Đánh giá khả năng gây chết tế bào theo chương trình của chủng virus vaccine sởi trên tế bào ung thư buồng trứng

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT TẾ BÀO

THEO CHƯƠNG TRÌNH CỦA CHỦNG VIRUS VACCINE SỞI

TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ BUỒNG TRỨNG

Ngô Thu Hằng¹, Hoàng Văn Tổng^1,2, Đặng Thành Chung¹, Hồ Anh Sơn^1,2

Từ Quang⁴, Bùi Khắc Cường^1,3, Nguyễn Lĩnh Toàn^1*

TÓM TẮT

Mục tiêu: Đánh giá khả năng gây chết tế bào theo chương trình của chủng virus vaccine sởi

(Measles vaccine - MeV) trên dòng tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR3). Đối tượng và

phương pháp: Tế bào OVCAR3 được lây nhiễm chủng MeV ở thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 96

giờ, sau đó được phân tích dòng chảy tế bào (flow cytometry) trên hệ thống FACS Lyric để xác

định tỷ lệ tế bào chết theo chương trình. Kết quả: Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình ở các

nhóm nhiễm MeV ở tất cả các nồng độ pha loãng (MOI từ 1 - 1/4) đều cao hơn có nghĩa thống

kê so với nhóm chứng (p < 0,001). Kết luận: Chủng MeV gây chết tế bào OVCAR3 theo

chương trình in vitro.

* Từ khóa: Ung thư buồng trứng; Virus vaccine sởi, Sự chết tế bào; FACS Lyric.

Evaluating the Apoptosis of Ovarian Cancer Cells Induced by

Vaccine Strain of Measles Virus

Summary

Objectives: To evaluate the capability of apoptotic induction of measles virus vaccine (MeV)

strain on ovarian cancer cells (OVCAR3). Materials and methods: OVCAR3 cells were

infected with the vaccine strain of MeV virus at 24, 48, and 96 hours and were analyzed by flow

cytometry on the FACS Lyric system to evaluate the apoptosis. Results: The proportion of

apoptotic cell death in the groups treated with MeV virus at all diluted concentrations (MOI from

1 to 1/4) was significantly higher compared to the control group (p < 0.001). Conclusion:

Vaccine strain of Measles virus induces apoptosis of ovarian cancer cell line OVCAR3.

* Keywords: Ovarian cancer squamous-cell carcinoma; Measles virus; Apoptosis; FACS Lyric.

ĐẶT VẤN ĐỀ

giới có khoảng > 18 triệu trường hợp mắc

mới và 9,6 triệu người chết vì ung th ư.

Trong số các ca ung thư m ắc mới,

Theo thống kê của chương trình

GLOBOCAN 2018, mỗi năm trên toàn thế

¹Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y

²Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y

³Trung tâm Nghiên cứu Động vật thực nghiệm, Học viện Quân y

⁴Bộ môn - Khoa Tai Mũi Họng, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y

Tác giả phản hồi: Nguyễn Lĩnh Toàn ([email protected])

Ngày nhận bài: 20/4/2021

Ngày bài báo được đăng: 02/6/2021

32

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

ung thư buồng trứng chiếm 1,6%

(295.414 ca) và tỷ lệ tử vong chiếm 1,9%

(184.799 ca) tổng số các ca tử vong do

ung thư [1]. Mặc dù đã có các biện pháp

điều trị tích cực như phẫu thuật, sau đó là

kết hợp hóa chất, nhưng phần lớn bệnh

nhân đều tái phát bệnh. Ung thư buồng

trứng đáp ứng khá tốt với hóa chất, song

tỷ lệ kháng lại các hóa chất này khá cao

khi bệnh tái phát. Các loại hóa chất khác

được điều trị thay thế, kể c ả s ử d ụng

thuốc điều trị đích (bevacizumab), nhưng

thời gian sống trung bình của nhóm bệnh

nhân này thường không quá 12 tháng.

Các hướng điều trị mới hiệu quả hơn cần

được áp dụng để nâng cao hiệu quả điều

trị ung thư buồng trứng.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng

- Tế bào ung thư biểu mô buồng trứng

người OVCAR3 (ATCC® HTB-161™)

(công ty ATCC, Mỹ) được bảo quản tại

Labo Nghiên cứu ung thư, Bộ môn Sinh

lý bệnh, Học viện Quân y.

