Tối ưu hóa các điều kiện sản xuất vaccine bất hoạt phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
STUDY OF TRANSMISSION OF INFECTIOU HYPERDERMAL AND
HEMATOPIETIC NECROSIS VIRUS (IHHNV) IN BLACK TIGER SHRIMP
(PENEUS MONODON)
Cao Thanh Trung1, Pham Cong Nguyen1, Nguyen Van Hao2
ABSTRACT
The infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) also called Penaeus styl-
irostris densovirus (PstDNV) has been identified high mortality Penaeus stylirostris in the Ameri-
cas. It has been reported to cause Runt deformity syndrome (RDS) in Penaeus vannamei which is
a chronic, non-lethal disease. At present, there is no established experimental model of infection in
Penaeus monodon under laboratory conditions. Transmission of IHHNV have been experimented
by the horizontal and vertical routes. Horizontal transmission were performed with 3 trials which
are fed with the infected shrimps, co-habitant, combine with feeding and cohabitant. The vertical
transmission from infected females to offspring have been demonstrated. The IHHNV infection was
monitored by PCR assay. Result of experiments were showed that IHHNV vertical transmission
from infected females were clearly proved. All life stages that produced from infected females were
presented the IHHNV by PCR assay. In horizontal transmission, the free IHHNV of P. monodon in
all trials that were positive with the IHHNV at 14 days and 28 days after the infection. In the trial
of cohabiting IHHNV infected P. mondon was 60.0% and 86.7%; feeding with IHHNV infected P.
mondon was 46.7% and 60.0%; combine feeding and cohabitan was 66.7% and 76.7%. In infection
with difference of species trials. The percent of infected IHHNV of P. monodon of cohabitant trial
was 43.3% and 66.7% after infected at 14 days and 28 days; feeding trial was 13.3% and 40.0%;
and the combine feeding and cohabitant trial was 26.7% and 80.0%. Experimental infection could
be used to study the P. monodon pathogen further in order to prevent and control of virus infected
in shrimps.
Keywords: IHHNV, Penaeus monodon, transmission
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 10/02/2014
Ngày thông qua phản biện: 28/02/2014
Ngày duyệt đăng: 30/3/2014
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2.
Email: thanhtrung[email protected]
2 Research Institute for Aquaculture No2.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
110
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN SẢN XUẤT VACCINE BẤT HOẠT
PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ CHO CÁ TRA
Lê Hồng Phước1, Võ Hồng Phượng1, Nguyễn Thị Hiền1, Ngô Thị Bích Phượng1,
Nguyễn Phạm Hoàng Huy1, Chung Minh Lợi1
TÓM TẮT
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tối ưu hóa các điều kiện sản xuất vaccine sốc nhiệt bất hoạt phòng bệnh
gan thận mủ trên cá tra. Chủng vi khuẩn dùng làm vaccine được phân lập và chọn lọc từ mẫu cá tra bệnh gan
thận mủ thu tại các tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và An Giang. Với phương pháp sốc nhiệt và kiểm tra protein
sốc nhiệt bằng phản ứng SDS-PAGE và Western Blot cho thấy ở điều kiện gây sốc 41oC trong 30 phút E.
ictaluri sinh lượng heat shock nhiều hơn so với các điều kiện thử nghiệm khác. Thử nghiệm bốn loại môi
trường canh dinh dưỡng Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB)
và Hottinger cho thấy E. ictaluri phát triển tốt ở môi trường BHIB. pH thích hợp cho chủng vi khuẩn này phát
triển và duy trì đꢀc lực là 7,0. Khảo sát các điều kiện phát triển trong nồi lên men cho thấy ở điều kiện tốc đꢀ
khuấy 200 vòng /phút, lượng khí thổi vào 6 lít/phút và thời gian thu hoạch vi khuẩn sau 36 giờ tăng sinh cho
hiệu quả kích thích sinh miễn dịch tốt nhất. Vaccine sản xuất không có tính đꢀc đối với cá tra, liều vaccine 3 x
109 CFU/cá có khả năng kích thích sinh miễn dịch và bảo hꢀ cho cá với chỉ số RPS = 53%. Có sự khác biệt có
ý nghĩa thống kê về tỷ lệ chết sau khi gây nhiễm ở nhóm cá đối chứng và nhóm được tiêm vaccine (p < 0,05).
Từ khóa: Cá tra, vaccine, Edwarsiella ictaluri
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
nhiều làm nhiệt đꢀ nước giảm thấp dưới 28oC.
