Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử Metarhizium anisopliae
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI
CẤY BÁN RẮN LÊN SỰ HÌNH THÀNH BÀO TỬ
Metarhizium anisopliae
Ngành
: Công nghệ sinh học
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Người hướng dẫn : ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT
KS. NGUYỄN QUỐC LINH
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN DIỄM PHÚC
MSSV: 1211100159 Lớp: 12DSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng
dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Như Nhứt và KS. Nguyễn Quốc Linh. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kì hình
thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích,
nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ
trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu
của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội
dung đồ án của mình.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2016
Sinh viên thực tập
NGUYỄN DIỄM PHÚC
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được sự
quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc trang
bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội
được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập này. Tuy
thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ
ích cho công việc sau này.
Em xin chân thành biết ơn:
- Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học Công
Nghệ TP. HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã cho em
có cơ hội được đi thực tập.
- Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo
điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình.
- Em xin cảm ơn anh Nguyễn Quốc Linh đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn
thành đồ án này.
Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của:
- Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh
Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi điều
kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn
này.
Sinh viên thực tập
NGUYỄN DIỄM PHÚC
Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỤC LỤC .....................................................................................................................i
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... v
DANH MỤC BIỂU ĐỒ................................................................................... vi
MỞ ĐẦU........................................................................................................ 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................2
3. Mục đích nghiên cứu.......................................................................................4
4. Nhiệm vụ nghiên cứu......................................................................................4
5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................5
6. Các kết quả đạt được của đề tài ......................................................................5
7. Kết cấu của ĐATN..........................................................................................5
1.1. Sơ lược về Metarhizium anisopliae.............................................................6
1.1.1. Phân loại.................................................................................................6
1.1.2. Phân bố...................................................................................................6
1.1.3. Đặc điểm hình thái.................................................................................7
1.1.4. Đặc điểm sinh học .................................................................................9
trường ............................................................................................................20
1.1.7. Phổ ký chủ của nấm Metarhizium anisopliae......................................20
2.1.1. Địa điểm...............................................................................................22
2.1.2. Thời gian..............................................................................................22
i
Đồ án tốt nghiệp
2.2. Vật liệu thí nghiệm.....................................................................................22
2.3. Máy móc, thiết bị .......................................................................................22
2.4. Môi trường nuôi cấy...................................................................................22
2.5. Phương pháp...............................................................................................24
2.5.1. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................24
2.5.2. Bố trí thí nghiệm..................................................................................27
tử của các chủng nấm M4....................................................................................33
chủng nấm M4.....................................................................................................37
hợp .......................................................................................................................38
PHỤ LỤC
ii
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CAM
CDA
: Complete Media.
: Czapek – Dox.
M. anisopliae
M1
: Metarhizium anisopliae.
: chủng nấm M1.
M2
: chủng nấm M2.
M3
: chủng nấm M3.
M4
: chủng nấm M4.
NT
: nghiệm thức.
NSGN
PGA
: ngày sau gây nhiễm.
: Potato Glucose Agar.
: trách nhiệm hữu hạn.
: Sabouraud dextrose Yeast.
: Sabouraud dextrose Yeast có thêm khoáng chất.
