Đánh giá khả năng gây chết tế bào theo chương trình của chủng virus vaccine sởi trên tế bào ung thư buồng trứng
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT TẾ BÀO
THEO CHƯƠNG TRÌNH CỦA CHỦNG VIRUS VACCINE SỞI
TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ BUỒNG TRỨNG
Ngô Thu Hằng1, Hoàng Văn Tổng1,2, Đặng Thành Chung1, Hồ Anh Sơn1,2
Từ Quang4, Bùi Khắc Cường1,3, Nguyễn Lĩnh Toàn1*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Đánh giá khả năng gây chết tế bào theo chương trình của chủng virus vaccine sởi
(Measles vaccine - MeV) trên dòng tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR3). Đối tượng và
phương pháp: Tế bào OVCAR3 được lây nhiễm chủng MeV ở thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 96
giờ, sau đó được phân tích dòng chảy tế bào (flow cytometry) trên hệ thống FACS Lyric để xác
định tỷ lệ tế bào chết theo chương trình. Kết quả: Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình ở các
nhóm nhiễm MeV ở tất cả các nồng độ pha loãng (MOI từ 1 - 1/4) đều cao hơn có nghĩa thống
kê so với nhóm chứng (p < 0,001). Kết luận: Chủng MeV gây chết tế bào OVCAR3 theo
chương trình in vitro.
* Từ khóa: Ung thư buồng trứng; Virus vaccine sởi, Sự chết tế bào; FACS Lyric.
Evaluating the Apoptosis of Ovarian Cancer Cells Induced by
Vaccine Strain of Measles Virus
Summary
Objectives: To evaluate the capability of apoptotic induction of measles virus vaccine (MeV)
strain on ovarian cancer cells (OVCAR3). Materials and methods: OVCAR3 cells were
infected with the vaccine strain of MeV virus at 24, 48, and 96 hours and were analyzed by flow
cytometry on the FACS Lyric system to evaluate the apoptosis. Results: The proportion of
apoptotic cell death in the groups treated with MeV virus at all diluted concentrations (MOI from
1 to 1/4) was significantly higher compared to the control group (p < 0.001). Conclusion:
Vaccine strain of Measles virus induces apoptosis of ovarian cancer cell line OVCAR3.
* Keywords: Ovarian cancer squamous-cell carcinoma; Measles virus; Apoptosis; FACS Lyric.
ĐẶT VẤN ĐỀ
giới có khoảng > 18 triệu trường hợp mắc
mới và 9,6 triệu người chết vì ung th ư.
Trong số các ca ung thư m ắc mới,
Theo thống kê của chương trình
GLOBOCAN 2018, mỗi năm trên toàn thế
1Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y
2Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y
3Trung tâm Nghiên cứu Động vật thực nghiệm, Học viện Quân y
4Bộ môn - Khoa Tai Mũi Họng, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y
Tác giả phản hồi: Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 20/4/2021
Ngày bài báo được đăng: 02/6/2021
32
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
ung thư buồng trứng chiếm 1,6%
(295.414 ca) và tỷ lệ tử vong chiếm 1,9%
(184.799 ca) tổng số các ca tử vong do
ung thư [1]. Mặc dù đã có các biện pháp
điều trị tích cực như phẫu thuật, sau đó là
kết hợp hóa chất, nhưng phần lớn bệnh
nhân đều tái phát bệnh. Ung thư buồng
trứng đáp ứng khá tốt với hóa chất, song
tỷ lệ kháng lại các hóa chất này khá cao
khi bệnh tái phát. Các loại hóa chất khác
được điều trị thay thế, kể c ả s ử d ụng
thuốc điều trị đích (bevacizumab), nhưng
thời gian sống trung bình của nhóm bệnh
nhân này thường không quá 12 tháng.
Các hướng điều trị mới hiệu quả hơn cần
được áp dụng để nâng cao hiệu quả điều
trị ung thư buồng trứng.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng
- Tế bào ung thư biểu mô buồng trứng
người OVCAR3 (ATCC® HTB-161™)
(công ty ATCC, Mỹ) được bảo quản tại
Labo Nghiên cứu ung thư, Bộ môn Sinh
lý bệnh, Học viện Quân y.