- Chủng MeV: Là sản phẩm của Đề tài

KC.10.27/16-20, được bảo quản và duy

trì tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu ung thư,

Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y.

2. Phương pháp nghiên cứu

* Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang

và nghiên cứu thực nghiệm.

* Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:

Trị liệu bằng virus ly gi ải tế bào ung

thư (Oncolytic virus - OLV) dựa trên cơ

chế các OLV có khả năng xâm nhập đặc

hiệu vào tế bào ung thư của khối u, nhân

lên, giải phóng và gây ly giải tế bào ung

thư; kích thích tế bào ung thư chết theo

chương trình; kích thích đáp ứng miễn

dịch chống ung thư [2]. Nhiều nghiên cứu

cho thấy MeV là một OLV an toàn, có khả

năng phân giải tế bào ung thư in vitro,

in vivo và đang tiến hành các thử nghiệm

lâm sàng trên người [3].

- Kỹ thuật nuôi cấy các dòng tế bào

ung thư: Tế bào OVCAR3 được nuôi cấy

trên chai nuôi cấy tế bào có bổ sung 10%

FBS, 1% penicillin và streptomycin, nhiệt

độ 37^oC, CO₂5%. Thu tế bào OVCAR3

bằng trypsin EDTA, sau đó ly tâm để loại

bỏ môi trường thu tế bào.

- Phương pháp Flow cytometry đánh

giá tỷ l ệ t ế bào chết theo chương trình:

Để kiểm tra tỷ lệ tế bào chết theo chương

trình, chúng tôi sử d ụng kháng thể anti-

annexin V gắn chất phát huỳnh quang là

fluorescein isothiocyanate (FITC) và chất

nhuộm nhân tế bào phát huỳnh quang là

7-Amino Actinomycin D (7-AAD).

Trên thế giới đã có một số thử nghiệm

đánh giá tác dụng kháng ung thư buồng

trứng của MeV cho kết quả khả quan [3,

4, 5, 6]. Tuy nhiên, ở Việt Nam ch ưa có

nghiên cứu nào đánh giá tác dụng gây

chết tế bào ung thư buồng trứng theo

chương trình của MeV. Do đó, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm:

Đánh giá khả năng gây chết tế bào ung

thư buồng trứng (OVCAR3) theo chương

trình của MeV bằng phương pháp Flow

cytometry trên hệ thống Facs Lyric.

* Quy trình chuẩn bị mẫu tế bào OVCAR3

nhiễm MeV và chạy flow cytometry:

- Tế bào OVCAR3 được nuôi cấy, tăng

sinh, thu hoạch theo quy trình.

- Chuẩn độ để được dung dịch tế bào

có nồng độ 10⁵tế bào/ml. Cho các phiến

6 giếng đã gieo tế bào OVCAR3 vào tủ

ấm 37⁰C, 5% CO₂.

33

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

- Sau 24 giờ, kiểm tra phiến 6 giếng

nuôi cấy tế bào OVCAR3 dưới kính hiển

vi, kết quả tế bào bám đáy tốt. Thay môi

trường nuôi cấy với từng nhóm như sau:

- Đánh giá tỷ lệ tế bào chết theo chương

trình trên hệ thống FACS Lyric (BD).

* Chỉ tiêu đánh giá:

- Tỷ lệ tế bào chết, chết theo chương

trình, chết theo chương trình giai đoạn

sớm ở các nhóm được nhiễm virus MeV

so với nhóm chứng không điều trị, các

nhóm nhiễm MeV ở các nồng độ khác nhau.

+ Nhóm chứng: 3 ml môi tr ường nuôi

cấy mới.

+ Nhóm nhiễm MeV: Môi trường nuôi

cấy có bổ sung MeV liều MOI = 1, 1/2, 1/4.

- Tiến hành thí nghiệm tại Labo Sinh

học phân tử, Bộ môn Sinh lý bệnh, Học

viện Quân y.

Cho các phiến 6 giếng đã nhiễm virus

vào tủ ấm 37⁰C, 5% CO₂, kiểm tra tế bào

hằng ngày. Mỗi nhóm được lặp lại 3 giếng.