TNHH
SDAY1
SDAY3
iii
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các chủng Metarhizium anisopliae dùng trong nghiên cứu...................22
Bảng 2.2. Thành phần môi trường dùng trong thử nghiệm khảo sát môi
trường nuôi cấy Metarhizium anisopliae...................................................................23
Bảng 2.3. Thành phần khoáng chất dùng trong thử nghiệm khảo sát môi
trường nuôi cấy Metarhizium anisopliae...................................................................24
Bảng 3.1. Hoạt lực (%) diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm
M. anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm.......................................................31
Bảng 3.2. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 tạo thành trên các môi trường
nuôi cấy.......................................................................................................................34
Bảng 3.3. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 trên các môi trường khoáng
khác nhau…................................................................................................................36
Bảng 3.4. Mật độ bào tử của chủng nấm M4 tạo thành ở các mốc thời gian
nuôi cấy khác nhau.....................................................................................................37
Bảng 3.5. Hoạt lực diệt sâu ăn tạp của chủng nấm M4 ở các mốc thời gian
với các nồng độ 106, 107, 108 bào tử/ml.....................................................................38
iv
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Côn trùng, sâu hại bị nấm Metarhizium anisopliae kí sinh ......................6
Hình 1.2. Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae............................................................7
Hình 1.3. Đặc điểm hình thái Metarhizium anisopliae .............................................8
Hình 1.4. Hai dạng bào tử của nấm Metarhizium anisopliae.............................8
Hình 1.5. Cơ chế xâm nhiễm của nấm lên côn trùng bướm....................................17
Hình 1.6. Tiến trình lây nhiễm của nấm lên côn trùng............................................18
Hình 3.1. Sâu ăn tạp sau khi gây nhiễm với chủng nấm M4...................................33
v
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của các chủng nấm
M. anisopliae ở 8 NSGN............................................................................................32
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự hình thành bào tử
của chủng nấm M4 .....................................................................................................34
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của các dung dịch khoáng lên sự hình thành bào tử
của chủng nấm M4 .....................................................................................................36
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của
chủng nấm M4............................................................................................................37
vi
Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
- Đặt vấn đề
Hiện nay, việc nông dân sử dụng không hợp lý, lạm dụng thuốc bảo vệ thực
tiếp đến môi trường và sức khỏe con người. Có thể kể đến như: gây ô nhiễm môi
trường, làm nguồn nước, đất đai bị nhiễm độc ảnh hưởng đến sức khỏe con người
và cây trồng, nông sản bị nhiễm độc không tiêu thụ được, gây độc cho những sinh
vật có ích, tạo ra những loài sâu, bệnh, cỏ dại, chuột hại mang tính kháng thuốc
cao...
Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng Metarhizium
anisopliae của các nước trên thế giới như: Philippin nghiên cứu sử dụng nấm M.
anisopliae để trừ rầy nâu hại lúa (Rombach A.C., và cộng sự 1986), Úc nghiên cứu
để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% ( Milner, 1991), Nhật Bản sử dụng
nấm xanh để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu quả trên 70% sau 10 ngày (1988),
Malaysia nghiên cứu để phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày.
Ở trong nước, M. anisopliae được nghiên cứu trong phòng trừ mối (Nguyễn
Dương Khuê, 2005), trừ sâu, rầy nâu hại cây công nghiệp, cây lâm nghiệp và cây
lúa (Phạm Thị Thùy và cộng sự, 2000-2004; Nguyễn Thị Lộc và cộng sự, 2002) và
đã được áp dụng sản xuất ở hộ nông dân nhưng quy mô còn nhỏ, thời gian nuôi cấy
còn dài, chất lượng chưa ổn định. Vì vậy, đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của các
điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử Metarhizium anisopliae”
được thực hiện nhằm góp phần hoàn thiện hơn nữa qui trình tạo chế phẩm sinh học
phục vụ cho nông nghiệp.
-
Ý nghĩa của đề tài
• Ý nghĩa khoa học
Đánh giá tiềm năng ứng dụng của những chủng M. anisopliae được nghiên
cứu.
1
Đồ án tốt nghiệp
Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào
tử của các chủng M. anisopliae.
• Ý nghĩa thực tiễn
Góp phần hoàn thiện qui trình tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp
từ M. anisopliae.
2. Tình hình nghiên cứu
- Trên thế giới
Năm 1878, nhà Bác học người Nga Metschnhikov trong khi nghiên cứu bệnh
của bọ cứng hại lúa mì để tìm phương pháp phòng trừ đã phát hiện nấm
Entomophthora anisopliae, nay đổi tên là M. anisopliae.
Năm 1880 đến 1886, Metschnhikov cùng học trò của mình là Isac Craxinstic
đã nghiên cứu hàng loạt môi trường nuôi cấy nấm M. anisopliae và đã sản xuất thử
hàng nghìn kilogram nấm để tách bào tử thuần khiết. Sau đó, dùng bào tử nấm trộn
với đất mịn và đem bón ra đồng ruộng. Theo các tác giả thì sau 10 - 14 ngày thí
nghiệm cả sâu non và trưởng thành của bọ đầu dài hại củ cải đường chết với tỷ lệ 55
- 80%.
Năm 1968, Theo báo cáo của Veen thì M. anisopliae ký sinh trên 200 loài côn
trùng khác nhau.
Năm 1984, Albonoz và Parada nghiên cứu khả năng phòng trừ Sogatodes
oryzickola (Muir) của M. anisopliae. Kết quả cho thấy, tỷ lệ chết đạt 100 ở nồng độ
109 bào tử/ml và tỷ lệ chết chỉ đạt 50% ở nồng độ 107 bào tử/ml.