- Chủng MeV: Là sản phẩm của Đề tài
KC.10.27/16-20, được bảo quản và duy
trì tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu ung thư,
Bộ môn Sinh lý bệnh, Học viện Quân y.
2. Phương pháp nghiên cứu
* Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
và nghiên cứu thực nghiệm.
* Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
Trị liệu bằng virus ly gi ải tế bào ung
thư (Oncolytic virus - OLV) dựa trên cơ
chế các OLV có khả năng xâm nhập đặc
hiệu vào tế bào ung thư của khối u, nhân
lên, giải phóng và gây ly giải tế bào ung
thư; kích thích tế bào ung thư chết theo
chương trình; kích thích đáp ứng miễn
dịch chống ung thư [2]. Nhiều nghiên cứu
cho thấy MeV là một OLV an toàn, có khả
năng phân giải tế bào ung thư in vitro,
in vivo và đang tiến hành các thử nghiệm
lâm sàng trên người [3].
- Kỹ thuật nuôi cấy các dòng tế bào
ung thư: Tế bào OVCAR3 được nuôi cấy
trên chai nuôi cấy tế bào có bổ sung 10%
FBS, 1% penicillin và streptomycin, nhiệt
độ 37oC, CO2 5%. Thu tế bào OVCAR3
bằng trypsin EDTA, sau đó ly tâm để loại
bỏ môi trường thu tế bào.
- Phương pháp Flow cytometry đánh
giá tỷ l ệ t ế bào chết theo chương trình:
Để kiểm tra tỷ lệ tế bào chết theo chương
trình, chúng tôi sử d ụng kháng thể anti-
annexin V gắn chất phát huỳnh quang là
fluorescein isothiocyanate (FITC) và chất
nhuộm nhân tế bào phát huỳnh quang là
7-Amino Actinomycin D (7-AAD).
Trên thế giới đã có một số thử nghiệm
đánh giá tác dụng kháng ung thư buồng
trứng của MeV cho kết quả khả quan [3,
4, 5, 6]. Tuy nhiên, ở Việt Nam ch ưa có
nghiên cứu nào đánh giá tác dụng gây
chết tế bào ung thư buồng trứng theo
chương trình của MeV. Do đó, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm:
Đánh giá khả năng gây chết tế bào ung
thư buồng trứng (OVCAR3) theo chương
trình của MeV bằng phương pháp Flow
cytometry trên hệ thống Facs Lyric.
* Quy trình chuẩn bị mẫu tế bào OVCAR3
nhiễm MeV và chạy flow cytometry:
- Tế bào OVCAR3 được nuôi cấy, tăng
sinh, thu hoạch theo quy trình.
- Chuẩn độ để được dung dịch tế bào
có nồng độ 105 tế bào/ml. Cho các phiến
6 giếng đã gieo tế bào OVCAR3 vào tủ
ấm 370C, 5% CO2.
33
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
- Sau 24 giờ, kiểm tra phiến 6 giếng
nuôi cấy tế bào OVCAR3 dưới kính hiển
vi, kết quả tế bào bám đáy tốt. Thay môi
trường nuôi cấy với từng nhóm như sau:
- Đánh giá tỷ lệ tế bào chết theo chương
trình trên hệ thống FACS Lyric (BD).
* Chỉ tiêu đánh giá:
- Tỷ lệ tế bào chết, chết theo chương
trình, chết theo chương trình giai đoạn
sớm ở các nhóm được nhiễm virus MeV
so với nhóm chứng không điều trị, các
nhóm nhiễm MeV ở các nồng độ khác nhau.
+ Nhóm chứng: 3 ml môi tr ường nuôi
cấy mới.
+ Nhóm nhiễm MeV: Môi trường nuôi
cấy có bổ sung MeV liều MOI = 1, 1/2, 1/4.
- Tiến hành thí nghiệm tại Labo Sinh
học phân tử, Bộ môn Sinh lý bệnh, Học
viện Quân y.
Cho các phiến 6 giếng đã nhiễm virus
vào tủ ấm 370C, 5% CO2, kiểm tra tế bào
hằng ngày. Mỗi nhóm được lặp lại 3 giếng.