Trong những năm gần đây, cá tra được xem
là đối tượng nuôi chủ lực của cả nước và tập
trung chủ yếu ở khu vực Đồng bằng sông Cửu
Long. Hiện nay mꢀt số tỉnh đã và đang có diện
tích và sản lượng cá tra lớn nhất cả nước như:
Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang,
Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang.
Người nuôi đã can thiệp bằng nhiều biện pháp
khác nhau trong đó đáng kể nhất là việc sử
dụng kháng sinh. Kháng sinh có thể phòng trị
bệnh nhiễm khuẩn nhưng sẽ gây ra nhiều hậu
quả đáng kể về việc kháng thuốc hoꢁc là dư
lượng kháng sinh trong thịt cá. Trên thế giới,
việc phòng bệnh bằng vaccine đã được áp
dụng nhiều và mang lại hiệu quả trên cá hồi.
Ngoài ra cũng đã có nhiều công trình nghiên
cứu ứng dụng vaccine trên các loài cá khác
như rô phi, cá chép. Các loại vaccine được
thử nghiệm bao gồm vaccine vô hoạt, vaccine
nhược đꢀc và vaccine tái tổ hợp. Trong nghiên
cứu này vaccine bất hoạt được sản xuất theo
hướng sốc nhiệt nhằm mục đích mong muốn
làm tăng hiệu quả của vaccine. Qua nghiên
cứu cho thấy protein sốc nhiệt (heat shock
Theo thống kê của Tổng Cục Thủy Sản,
tình hình nuôi cá tra vẫn gꢁp nhiều khó khăn về
giá và thị trường tiêu thụ trong các tháng đầu
năm 2013. Ngoài ra, dịch bệnh trên cá tra hầu
như không thể tránh khỏi và làm ảnh hưởng
phần nào đến sản lượng thu hoạch. Bệnh gan
thận mủ được xem là những bệnh thường xuất
hiện và nguy hiểm nhất trên cá tra. Bệnh xuất
hiện ở hầu hết các giai đoạn nuôi và thường
nꢁng nhất ở thời điểm giao mùa hoꢁc khi mưa
1 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bꢀ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản 2.
Email: lehongphu[email protected]
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
111
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
(NB), Tryptic Soy Broth (TSB), Hottinger và
protein: HSP) làm tăng cường đáp ứng miễn
dịch trên đối tượng thủy sản. Cụ thể là ấu
trùng Artemia nuôi ở 28°C khi được gây sốc
ở 37°C trong 30 phút và 6h hồi phục cho thấy
khả năng đề kháng với vi khuẩn gây bệnh
Vibrio campbellii. Tỷ lệ sống tăng gấp đôi
ở nhóm được gây sốc nhiệt so với nhóm đối
chứng chứng tỏ rằng HSP70 có vai trò bảo vệ
Artemia đối với tác nhân gây bệnh (Yeong và
ctv, 2007, 2008). Hsp60 và Hsp70 được chiết
xuất từ Escherichia coli có khả năng kích
thích tăng hàm lượng kháng thể trên cá hồi
sau khi được tiêm Hsp70. Vì vậy Hsp có thể
được xem như là chất làm tăng cường hiệu
quả của vaccine (Plant và ctv, 2009).
môi trường thạch máu Blood Agar (BA) với 5%
máu cừu.
- Dung dịch formaline bất hoạt vi khuẩn,
thuốc gây mê và mꢀt số hóa chất thông dụng
khác gồm: nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím,
Chlorine, …
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và
định danh vi khuẩn
Dùng các môi trường: Blood agar, Brain-
Heart Infusion Agar cho phân lập vi khuẩn.
Sử dụng test kit API 20E để test sinh hóa và
định danh vi khuẩn theo khóa phân loại Bergey
(1996). Ngoài ra còn xác định E. ictaluri bằng
phương pháp PCR
Ở Việt Nam cho đến thời điểm này chỉ có
công ty TNHH PHARMAQ đăng ký sản phẩm
vaccine trên cá tra nhưng chỉ ở bước đầu. Ngoài
ra có vài nghiên cứu về vaccine phòng bệnh
gan thận mủ trên cá tra dưới dạng các đề tài
nghiên cứu được thực hiện bởi các Viện Nghiên
Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản hay các trường Đại
Học. Trong nghiên cứu này quy trình sản xuất
vaccine được tối ưu hóa về môi trường tăng sinh
vi khuẩn, lượng khí thổi vào, tốc đꢀ khuấy cũng
như thời gian thu hoạch vi khuẩn thích hợp.