Năm 1987, tại Malaysia, nấm xanh M. anisopliae đã được nghiên cứu để
phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,75% sau 14 ngày. Tại Philippines, đã nghiên cứu
sử dụng nấm xanh để diệt rầy nâu hại lúa đạt hiệu lực 60% sau 10 ngày.
Năm 1991, ở Úc Milner đã nghiên cứu nấm M. anisopliae để phòng trừ bọ
hung hại mía đạt hiệu quả 68%.
Năm 2004, V. Rachappa và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của gạo, bo bo,
bắp, lúa mì, lúa mạch… lên sự phát triển của chủng nấm M. anisopliae và kết quả
cho thấy gạo là cơ chất tốt nhất cho mật độ bào tử đạt 4,03 x 109 bào tử/g.
2
Đồ án tốt nghiệp
Năm 2008, Rajesh Anand và cộng sự đã nghiên cứu hoạt lực diệt sâu ăn tạp
(Spodoptera litura) của 3 chủng nấm M. anisopliae, L. muscar và C. Cardinalis.
Kết quả cho thấy, chủng M. anisopliae cho hoạt lực diệt sâu cao hơn hai chủng còn
lại.
Năm 2014, Raúl Daniel Kruger và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất bào tử trên
các môi trường bán rắn như gạo trắng, gạo luộc, tấm, gạo thóc, gạo lức, vỏ trấu và
lúa mì. Kết quả cho thấy, tấm cho hiệu quả hình thành bào tử cao nhất.
Năm 2015, LiGao đã nghiên cứu các phương pháp để tối ưu hóa các điều kiện
nuôi cấy thu sinh khối và bào tử Metarhizium anisopliae đối với 2 chủng
Metarhizium SQZ-1-21 và M. anisopliae RS-4-1. Kết quả cho thấy, chủng
Metarhizium SQZ-1-21 đạt 2,53 x 105 bào tử/ml và chủng M. anisopliae RS-4-1 đạt
2,25 x 105 bào tử/ml trong 4 ngày nuôi cấy. Trong đó, Metarhizium SQZ-1-21 được
nuôi theo các điều kiện môi trường riêng biệt: -1,2 MPa, độ pH9, 12 giờ sáng, 29oC
và -1,2 MPa, pH 9, ánh sáng 0 h, 29oC và M. anisopliae RS-4-1 được nuôi theo các
điều kiện: -0,3 MPa, pH 8, ánh sáng 24 h, 29oC và -3,9 MPa, pH 5, ánh sáng 12 h,
26oC.
- Ở Việt Nam
Năm 1981, GS.TS Nguyễn Lân Dũng mô tả hình thái, phân tích cơ chế tác
dụng, hướng dẫn cách phân lập, nuôi cấy và phương pháp sản xuất sinh khối
Metarhizium.
Năm 1992, Phạm Thị Thùy và cộng sự thuộc Viện Bảo vệ thực vật đã phân
lập, nuôi cấy và thử nghiệm các chủng Metarhizium thuộc hai loài M. anisopliae và
M. flavoviride để phòng trừ các loài sâu hại cây nông, lâm nghiệp bằng phương
pháp phun trực tiếp bào tử Metarhizium trên đồng ruộng.
Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh đã phân lập, nuôi cấy một số chủng M. anisopliae
và thử nghiệm để diệt châu chấu di cư và các loài sâu bệnh hại cây nông nghiệp.
Năm 1998, Dương Ngọc Khuê và các cộng sự thuộc viện Khoa học lâm
nghiệp đã nghiên cứu và tuyển chọn các chủng nấm Metarhizium để thử khả năng
diệt mối Coptotemes fomosanus trong phòng thí nghiệm. Các nghiên cứu đã đưa ra
3
Đồ án tốt nghiệp
các chế phẩm LT50, LT100, LD50, LD100 của các chủng Metarhizium được tuyển
chọn với Coptotemes fomosanus và cho biết ba chủng có hiệu lực diệt mối tốt.
Năm 2000, lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thùy đã sử dụng nấm M.
anisopliae để trừ bọ dừa. Kết quả ban đầu cho thấy, nấm M. anisopliae có hiệu quả
đối với bọ dừa ở Bến Tre trong phòng thí nghiệm, trong nhà lưới và ngoài đồng.