* Xử lý th ống kê: Xử lý s ố liệu bằng

phần mềm SPSS 20.0 và GraphPad

Prism 6. So sánh trung bình của 2 nhóm

độc lập bằng T-test, so sánh trung bình

của 3 nhóm bằng phân tích phương sai

ANOVA. Khác biệt có ý nghĩa thống kê

khi p < 0,05.

- Tại thời điểm sau nhiễm MeV 24 giờ,

48 giờ và 96 gi ờ, tiến hành các bước thu

tế bào OVCAR3 ở các nhóm. Tế bào

được xử lý và nhuộm theo quy trình

của bộ kít Fluorescein isothiocyanate,

Annexin V Apoptosis Detection kit (BD).

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Tỷ lệ tế bào chết ở các nhóm nghiên cứu

24 giờ

48 giờ

96 giờ

Biểu đồ 1: Tỷ lệ tế bào chết ở các nhóm nghiên cứu.

34

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

Tỷ lệ tế bào chết ở nhóm chứng thấp hơn ở 3 nhóm nhiễm MeV ở cả 3 thời điểm.

Tỷ lệ tế bào chết ở nhóm nhiễm MeV n ồng độ MOI = 1 và 1/2 cao hơn có ý ngh ĩa

thống kê so với nhóm chứng (p < 0,001) ở thời điểm 24 giờ và 96 giờ. Tại thời điểm 48

giờ, tỷ lệ tế bào chết ở nhóm nhiễm MeV ở cả 3 nồng độ MOI = 1, 1/2 và 1/4 cao hơn

có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,01).

Nồng độ MeV càng cao, tỷ lệ tế bào chết càng cao, sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê với p < 0,0001 ở thời điểm 24 giờ và p < 0,01 ở thời điểm 96 giờ.

2. Tỷ lệ tế bào OVCAR3 chết theo chương trình sau nhiễm MeV

24 giờ

48 giờ

96 giờ

Biểu đồ 2: Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình ở các nhóm nghiên cứu.

Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình ở tất cả các nhóm nhiễm MeV đều cao hơn

nhóm chứng. Ở thời điểm 24 giờ và 96 gi ờ, sự khác biệt có ý ngh ĩa thống kê giữa

nhóm nhiễm MeV nồng độ 1 MOI và 1/2 MOI so v ới nhóm chứng (p < 0,001). Tại thời

điểm 48 giờ, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa cả 3 nhóm nồng độ MeV với nhóm

chứng (p < 0,01).

35

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

Control

MeV (MOI=1/4)

MeV (MOI=1/2)

MeV (MOI=1)

82,4%

Q1

22,4%

Q1

32,9%

Q1

67,4%

Q1

Q2

24 giờ

Q3

Q4

1,73%

54,5%

Q1

97,1%

Q1

86,4%

Q1

Q2

Q1

Q2

48 giờ

Q3

Q4

0,83%

9,19%

Q1

88,3%

Q1

58,8%

Q1

Q2

Q1

96 giờ

Q3

Q4

7-Amino Actinomycin D

Biểu đồ 3: Kết quả chạy flow cytometry tế bào OVCAR3 ở thời điểm

24 giờ, 48 giờ và 96 giờ sau nhiễm MeV.

Q1: Vùng tế bào chết theo chương trình giai đoạn sớm

Q2: Vùng tế bào chết theo chương trình giai đoạn muộn

Q3: Vùng tế bào hoại tử

Q4: Vùng tế bào sống

Tại 3 thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 96 giờ đều cho kết quả: Nồng độ MeV càng cao, tỷ

lệ tế bào chết theo chương trình càng cao, sự khác biệt có ý ngh ĩa thống kê với p <

0,0001 ở thời điểm 24 giờ giữa nhóm 1 MOI và 1/4 MOI và p = 0,003 ở thời điểm 48

giờ giữa cả 3 nhóm nồng độ. Sự khác biệt tại thời điểm 96 giờ không có ý nghĩa thống

kê (p > 0,05).