2.2.2. Gây bệnh thực nghiệm bằng phương
pháp tiêm
Gây mê cá thí nghiệm bằng EGME (Ethylene
Glycol Monophenyl Ether, Merck) 0,2 ppt (1 ml
EGME trong 5 lít nước) trong 3-5 phút. Sử dụng
kim tiêm bán tự đꢀng (Socorex) với chiều dài
mũi kim tiêm 4 mm được dùng cho cá 10-40 g để
đảm bảo an toàn cho cá thí nghiệm.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hiệu lực của
vaccine
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Đánh giá hiệu lực vaccine qua giá trị RPS -
relative percent survival (tỷ lệ sống tương đối)
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu: Chủng vi khuẩn Edwardsiella theo công thức của Amend (1981):
ictaluri (Gly 09M) phân lập từ cá tra bệnh thu
ở ĐBSCL được sử dụng làm nguồn nguyên
liệu tạo vaccine, cá tra (20-25g/con khỏe mạnh,
không bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri)
Tỷ lệ % số cá vaccine chết
RPS (%) = (1- -------------------------------) x 100
Tỷ lệ % số cá đối chứng chết
2.3. Bố trí thí nghiệm:
Thiết bị: Nồi lên men (10 lít), máy trꢀn
mẫu, máy quang phổ đo OD, máy ly tâm, tủ ấm,
tủ cấy vi sinh, tủ mát 40C, tủ lạnh -20oC, -70oC,
cân điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự đꢀng,
Kiểm tra môi trường thích hợp cho E.
Ictaluri
Thí nghiệm 1: Theo dõi sự phát triển của vi
ống nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite khuẩn trên 04 loại môi trường
1m3, bể kính (80 lít), …
Sau 36-40h nuôi cấy E. ictaluri trên thạch
Hóa chất và môi trường:
máu tiến hành thu khuẩn lạc và tạo dịch huyền
phù trong nước muối sinh lý. Đo mật đꢀ quang
(OD550) và tính toán mật đꢀ vi khuẩn ban đầu để
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Brain
Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
112
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
cho vào các 4 loại môi trường thử nghiệm (NB, chứng tiêm với nước muối sinh lý cũng gồm 10
BHIB, TSB và Hottinger). Mật đꢀ vi khuẩn ban cá và lꢁp lại 3 lần. Theo dõi cá và ghi nhận số cá
đầu trong thí nghiệm này là 103 CFU/ml được chết trong 2 tuần sau khi tiêm vi khuẩn.
ủ ở 28oC và trong điều kiện nuôi cấy đꢀng (tủ
Thí nghiệm 6: Bước đầu khảo sát 3 tốc đꢀ
ấm lắc, 150 vòng/phút). Sau mỗi 3h thu mẫu đo
khuấy đảo là 150, 200 và 250 vòng/phút trong
mật đꢀ quang và cấy trên môi trường NA để xác
nồi lên men LiFlus GX (Tăngil, Ấn Đꢀ).
định tổng số vi khuẩn.
Nhiệt đꢀ nuôi cấy trong nồi lên men được
ổn định ở 28°C. Lưu lượng khí thổi vào của cả
Thí nghiệm 2: Theo dõi sự phát triển của E.
ictaluri trong môi trường BHIB và NB
3 lần khảo sát tốc đꢀ khuấy đảo là 2 L/phút. Mật
Thí nghiệm được bố trí tương tự như thí
đꢀ vi khuẩn E. ictaluri ban đầu là 103 CFU/ml
nghiệm 1. Tuy nhiên chỉ có 2 loại môi trường
trong thể tích nuôi cấy 5 L môi trường BHI (pH
được sử dụng là BHIB và NB với mục đích kiểm
= 7). Thu mẫu 3 giờ mꢀt lần trong vòng 48 giờ
chứng môi trường nuôi cấy nào thích hợp hơn
để đo OD550nm và trải đĩa xác định mật đꢀ tương
Thí nghiệm 3: Khảo sát sự phát triển của vi
khuẩn ở 6 giá trị pH là 4, 5, 6, 7, 8 và 9
đối của vi khuẩn.