Năm 2009, Lê Hữu Phước đã phân lập và nghiên cứu môi trường nhân sinh
khối 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok (Ma),
Beauveria Basiana (Bals.) Vuill (Bb) và Paecilomyces spp. (Pae) trên nhóm rau ăn
lá ở đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả cho thấy, môi trường SDAY3 là môi
trường cho mật độ bào tử (bào tử/ml) cao nhất trong 4 loại môi trường lỏng CDA,
CAM, SDAY1 và SDAY3.
3. Mục đích nghiên cứu
- Xác định chủng nấm M. anisopliae có hoạt lực diệt sâu cao trong số các
chủng được nghiên cứu.
- Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn chủng nấm M. anisopliae đã
chọn.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Khảo sát hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) của 4 chủng nấm M.
anisopliae trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào
tử của chủng nấm M. anisopliae.
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy
bán rắn lên sự hình thành bào tử của chủng nấm M. anisopliae.
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử của các
chủng M. anisopliae.
- Khảo sát lại hoạt tính của các chủng M. anisopliae được tăng sinh trong các
điều kiện nuôi cấy đã chọn và chọn ra nồng độ xử lý thích hợp.
4
Đồ án tốt nghiệp
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp cấy chuyền và giữ giống.
- Phương pháp nuôi cấy bán rắn M. anisopliae.
- Phương pháp xác định độ ẩm.
- Phương pháp đếm mật độ bào tử bằng buồng đếm hồng cầu.
- Phương pháp thu thập sâu ăn tạp.
- Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học.
- Phương pháp xử lý số liệu: xử lý bằng phần mềm SPSS (Statistical Package
for the Social Sciences).
6. Các kết quả đạt được của đề tài
- Tìm được chủng M. anisopliae có hiệu lực diệt sâu cao trong số các chủng
nghiên cứu.
- Tìm được môi trường bán rắn và một số điều kiện tăng sinh thu nhận bào tử
thích hợp cho M. anisopliae.
7. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp
Gồm có 4 chương
- Chương 1: Tổng quan tài liệu (Sơ lược về M. anisopliae).
- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Thời gian, địa điểm, vật
liệu thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu).
- Chương 3: Kết quả và thảo luận (kết quả đạt được của 5 thí nghiệm và nhận
xét).
- Chương 4: Kết luận và kiến nghị (kết luận và đề xuất nghiên cứu).
5
Đồ án tốt nghiệp
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Sơ lược về Metarhizium anisopliae
1.1.1. Phân loại
Xếp theo hệ thống phân loại nấm của G. C. Anisworth (1971), nấm
Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống
Metarhizium. Một số tác giả khác lại cho rằng, nấm M. anisopliae thuộc ngành phụ
nấm túi Ascomycotina và giống Metarhizium [12].
Theo Sorokin (1883) thì nấm xanh được phân loại như sau: [9]
Ngành (Phylum)
Lớp (Class)
Bộ (Order)
Họ (Family)
Chi (Genus)
Loài (Species)
1.1.2. Phân bố
: Metarhizium anisopliae
Nấm M. anisopliae được tìm thấy trên khắp các châu lục, ký sinh trên 50 họ
gồm khoảng 200 loài côn trùng như rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và rất nhiều loài sâu
hại khác. Sau khi xâm nhiễm, chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn
màu xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng [12].
1
2
Hình 1.1. Côn trùng, sâu hại bị nấm Metarhizium anisopliae kí sinh.
“Nguồn: hình 1_Lê Hữu Phước (2010), hình 2_Phan Công Nhật (2011)” [7],[11].
6
Đồ án tốt nghiệp
Nấm M. anisopliae là nấm hại côn trùng, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có
thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất. Người ta còn
phân lập được M. anisopliae trong điều kiện thời tiết rất đặc biệt như: ở những nơi
có nhiệt độ -2oC, trên những khu đất ở rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất
thải hữu cơ hoặc trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây
đước, hoặc trong tổ của một số loài chim và cả trong rễ của cây dâu tây cũng có thể
phân lập được nấm M. anisopliae [8].
1.1.3. Đặc điểm hình thái
1
2
3
Hình 1.2. Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae.
“Nguồn: hình 1 và 2_Phan Công Nhật (2011), hình 3_Phan Trọng Nhật (2009)”
[9],[10].
Nấm M. anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường kính
3 – 4 µm, cuống sinh bào tử bện chặt, mỗi cuống sinh bào tử riêng rẻ phân nhánh
nhiều lần, tế bào sinh bào tử có đỉnh tròn. Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng
có màu từ trắng đến xanh, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm
dày đặc. Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến
ôliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy
bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục.
Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 µm, dài
khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt
mỡ [14].
7
Đồ án tốt nghiệp
1
2
Hình 1.3. Đặc điểm vi thể của Metarhizium anisopliae.
[10],[16].
Hình 1.4. Hai dạng bào tử của nấm Metarhizium anisopliae.
a. Dạng bào tử hình ovale
b. Dạng bào tử hình trụ
“Nguồn: Huỳnh Hữu Đức (2010)” [3].
Nấm M. anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, hình thành theo dạng
chuỗi, khuẩn lạc có màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế. Loài
M. anisopliae có 2 dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ M. anisopliae var.
major có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn là M.
anisopliae var. major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 µm [8].
8
Đồ án tốt nghiệp
Chúng phát triển nhanh trên môi trường Czapek - Dox khi nuôi ở nhiệt độ
28oC sau 8 - 10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc có đường kính 7 - 8,5 cm [13].
1.1.4. Đặc điểm sinh học
1.1.4.1. Khả năng sử dụng cơ chất
Các loại vi nấm kí sinh côn trùng thường không đòi hỏi khắc khe đối với một
loại thức ăn carbon nhất định. Chúng có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác
nhau, nhưng cũng có loại hợp chất này được đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác.
Có rất nhiều trường hợp ở trong môi trường nuôi cấy có mặt vài nguồn carbon khác
nhau, nấm sẽ phát triển mạnh hơn khi chỉ có riêng từng loài. Các công trình nghiên
cứu của Hegendus và cộng sự (2010) đã xác định môi trường tốt nhất để phân lập
nấm M. anisopliae là môi trường có chứa chitin làm nguồn carbon [13].
Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau, nấm thường có những nhu cầu
về các nguồn carbon khác nhau. Theo Hegendus và cộng sự (2010) cho biết M.
anisopliae khi được nuôi cấy chìm có bổ sung chitin hoặc hexosamine và glucose
thì thu được lượng bào tử cao nhất. Nhờ khả năng đồng hóa nguồn carbon phức tạp
này mà M. anisopliae được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu thông qua
cơ chế diệt côn trùng và khẳng định quá trình xâm nhập của nấm vào cơ thể côn
trùng trước hết là phân hủy lớp vỏ chitin ở lớp ngoài da. Tiếp theo là phân hủy
protein ở các mô, đồng thời với protein là sự phá hủy lipid. Quá trình này được thực
hiện chính là nhờ vai trò của phức hệ enzyme ngoại bào của nấm kí sinh sâu hại cây
trồng [8].
Khi nuôi các chủng nấm M. anisopliae trên môi trường có nguồn carbon khác
nhau người ta thấy chúng đồng hóa tốt các loại đường glucose, maltose, sacharose,
nhưng lại đồng hóa đường rafinose yếu [8].
Mối quan hệ giữa nguồn thức ăn carbon với sự hình thành và phát triển của
bào tử nấm M. anisopliae đã được tác giả Jenking và Prior (1993) xác định. Các tác
giả cho biết tỷ lệ thích hợp giàu sacharose và peptone trong dịch nuôi cấy nấm M.
anisopliae có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hình thành bào tử nấm [13].
9
Đồ án tốt nghiệp
Thành phần chitin trong môi trường nuôi cấy rất cần thiết đối với các chủng vi
nấm ký sinh côn trùng vì chất chitin đã giúp cho sự sinh trưởng, phát triển và hình
thành bào tử đính cũng như bào tử chồi của nấm [13].
Tuy nhiên, không phải tất cả nguồn thức ăn carbon nào cũng đều hỗ trợ cho sự
sinh trưởng và phát triển cũng như sự nảy mầm và hình thành bào tử của nấm.
Nghiên cứu về hiệu quả của nguồn carbon, nitơ và vitamin đối với nấm M.
anisopliae được phân lập từ sâu Inoplus ruoricus, người ta nhận thấy quá trình nảy
mầm, sinh trưởng và hình thành bào tử nấm M. anisopliae đã sử dụng cả nguồn
nitrat và nitơ amôn. Trong nguồn nitơ đã thử, chỉ có cystein là ức chế cả sự sinh
trưởng và sự hình thành bào tử nấm. Những vitamin đã thử cũng không làm tăng sự
sinh trưởng và sự hình thành bào tử của nấm M. anisopliae [8].
