các nghiệm thức thí nghiệm có gây nhiễm vi khuẩn đều
có tôm chết với tỷ lệ chết từ 1,1 đến 7,7%. Tôm chết nhanh
sau 2-4 ngày gây nhiễm và dừng chết sau 7 ngày gây nhiễm.
Cuối thí nghiệm, tỷ lệ tôm chết cao nhất là nghiệm thức đối
chứng dương với tỷ lệ chết cộng dồn là 86%. Tiếp đến là
nghiệm thức tôm bổ sung sản phẩm tỏi lên men vào thức ăn
có dùng bột nếp để bao ngoài với tỷ lệ chết cộng dồn là 58%.
Nghiệm thức tôm ăn thức ăn có bổ sung dịch tỏi lên men
bao ngoài bằng dầu gan mực và nghiệm thức không sử dụng
chất bao ngoài có tỷ lệ chết cộng dồn lần lượt là 47 và 49%.
Trong khi đó, nghiệm thức đối chứng âm tôm không có hiện
tượng chết (hình 2). Kết quả này cho thấy, sản phẩm tỏi lên
men có hiệu quả trong việc kiểm soát độc lực của vi khuẩn
V. parahaermolyticus KC.13.14.2 gây AHPND trên tôm.
30
Đối chứng (nước cất)
Doxycyclin (30 µg)
24,0±1,2
22,8±1,1
Ghi chú: a, b, c, d, e: trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa về mặt
thống kê p<0,05.
(B)
(C)
(A)
Hình 1. Khả năng diệt khuẩn của tỏi lên men đối với vi khuẩn gây
AHPND trên tôm. (A) Đĩa giấy tẩm dịch chiết tỏi; (B) Đường kính
vòng vô khuẩn của tỏi lên men khi thử với vi khuẩn V. parahaemolyticus
KC.13.14.2 gây AHPND; (C) Đường kính vòng vô khuẩn của tỏi lên men
khi thử với vi khuẩn V. harveyi KC.13.17.5 gây AHPND; ĐC: đối chứng
âm; Dx: Doxycyclin (30 µg).
Đối với chủng V. parahaemolyticus KC.13.14.2 khi nâng
nồng độ thử nghiệm từ 25 lên 30 µl, đường kính vòng vô
khuẩn tăng từ 16,8 lên 18,2 mm, khoảng cách này tạo ra sự
sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05). Trong khi đó,
khi nâng nồng độ thử nghiệm từ 25 lên 30 µl đối với chủng
V. harveyi KC.13.17.5, đường kính vòng vô khuẩn tạo ra từ 2
nồng độ lại không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (bảng
2, hình 1).
Kết quả thử nghiệm này của chúng tôi cũng tương đồng
với một số kết quả của các công trình nghiên cứu trước về
khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi đối với tác nhân vi
khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản. Theo Nguyễn Anh
Tuấn (2009) [11], dịch ép tỏi tươi có tác dụng diệt khuẩn rất
tốt đối với vi khuẩn V. harveyi ở nồng độ thử nghiệm là 100%
với đường kính vòng vô khuẩn trung bình là 22,1±3,11 mm.
Cao khô tỏi có khả năng diệt khuẩn cao với 2 chủng vi khuẩn
A. hydrophila gây bệnh trên cá trắm cỏ ở nồng độ thử nghiệm
là 30 µg/µl với đường kính vòng vô khuẩn trung bình lần lượt
là 18,33±1,57 mm và 18,33±1,53 mm [9].
Hình 2. Tỷ lệ chết cộng dồn của tôm trong thí nghiệm đánh giá khả
năng phòng AHPND của tỏi lên men.
Kết quả thí nghiệm cũng chỉ rõ, khi bổ sung sản phẩm tỏi
lên men vào thức ăn cho tôm với liều lượng 15 ml/kg thức ăn/
Cũng nghiên cứu và thử nghiệm đối với các chủng vi
khuẩn gây AHPND trên tôm Nguyễn Thị Hạnh và Đặng Thị
Lụa (2016) cho rằng, cao khô tỏi tách chiết bằng dung môi ngày liên tục trong 10 ngày đã có tác dụng nâng cao tỷ lệ sống
63(2) 2.2021
52
Khoa học Nông nghiệp
Bảng 3. Kết quả tái phân lập vi khuẩn gây AHPND trong quá trình
thí nghiệm.
của tôm khi công cường độc vi khuẩn gây AHPND. Trong đó,
hình thức sử dụng dầu gan mực để bao ngoài có hiệu quả cao
nhất, tỷ lệ sống của tôm ở nghiệm thức này là 53%, ở nghiệm
thức không sử dụng chất bao ngoài là 51%, còn ở nghiệm thức
sử dụng bột nếp để bao ngoài là 42% so với tôm ở nghiệm thức
đối chứng dương có tỷ lệ sống chỉ đạt 14% và đối chứng âm là
100%. Khi so sánh tỷ lệ sống của tôm giữa hai nghiệm thức có
hiệu quả cao nhất khi sử dụng sản phẩm tỏi lên men để phòng
AHPND là nghiệm thức sử dụng dầu gan mực để bao ngoài và
nghiệm thức không sử dụng chất bao ngoài cho thấy không có
sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tuy nhiên, lại có sự
khác nhau có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng
dương của thí nghiệm (p<0,05).