* Xử lý th ống kê: Xử lý s ố liệu bằng
phần mềm SPSS 20.0 và GraphPad
Prism 6. So sánh trung bình của 2 nhóm
độc lập bằng T-test, so sánh trung bình
của 3 nhóm bằng phân tích phương sai
ANOVA. Khác biệt có ý nghĩa thống kê
khi p < 0,05.
- Tại thời điểm sau nhiễm MeV 24 giờ,
48 giờ và 96 gi ờ, tiến hành các bước thu
tế bào OVCAR3 ở các nhóm. Tế bào
được xử lý và nhuộm theo quy trình
của bộ kít Fluorescein isothiocyanate,
Annexin V Apoptosis Detection kit (BD).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Tỷ lệ tế bào chết ở các nhóm nghiên cứu
24 giờ
48 giờ
96 giờ
Biểu đồ 1: Tỷ lệ tế bào chết ở các nhóm nghiên cứu.
34
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
Tỷ lệ tế bào chết ở nhóm chứng thấp hơn ở 3 nhóm nhiễm MeV ở cả 3 thời điểm.
Tỷ lệ tế bào chết ở nhóm nhiễm MeV n ồng độ MOI = 1 và 1/2 cao hơn có ý ngh ĩa
thống kê so với nhóm chứng (p < 0,001) ở thời điểm 24 giờ và 96 giờ. Tại thời điểm 48
giờ, tỷ lệ tế bào chết ở nhóm nhiễm MeV ở cả 3 nồng độ MOI = 1, 1/2 và 1/4 cao hơn
có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p < 0,01).
Nồng độ MeV càng cao, tỷ lệ tế bào chết càng cao, sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê với p < 0,0001 ở thời điểm 24 giờ và p < 0,01 ở thời điểm 96 giờ.
2. Tỷ lệ tế bào OVCAR3 chết theo chương trình sau nhiễm MeV
24 giờ
48 giờ
96 giờ
Biểu đồ 2: Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình ở các nhóm nghiên cứu.
Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình ở tất cả các nhóm nhiễm MeV đều cao hơn
nhóm chứng. Ở thời điểm 24 giờ và 96 gi ờ, sự khác biệt có ý ngh ĩa thống kê giữa
nhóm nhiễm MeV nồng độ 1 MOI và 1/2 MOI so v ới nhóm chứng (p < 0,001). Tại thời
điểm 48 giờ, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa cả 3 nhóm nồng độ MeV với nhóm
chứng (p < 0,01).
35
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
Control
MeV (MOI=1/4)
MeV (MOI=1/2)
MeV (MOI=1)
82,4%
Q1
22,4%
Q1
32,9%
Q1
67,4%
Q1
Q2
Q2
Q2
Q2
24 giờ
Q3
Q3
Q3
Q3
Q4
Q4
Q4
Q4
1,73%
54,5%
Q1
97,1%
Q1
86,4%
Q1
Q2
Q2
Q2
Q1
Q2
48 giờ
Q3
Q3
Q3
Q3
Q4
Q4
Q4
Q4
0,83%
9,19%
Q1
88,3%
Q1
58,8%
Q1
Q2
Q2
Q2
Q2
Q1
96 giờ
Q3
Q3
Q3
Q3
Q4
Q4
Q4
Q4
7-Amino Actinomycin D
Biểu đồ 3: Kết quả chạy flow cytometry tế bào OVCAR3 ở thời điểm
24 giờ, 48 giờ và 96 giờ sau nhiễm MeV.
Q1: Vùng tế bào chết theo chương trình giai đoạn sớm
Q2: Vùng tế bào chết theo chương trình giai đoạn muộn
Q3: Vùng tế bào hoại tử
Q4: Vùng tế bào sống
Tại 3 thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 96 giờ đều cho kết quả: Nồng độ MeV càng cao, tỷ
lệ tế bào chết theo chương trình càng cao, sự khác biệt có ý ngh ĩa thống kê với p <
0,0001 ở thời điểm 24 giờ giữa nhóm 1 MOI và 1/4 MOI và p = 0,003 ở thời điểm 48
giờ giữa cả 3 nhóm nồng độ. Sự khác biệt tại thời điểm 96 giờ không có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05).