3. Tỷ l ệ t ế bào OVCAR3 chết theo chương trình sớm ở các thời điểm sau

nhiễm MeV

Kết quả chạy Flow cytometry ở 3 thời điểm ở cho thấy: Tỷ l ệ t ế bào chết theo

chương trình sớm ở tất cả các nhóm nhiễm MeV đều cao hơn nhóm chứng (biểu đồ 3,

biểu đồ 4). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (thời điểm 24 giờ: p_{MeV 1 MOI-control}< 0,0001,

p

_{MeV 1/2 MOI-control}< 0,0001; thời điểm 48 giờ: p_{MeV 1 MOI-control}= 0,001, p_{MeV 1/2 MOI-control}= 0,005,

_{MeV 1/4 MOI-control}= 0,008; thời điểm 96 giờ: p_{MeV 1 MOI-control}< 0,0001, p_{MeV 1/2 MOI-control}= 0,002).

p

36

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021

Ở nhóm chứng, tỷ lệ chết theo chương trình sớm giảm dần theo thời gian, sự khác

biệt có ý ngh ĩa thống kê (p < 0,05). Ở nhóm nhiễm MeV, tỷ lệ chết theo chương trình

sớm đạt cao nhất tại thời điểm 48 giờ. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,001

ở nồng độ 1 MOI và p < 0,05 ở nồng độ 1/4 MOI (biểu đồ 4).

So sánh tỷ lệ tế bào chết theo chương trình sớm ở 3 nồng độ pha loãng MeV thấy:

Nồng độ MeV càng cao, tỷ lệ tế bào chết theo chương trình sớm càng cao, sự khác

biệt có ý ngh ĩa thống kê (thời điểm 24 giờ: p_{MeV 1 MOI-1/4 MOI}< 0,0001; thời điểm 96 giờ:

p

_{MeV 1 MOI-1/2 MOI}= < 0,0001, p_{MeV 1 MOI-1/4 MOI}< 0,0001, p_{MeV 1/2 MOI-1/4 MOI}= 0,003).

24 giờ

48 giờ

96 giờ

Biểu đồ 4: Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình sớm ở các nhóm nghiên cứu.

BÀN LUẬN

không kiểm soát dẫn đến sự phân hủy tế

bào, hay gặp trong phản ứng viêm và có

thể dẫn tới các vấn đề sức khỏe nghiêm

trọng [7].

Chết theo chương trình là cơ chế cần

thiết cho sự phát triển bình thường của

các sinh vật đa bào. Trong quá trình này,

tế bào chết để đáp ứng tích cực với một

Những năm gần đây, các nhà khoa

loạt các kích thích có kiểm soát. Chính học bắt đầu nghiên cứu cơ chế phân tử

điều này làm cho quá trình chết theo của quá trình chết theo chương trình và

chương trình khác biệt với một dạng chết ứng dụng trong điều trị lâm sàng. Ung thư

khác là hoại tử, trong đó tế bào chết là một bệnh đặc trưng bởi thiếu hụt quá

37

trình chết theo chương trình. Các tế bào

ung thư thường có một số đột biến cho

phép chúng bỏ qua các tín hiệu điều

chỉnh sự phát triển và tăng sinh của tế

bào. Ở trạng thái bình thường, khi các tế

bào bị hư hại hoặc tổn thương sẽ trải qua

quá trình chết theo chương trình, nhưng

trong trường hợp đột biến tế bào ung thư,

các tế bào khối u này có thể bỏ qua các

tín hiệu điều chỉnh, từ đó ngăn chặn các

tế bào không bị chết theo chương trình,

gây ra hiện tượng tăng sinh tế bào không

kiểm soát được. Đây chính là một trong

những cơ chế quan trọng để hình thành

và phát triển khối u. Vì thế, hiểu được quá

trình chết theo chương trình ở bệnh ung

thư sẽ giúp phát triển các phương pháp

điều trị căn bệnh này [7].

(biểu đồ 2, biểu đồ 3, biểu đồ 4). Điều

này cho thấy, quá trình chết theo chương

trình sớm diễn ra ở các nhóm nhiễm MeV

từ thời điểm 24 giờ, diễn ra mạnh mẽ ở

thời điểm 48 giờ và giảm dần ở thời điểm

96 giờ.