Ngoài việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ, nấm còn có thể sử dụng tốt những
nguồn nitơ hữu cơ như protein, peptone và các axit amin. Axit glutamic là một
trong những axit amin thích hợp hơn cả cho sự phát triển của nấm M. anisopliae.
Nguồn thức ăn nitơ là protein từ cơ thể côn trùng là nền cơ chất giàu dinh dưỡng
nhất cho nấm gây bệnh côn trùng sinh trưởng và phát triển [8].
Theo nghiên cứu của V. Rachappa và cộng sự (2005), thì M. anisopliae có khả
năng sử dụng hiệu quả các cơ chất như gạo, bo bo, bắp, lúa mì, lúa mạch [18].
Raúl Daniel Kruger và cộng sự (2014), đã nghiên cứu sản xuất bào tử trên các
môi trường bán rắn như gạo trắng, cơm, tấm, gạo thóc, gạo lức, vỏ trấu và lúa mì.
Kết quả cho thấy tấm là môi trường thích hợp nhất để sản xuất bào tử M. anisopliae
[20].
1.1.4.2. Nhu cầu về các chất kích thích sự sinh trưởng
Vi nấm có mối quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất kích
thích sinh trưởng. Ngoài tác dụng kích thích nảy mầm của bào tử và sự tăng trưởng
của hệ sợi nấm, cũng có loại vitamin kìm hãm hoặc hạn chế sự sinh trưởng của
nấm. Trường hợp bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy người ta thấy có sự ức
chế khoảng 30- 40% quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm. Các chủng nấm
M. anisopliae, nếu bổ sung thêm chitin tự nhiên của châu chấu vào môi trường nuôi
10
Đồ án tốt nghiệp
cấy sẽ làm tăng khả năng sinh bào tử (Li và Holdom, 2002). Các nguyên tố vi lượng
có tác dụng kích thích sự phát triển của vi nấm, ví dụ nếu loại ra khỏi môi trường
nguyên tố vi lượng Mo, người ta nhận thấy hàm lượng nitratreductaza trong tế bào
vi nấm cũng giảm đi chín lần [8].
1.1.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của M. anisopliae
- Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy
Nấm côn trùng có thể được nuôi cấy chìm hoặc xốp . Tuy nhiên, phương pháp
nuôi cấy chìm thường tạo bào tử ở dạng bào tử chồi, dễ mất hoạt tính vì có cấu trúc
không bền vững và thời gian sống ngắn. Vì vậy, hiện nay phương pháp nuôi cấyxốp
được áp dụng rộng rãi để tạo chế phẩm nấm côn trùng. Phương pháp nuôi cấy xốp
sẽ tạo ra chế phẩm ở dạng đính bào tử ổn định và bền vững hơn dạng bào tử chồi
[4].
Theo các tác giả Rombach (1986), Hegedus và cộng sự (2010), Jenkins và
Prior (1993), thì sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất nấm sẽ thu được
kết quả tốt. Vì trong nuôi cấy chìm, người ta đã xác định được khả năng sinh bào tử
chồi và lượng sinh khối Metarhizium anisopliae là rất cao. Bằng phương pháp nuôi
cấy chìm (tại Trung Quốc), Li và cộng sự (1996) đã thí nghiệm tách chiết theo
phương pháp bản mỏng và xác định được độc tố của nấm Metarhizium anisopliae là
Destruxin A, B, C và D [3].
- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển, khả
năng tiết độc tố của nấm, nếu môi trường không phù hợp, nấm mọc yếu hay không
mọc và giảm độc tố. Nấm M. anisopliae có thể phát triển trên môi trường không có
chitin. Nhưng theo Phạm Thị Thùy (2010), môi trường thích hợp nhất cho nấm phát
triển là môi trường có chitin làm nguồn carbon. Nếu bổ sung thêm chitin và glucose
trong quá trình nuôi cấy, nấm M. anisopliae hình thành lượng bào tử cao vì chitin sẽ
giúp hình thành và phát triển bào tử đính và bào tử trần. Quá trình hình thành bào tử
đính được kích thích bởi một số axit amin đặc biệt là lysine, alanine, axit glutamic.
11
Tải về để xem bản đầy đủ
72 trang
18780
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy bán rắn lên sự hình thành bào tử Metarhizium anisopliae", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- do_an_khao_sat_anh_huong_cua_cac_dieu_kien_nuoi_cay_ban_ran.pdf