3. Tỷ l ệ t ế bào OVCAR3 chết theo chương trình sớm ở các thời điểm sau
nhiễm MeV
Kết quả chạy Flow cytometry ở 3 thời điểm ở cho thấy: Tỷ l ệ t ế bào chết theo
chương trình sớm ở tất cả các nhóm nhiễm MeV đều cao hơn nhóm chứng (biểu đồ 3,
biểu đồ 4). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (thời điểm 24 giờ: pMeV 1 MOI-control < 0,0001,
p
MeV 1/2 MOI-control < 0,0001; thời điểm 48 giờ: pMeV 1 MOI-control = 0,001, pMeV 1/2 MOI-control = 0,005,
MeV 1/4 MOI-control = 0,008; thời điểm 96 giờ: pMeV 1 MOI-control < 0,0001, pMeV 1/2 MOI-control = 0,002).
p
36
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
Ở nhóm chứng, tỷ lệ chết theo chương trình sớm giảm dần theo thời gian, sự khác
biệt có ý ngh ĩa thống kê (p < 0,05). Ở nhóm nhiễm MeV, tỷ lệ chết theo chương trình
sớm đạt cao nhất tại thời điểm 48 giờ. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,001
ở nồng độ 1 MOI và p < 0,05 ở nồng độ 1/4 MOI (biểu đồ 4).
So sánh tỷ lệ tế bào chết theo chương trình sớm ở 3 nồng độ pha loãng MeV thấy:
Nồng độ MeV càng cao, tỷ lệ tế bào chết theo chương trình sớm càng cao, sự khác
biệt có ý ngh ĩa thống kê (thời điểm 24 giờ: pMeV 1 MOI-1/4 MOI < 0,0001; thời điểm 96 giờ:
p
MeV 1 MOI-1/2 MOI = < 0,0001, pMeV 1 MOI-1/4 MOI < 0,0001, pMeV 1/2 MOI-1/4 MOI = 0,003).
24 giờ
48 giờ
96 giờ
Biểu đồ 4: Tỷ lệ tế bào chết theo chương trình sớm ở các nhóm nghiên cứu.
BÀN LUẬN
không kiểm soát dẫn đến sự phân hủy tế
bào, hay gặp trong phản ứng viêm và có
thể dẫn tới các vấn đề sức khỏe nghiêm
trọng [7].
Chết theo chương trình là cơ chế cần
thiết cho sự phát triển bình thường của
các sinh vật đa bào. Trong quá trình này,
tế bào chết để đáp ứng tích cực với một
Những năm gần đây, các nhà khoa
loạt các kích thích có kiểm soát. Chính học bắt đầu nghiên cứu cơ chế phân tử
điều này làm cho quá trình chết theo của quá trình chết theo chương trình và
chương trình khác biệt với một dạng chết ứng dụng trong điều trị lâm sàng. Ung thư
khác là hoại tử, trong đó tế bào chết là một bệnh đặc trưng bởi thiếu hụt quá
37
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
trình chết theo chương trình. Các tế bào
ung thư thường có một số đột biến cho
phép chúng bỏ qua các tín hiệu điều
chỉnh sự phát triển và tăng sinh của tế
bào. Ở trạng thái bình thường, khi các tế
bào bị hư hại hoặc tổn thương sẽ trải qua
quá trình chết theo chương trình, nhưng
trong trường hợp đột biến tế bào ung thư,
các tế bào khối u này có thể bỏ qua các
tín hiệu điều chỉnh, từ đó ngăn chặn các
tế bào không bị chết theo chương trình,
gây ra hiện tượng tăng sinh tế bào không
kiểm soát được. Đây chính là một trong
những cơ chế quan trọng để hình thành
và phát triển khối u. Vì thế, hiểu được quá
trình chết theo chương trình ở bệnh ung
thư sẽ giúp phát triển các phương pháp
điều trị căn bệnh này [7].
(biểu đồ 2, biểu đồ 3, biểu đồ 4). Điều
này cho thấy, quá trình chết theo chương
trình sớm diễn ra ở các nhóm nhiễm MeV
từ thời điểm 24 giờ, diễn ra mạnh mẽ ở
thời điểm 48 giờ và giảm dần ở thời điểm
96 giờ.