Thí nghiệm 7: Căn cứ trên kết quả của thí
Sử dụng môi trường nuôi cấy BHIB, thể
tích nuôi cấy 50 ml, điều kiện nuôi cấy lắc 150
vòng/phút, nhiệt đꢀ 28-30°C. Mật đꢀ vi khuẩn
E. icttaluri lúc bắt đầu nuôi cấy là 106 CFU/ml.
Theo dõi mật đꢀ vi khuẩn bằng cách đo OD ở
bước sóng 550nm trong vòng 48 giờ (lấy mẫu
6 giờ/lần).
nghiệm trên xác định tốc đꢀ khuấy thích hợp
(200 vòng/phút) sau đó tiến hành bố trí thí
nghiệm ở các mức lượng khí thổi vào 2, 4, 6 và
8 lít/phút. Thu mẫu kiểm tra OD và cấy trãi đĩa
xác định mật đꢀ vi khuẩn sau 3, 6,…48 giờ nuôi
cấy trong nồi lên men
Thí nghiệm 8: Kiểm tra tính sinh miễn dịch
Thí nghiệm 4: Khảo sát sự phát triển của
vi khuẩn ở 5 giá trị pH gồm pH = 6,0; 6,5; 7,0;
7,5 và 8,0.
Nhân sinh khối E.ictaluri (GlyM09) trong
điều kiện pH 7.0 nhiệt đꢀ 280C và tốc đꢀ khuấy
150 vòng/ phút, 200 vòng/phút đồng thời lượng
khí thổi vào là 6 và 8 lít/phút cho mỗi tốc đꢀ
khuấy. Tiến hành thu vi khuẩn tại các thời điểm
33 giờ, 36 giờ, 39 giờ sau đó tiến hành sốc nhiệt
vi khuẩn ở nhiệt đꢀ 410C trong 30 phút (điều
kiện này đã được tối ưu), bất hoạt vi khuẩn bằng
formalin 0,4% trước khi thử nghiệm vaccine
để đánh giá thời gian thu vi khuẩn để sản xuất
vaccine tốt nhất thông qua tỷ lệ bảo hꢀ của các
nghiệm thức này.
Sử dụng môi trường nuôi cấy là BHIB, thể
tích nuôi cấy 50 ml, điều kiện nuôi cấy lắc 150
vòng/phút, nhiệt đꢀ 28-30°C. Mật đꢀ vi khuẩn
E. ictaluri lúc bắt đầu nuôi cấy là 106 CFU/ml.
Theo dõi mật đꢀ vi khuẩn bằng cách đo OD ở
bước sóng 550nm trong vòng 48 giờ (lấy mẫu
6 giờ/lần).
Thí nghiệm 5: Khảo sát sự phát triển của E.
ictaluri trên môi trường BHIB ở pH = 6, 7 và 8
Ở thí nghiệm này còn có phần kiểm tra
đꢀc lực của vi khuẩn sau khi được tăng sinh ở
các điểm pH khảo sát. Vì vậy tại thời điểm 18
giờ sau khi tăng sinh tiến hành thu sinh khối vi
khuẩn phát triển trong môi trường BHIB ở 3 giá
trị pH là 6, 7 và 8, pha loãng để được nồng đꢀ
gây nhiễm đồng nhất là 5 x104 CFU/cá. Bố trí
thí nghiệm gây nhiễm, mỗi pH môi trường được
tiêm cho 10 cá, lꢁp lại 3 lần, nghiệm thức đối
Sau khi kiểm tra tính vô trùng và an toàn
của vaccine, tiêm vaccine cho cá tra thí nghiệm
(20-25g/con) theo quy trình tiêm vaccine 2 lần
mỗi lần với liều sử dụng 3x109 CFU/cá cách
nhau 14 ngày, sau thời gian 2 tuần từ lúc tiêm
vaccine lần 2 tiến hành công vi khuẩn mật đꢀ
1,5x104CFU/cá. Mỗi nghiệm thức gồm 90 cá
(30 cá/bể x 3 bể).
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
113
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
mật đꢀ vi khuẩn bắt đầu thấp (103 CFU/ml) cho
III. KẾT QUẢ
nên pha lag khá dài. Ở 12h đầu tiên sau khi tăng
sinh vi khuẩn thì OD550 rất thấp (đồ thị 1). Kết
quả ở đồ thị 1 và 2 cho thấy sự khác biệt về
tốc đꢀ phát triển của vi khuẩn trên các loại môi
trường khác nhau.