Tần xuất tái phân lập vi khuẩn V. parahaemolyticus
ở các nghiệm thức thí nghiệm
Ngày thí
TT
Đối
chứng
(-)
Đối
chứng
(+)
Bao ngoài Bao
nghiệm
Không
bao ngoài
dầu gan
mực
ngoài
bột nếp
1
2
3
12
15
21
KT
KT
0/5
2/2
2/2
0/1
2/2
2/2
0/1
2/2
2/2
0/1
2/2
2/2
0/1
KT: không thu mẫu.
Trong quá trình thí nghiệm, tôm chết ở các nghiệm thức
được thu để nuôi cấy và tái phân lập lại vi khuẩn gây nhiễm.
Kết quả nuôi cấy và định danh vi khuẩn cho thấy, 100% mẫu
thu khi tôm vừa mới chết/yếu vào ngày thứ 12 và 15 của thí
nghiệm (sau 2 và sau 5 ngày công cường độc) đều dương tính
với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Các chủng vi khuẩn phân
lập được đều có phản ứng sinh hóa trùng khớp với chủng V.
parahaemolyticus KC.13.14.2 ban đầu đem gây nhiễm. Điều
đó khẳng định, tôm trong các nghiệm thức gây nhiễm vi
khuẩn bị chết là do độc lực của vi khuẩn gây nhiễm. Trong khi
đó, 100% mẫu tôm sống thu ở các nghiệm thức vào ngày thứ
21 (ngày cuối) của thí nghiệm lại cho kết quả âm tính với vi
khuẩn V. parahaemomyticus. (hình 4, bảng 3).
(III)
(II)
(I)
(IV)
Hình 3. Biểu hiện của tôm sau khi gây nhiễm vi khuẩn gây AHPND.
(I) Tôm chết ở nghiệm thức sử dụng bột nếp để bao ngoài; (II) Tôm chết ở
nghiệm thức sử dụng dầu mực để bao ngoài; (III) Tôm chết ở nghiệm thức
đối chứng dương; (IV) Tôm ở ng hiệm thức đối chứng âm.
Kết quả kiểm tra tác nhân gây AHPND trên tôm bằng kỹ
thuật PCR cũng đã khẳng định, tôm chết sau khi công cường
độc vi khuẩn ở các nghiệm thức thí nghiệm là do nhiễm vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây AHPND (bảng 4).
Tôm chết ở các nghiệm thức sau khi công cường độc
vi khuẩn gây AHPND có các biểu hiện bệnh như gan tụy
chuyển màu trắng hoặc đỏ (mũi tên chỉ ở hình 3-III), vỏ
mềm (mũi tên chỉ ở hình 3-II), màu sắc nhợt nhạt và ruột
tôm không có thức ăn (mũi tên chỉ ở hình 3-I). Trong khi đó,
tôm ở lô đối chứng âm màu sắc tươi sáng, gan tụy đen, ruột
đầy thức ăn (hình 3-IV). Những biểu hiện của tôm sau gây
nhiễm này hoàn toàn giống với những biểu hiện của tôm bị
nhiễm AHPND đã được công bố [15].
Bảng 4. Kết quả kiểm tra AHPND bằng phương pháp PCR.
Tần xuất bắt gặp tôm nhiễm AHPND ở các nghiệm
thức thí nghiệm
Ngày thí
TT
nghiệm
Đối
chứng bao
Không
Bao ngoài
dầu gan
mực
Đối chứng
(-)
Bao ngoài
bột nếp
(+)
1/1
2/2
2/2
0/1
ngoài
1
2
3
4
11
12
15
21
KKT
KKT
KKT
0/5
1/1
2/2
2/2
0/1
1/1
2/2
2/2
0/1
1/1
2/2
2/2
0/1
KKT: không kiểm tra.
Các mẫu tôm chết thu được sau 1 ngày gây nhiễm (ngày
thứ 11 của thí nghiệm) đều cho kết quả dương tính vớiAHPND
(4/4 mẫu). Kết quả kiểm tra các mẫu tôm thu sau 2 và 5 ngày
gây nhiễm ở các nghiệm thức vẫn tiếp tục cho kết quả dương
tính vớiAHPND, tỷ lệ nhiễm đều là 100% ở các ngày thu mẫu
để kiểm tra.
Trước khi kết thúc thí nghiệm, tôm còn sống ở các
nghiệm thức được thu để kiểm tra AHPND, tất cả các
mẫu kiểm tra đều âm tính với AHPND. Điều đó cho thấy,
Hình 4. Khuẩn lạc và đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V.
parahaemolyticus tái phân lập lại từ tôm chết/yếu ở các nghiệm thức
thí nghiệm.