Một số tác giả c ũng chọn thời điểm
khảo sát như chúng tôi là ngày 1 - 4, kết
quả cũng cho thấy tác dụng gây chết theo
chương trình của MeV trên nhiều dòng tế
bào ung thư người khác nhau như ung
thư buồng trứng [4], ung thư đại trực
tràng [8].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi
khẳng định ở cả 3 thời điểm nghiên cứu,
nồng độ MeV cao làm tăng tế bào chết
theo chương trình so với nhóm nồng độ
thấp hơn. Sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê giữa các nhóm MOI = 1, 1/2 và 1/4
(p < 0,0001).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụng phương pháp đếm tế bào qua dòng
chảy (flow cytometry) để kiểm tra tỷ lệ tế
bào chết theo chương trình và tế bào hoại
tử, chúng tôi sử d ụng kháng thể anti-
annexin V gắn chất phát huỳnh quang là
FITC và ch ất nhuộm nhân tế bào phát
huỳnh quang là 7-AAD. Kết quả cho thấy
MeV có khả năng ly giải tế bào OVCAR3
in vitro qua trung gian kích hoạt con
đường tế bào chết theo chương trình ở
tất cả các thời điểm nghiên cứu (bắt đầu
ở thời điểm 24 giờ, tăng cao nhất ở thời
điểm 48 giờ và giảm ở thời điểm 96 giờ).
Tỷ l ệ t ế bào chết theo chương trình ở
nhóm chứng thấp hơn cả 3 nhóm nhiễm
MeV ở các nồng độ khác nhau ở c ả
3 thời điểm trên (p < 0,05). Tỷ lệ tế bào
chết theo chương trình giai đoạn sớm ở
nhóm chứng giảm dần theo thời gian,
còn ở cả 3 nhóm nhiễm MeV đều có xu
hướng tăng, cao nhất ở thời điểm 48 giờ,
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp
với một nghiên cứu khác của chúng tôi in
vitro về tăng cường khả n ăng ly giải tế
bào ung thư khi sử dụng MeV điều trị tế
bào ung thư buồng trứng. Đây là cơ s ở
để chúng tôi tiến hành các thử nghiệm
tiếp theo in vivo.
KẾT LUẬN
Kết quả đánh giá khả năng gây chết tế
bào ung thư buồng trứng (OVCAR3) theo
chương trình của MeV in vitro trên hệ
thống Facs Lyric cho thấy: Tỷ l ệ t ế bào
chết theo chương trình ở các nhóm
nhiễm chủng MeV ở tất cả các n ồng độ
pha loãng (MOI từ 1 - 1/4) đều cao hơn
có nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p
< 0,001). Chủng MeV có tác dụng gây
chết tế bào ung thư buồng trứng
OVCAR3 theo chương trình in vitro.
38
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 5-2021
to treat drug-resistant ovarian cancer. Cancer
Res 2015; 75(1):22-30.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bray F, et al. Global cancer statistics
2018: GLOBOCAN estimates of incidence
and mortality worldwide for 36 cancers in 185
countries. CA Cancer J Clin 2018; 68(6):
394-424.
5. Galanis E. Therapeutic potential of
oncolytic measles virus: Promises and
challenges. Clin Pharmacol Ther 2010;
88(5):620-625.
6. Galanis E, et al. Phase I trial of
intraperitoneal administration of an oncolytic
measles virus strain engineered to express
carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian
cancer. Cancer Res 2010; 70(3):875-882.
2. Msaouel P, et al. Oncolytic measles
virus strains as novel anticancer agents.
Expert Opin Biol Ther 2013; 13(4):483-502.
3. Son HA, et al. Combination of vaccine-
strain measles and mumps viruses enhances
oncolytic activity against human solid
malignancies. Cancer Invest 2018; 36(2):
106-117.
7. Dash P. Apoptosis. Basic Medical Sciences.
8. Boisgerault N, et al. Natural oncolytic
activity of live-attenuated measles virus against
human lung and colorectal adenocarcinomas.
Biomed Res Int 2013: 387362.
4. Galanis E, et al., Oncolytic measles
virus expressing the sodium iodide symporter
39
Bạn đang xem tài liệu "Đánh giá khả năng gây chết tế bào theo chương trình của chủng virus vaccine sởi trên tế bào ung thư buồng trứng", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- danh_gia_kha_nang_gay_chet_te_bao_theo_chuong_trinh_cua_chun.pdf