Một số tác giả c ũng chọn thời điểm

khảo sát như chúng tôi là ngày 1 - 4, kết

quả cũng cho thấy tác dụng gây chết theo

chương trình của MeV trên nhiều dòng tế

bào ung thư người khác nhau như ung

thư buồng trứng [4], ung thư đại trực

tràng [8].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi

khẳng định ở cả 3 thời điểm nghiên cứu,

nồng độ MeV cao làm tăng tế bào chết

theo chương trình so với nhóm nồng độ

thấp hơn. Sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê giữa các nhóm MOI = 1, 1/2 và 1/4

(p < 0,0001).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử

dụng phương pháp đếm tế bào qua dòng

chảy (flow cytometry) để kiểm tra tỷ lệ tế

bào chết theo chương trình và tế bào hoại

tử, chúng tôi sử d ụng kháng thể anti-

annexin V gắn chất phát huỳnh quang là

FITC và ch ất nhuộm nhân tế bào phát

huỳnh quang là 7-AAD. Kết quả cho thấy

MeV có khả năng ly giải tế bào OVCAR3

in vitro qua trung gian kích hoạt con

đường tế bào chết theo chương trình ở

tất cả các thời điểm nghiên cứu (bắt đầu

ở thời điểm 24 giờ, tăng cao nhất ở thời

điểm 48 giờ và giảm ở thời điểm 96 giờ).

Tỷ l ệ t ế bào chết theo chương trình ở

nhóm chứng thấp hơn cả 3 nhóm nhiễm

MeV ở các nồng độ khác nhau ở c ả

3 thời điểm trên (p < 0,05). Tỷ lệ tế bào

chết theo chương trình giai đoạn sớm ở

nhóm chứng giảm dần theo thời gian,

còn ở cả 3 nhóm nhiễm MeV đều có xu

hướng tăng, cao nhất ở thời điểm 48 giờ,

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp

với một nghiên cứu khác của chúng tôi in

vitro về tăng cường khả n ăng ly giải tế

bào ung thư khi sử dụng MeV điều trị tế

bào ung thư buồng trứng. Đây là cơ s ở

để chúng tôi tiến hành các thử nghiệm

tiếp theo in vivo.

KẾT LUẬN

Kết quả đánh giá khả năng gây chết tế

bào ung thư buồng trứng (OVCAR3) theo

chương trình của MeV in vitro trên hệ

thống Facs Lyric cho thấy: Tỷ l ệ t ế bào

chết theo chương trình ở các nhóm

nhiễm chủng MeV ở tất cả các n ồng độ

pha loãng (MOI từ 1 - 1/4) đều cao hơn

có nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p

< 0,001). Chủng MeV có tác dụng gây

chết tế bào ung thư buồng trứng

OVCAR3 theo chương trình in vitro.

38

to treat drug-resistant ovarian cancer. Cancer

Res 2015; 75(1):22-30.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bray F, et al. Global cancer statistics

2018: GLOBOCAN estimates of incidence

and mortality worldwide for 36 cancers in 185

countries. CA Cancer J Clin 2018; 68(6):

394-424.

5. Galanis E. Therapeutic potential of

oncolytic measles virus: Promises and

challenges. Clin Pharmacol Ther 2010;

88(5):620-625.

6. Galanis E, et al. Phase I trial of

intraperitoneal administration of an oncolytic

measles virus strain engineered to express

carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian

cancer. Cancer Res 2010; 70(3):875-882.

2. Msaouel P, et al. Oncolytic measles

virus strains as novel anticancer agents.

Expert Opin Biol Ther 2013; 13(4):483-502.

3. Son HA, et al. Combination of vaccine-

strain measles and mumps viruses enhances

oncolytic activity against human solid

malignancies. Cancer Invest 2018; 36(2):

106-117.

7. Dash P. Apoptosis. Basic Medical Sciences.

www.sgul.ac.uk/dept/immunology/~dash.

8. Boisgerault N, et al. Natural oncolytic

activity of live-attenuated measles virus against

human lung and colorectal adenocarcinomas.

Biomed Res Int 2013: 387362.

4. Galanis E, et al., Oncolytic measles

virus expressing the sodium iodide symporter

39