53
63(2) 2.2021
Khoa học Nông nghiệp
Vibrio parahermolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên
tôm nuôi”, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 14, tr.690-698.
gan tụy tôm còn sống trong thí nghiệm đã đào thải hết vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây nhiễm ban đầu (bảng 4).
[5] H. Kondo, et al. (2015), “Draft genome sequence of non-Vibrio
parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease strain
KC13.17.5, isolated from diseased shrimp in Vietnam”, Genome
Announc., 3(5), DOI:10.1128/genomeA.00978-15.
Kết luận
Ở các nồng độ 5, 10, 15 và 20 µl, sản phẩm tỏi lên men
không có hiệu quả diệt khuẩn cao. Ở nồng độ 25 và 30 µl, sản
phẩm tỏi lên men có độ nhạy cao đối với cả 2 chủng vi khuẩn
V. parahaemolyticus KC.13.14.2 và V. harveyi KC.13.17.5
gây AHPND.
[6] L.P. Rees, et al. (1993), “Aquantitative assessment of the
antimicrobial activity of garlic (Allium sativum)”, World J. Microbiol
Biotechnol., 9(3), pp.303-307.
[7] M.A. Adetumbi, B.H.S. Lai (1986), “Inhibition of in-vitro
germination and spherulation of Coccidioides immitis by Allium
sativum”, Curr. Microbiol., 13, pp.73-76.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, bổ sung tỏi lên men với
liều 15 ml/kg thức ăn/ngày vào thức ăn rồi bao ngoài bằng dầu
mực cho tôm ăn trong 10 ngày liên tục có khả năng nâng cao tỷ
lệ sống của tôm lên 53%, cao hơn nghiệm thức không sử dụng
chất bao ngoài (51%), bao ngoài bằng bột nếp (42%) và cao
hơn so với đối chứng dương tôm chỉ ăn thức ăn thường không
bổ sung sản phẩm tỏi lên men (14%). Tỷ lệ sống của tôm ở
các nghiệm thức bổ sung dịch tỏi lên men vào thức ăn so
với tỷ lệ sống của tôm ở nghiệm thức đối chứng không bổ
sung tỏi lên men vào thức ăn là có sự sai khác có ý nghĩa
thống kê.
[8] M. Corzo-Martinez, N. Corzo, M. Villamiel (2007),
“Biological properties of onions and garlic”, Trends in Food Science
& Technology, 18, pp.609-625.
[9] Nguyễn Thị Hạnh, Đặng Thị Lụa (2016), “Đánh giá khả năng
kháng khuẩn của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) đối với một số vi
khuẩn gây bệnh trên cá nuôi nước ngọt”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn, 22, tr.100-104.
[10] Clinical and Laboratory Standards Institure - CLSI
(2006), Performance standards for antimicrobial disk and dilution
susceptibility tests of bacteria isolate from aquatic animals.
Kết quả nghiên cứu mở ra tiềm năng ứng dụng sản phẩm
tỏi lên men để phòng trị AHPND cho tôm nuôi nước lợ.
[11] Nguyễn Anh Tuấn (2009), “Thử nghiệm một số loại thảo
dược trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn trên tôm thẻ chân trắng
(Penacus vannamei)”, Kỷ yếu hội nghị khoa học và công nghệ tuổi trẻ
các trường đại học và cao đẳng khối nông lâm ngư thủy toàn quốc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] L. Tran, et al. (2013), “Determination of the infectious nature
of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting
penaeid shrimp”, Disease of Aquatic Organisms, 105, pp.45-55.
[12] Nicky B. Buller (2004), Bacteria from Fish and Other Aquatic
Animals: A Practical Identification Manual, CABI Publishing.
[2] C.F. Lo, et al. (2014), “RecentAdvances in the newly emergent
acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND)”, Symposium on
Diseases in Asian Aquaculture (DAA9), p.72.
[14] Nguyễn Thị Hạnh, Đặng Thị Lụa (2016), “Đánh giá khả năng
diệt khuẩn của dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) đối với một số vi
khuẩn gây bệnh trên tôm”, Khoa học công nghệ trong phát triển nuôi
trồng thủy sản, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
[3] L.T. Kwai, E.H. Ung, S.W. Choo, S.M. Yew, W.Y. Wee,
K.P. Yap (2014), “An AP1, 2 &3 PCR Positive non - Vibrio
parahaemolitycus bacteria with AHPND histopathology”, Diseases in
Asian Aquaculture (DAA9), p.77.
[15] NACA (2012), Asia pacific emergency regional consultation
on the emerging shrimp disease: Early mortality syndrome (EMS)/
Acute hepatopancreatic necrosis syndrome (AHPNS).
[4] Đặng Thị Lụa, Nguyễn Viết Khuể, Phan Thị Vân (2016), “Non-
63(2) 2.2021
54
6 trang
10440
Free
Bạn đang xem tài liệu "Khả năng kháng khuẩn và phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) của tỏi (Allum sativum) lên men", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- kha_nang_khang_khuan_va_phong_benh_hoai_tu_gan_tuy_cap_o_tom.pdf