3.1. Theo dõi sự phát triển của E. ictaluri
trên 04 loại môi trường
Kết quả nuôi cấy cho thấy vi khuẩn phát
triển nhanh trên môi trường BHIB và NB. Với
3.2. Theo dõi sự phát triển của E. ictalu-
ri trên môi trường BHIB và NB
Ở thí nghiệm này chỉ có 2 loại môi trường
được khảo sát là BHIB và NB nhằm để lꢁp lại
thí nghiệm trên và cũng làm cơ sở để quyết định
môi trường nào dùng để tăng sinh vi khuẩn cho
các nꢀi dung tiếp theo. Kết quả thí nghiệm ở
đồ thị 3 tương tự như đồ thị 1. Kể từ sau 18 giờ
nuôi cấy trên môi trường BHIB cho thấy mức
đꢀ phát triển của vi khuẩn trên môi trường này
cao hơn nhiều so với môi trường NB ở tất cả các
thời điểm thu mẫu thì 21-48 giờ).
Đồ thị 3. Mật đꢀ quang của Edwardsiella
ictaluri trên môi trường BHIB và NB
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự
phát triển của E. ictaluri
đến cao ở các môi trường có pH = 7, 8 và 6.
Tuy nhiên từ giờ thứ 30 cho đến giờ thứ 48, ở
các mức pH 6, 7, 8 có thứ tự giá trị OD550nm từ
thấp đến cao lần lượt là pH 8, 7 và 6. Các mức
pH khác cho thấy vi khuẩn phát triển không
tốt (đồ thị 4).
Thí nghiệm 3: Ở thí nghiệm này các giá
trị pH = 4, 5, 6, 7, 8 và 9 của môi trường BHIB
được dùng để đánh giá tác đꢀng của pH lên sự
phát triển của E. ictaluri. Ở giờ thứ 24, giá trị
OD550nm bắt đầu tăng mạnh và lần lượt từ thấp
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
114
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Thí nghiệm 4: Mục đích của thí nghiệm
Kết quả kiểm tra đꢀc lực được trình bày
này là khảo sát khoảng pH hẹp hơn so với thí ở đồ thị 6. Sau khi gây nhiễm, tỉ lệ chết cꢀng
nghiệm 3. Kết quả ở thí nghiệm 1 cho thấy ở dồn của cá tiêm với vi khuẩn nuôi ở môi trường
các pH quá thấp và quá cao thì vi khuẩn hầu như BHIB pH = 6 là 37% trong khi đó ở pH = 7 và 8
không thích nghi. Vì vậy trong thí nghiệm này tỉ lệ chết cꢀng dồn lần lượt là 77% và 73%. Điều
môi trường BHIB với các giá trị pH = 6, 6.5, 7, này cho thấy pH của môi trường nuôi cấy có ảnh
7.5 và 8 được khảo sát. Kết quả cho thấy có sự hưởng đáng kể đến đꢀc lực của E. ictaluri. Vi
tác đꢀng rõ rệt lên sự phát triển của vi khuẩn E. khuẩn này phát triển ở môi trường BHI với pH =
ictaluri. Từ giờ thứ 24 đến giờ thứ 48, pH môi 7 và 8 có đꢀc lực cao đối với cá tra. Đꢀc lực của
trường càng thấp thì ngược lại giá trị OD550nm vi khuẩn đối với cá tra giảm mạnh khi vi khuẩn
càng cao. Như vậy đối với môi trường BHI, E. phát triển trong môi trường pH = 6.
ictaluri phát triển mạnh ở pH = 6 và sự phát
triển giảm dần ở pH = 6.5, 7, 7.5 và 8 (đồ thị 5)
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của pH môi
trường lên phát triển và đꢀc lực của vi khuẩn
Ở thí nghiệm này khảo sát sự phát triển của
E. ictaluri trên môi trường BHIB ở các giá trị
pH = 6, 7 và 8. Thí nghiệm này còn có phần
kiểm tra đꢀc lực của vi khuẩn sau khi được tăng
sinh ở các điểm pH khảo sát. Vì vậy tại thời
điểm 18 giờ sau khi tăng sinh tiến hành thu sinh
khối vi khuẩn phát triển trong môi trường BHI
ở 3 giá trị pH là 6, 7 và 8, pha loãng để được
nồng đꢀ gây nhiễm đồng nhất là 5 x104 CFU/cá.
Kết quả cho thấy vi khuẩn phát triển tốt ở môi
trường pH =6 so với các pH còn lại.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
115
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ
khuấy lên sự phát triển của E. ictaluri trong
nồi lên men
Mꢁc dù kết quả đo OD550nm cho thấy có sự
khác biệt về sự phát triển của vi khuẩn E. ictaluri
ở các tốc đꢀ khuấy đảo khác nhau nhưng kết quả
xác định mật đꢀ tế bào vi khuẩn bằng phương
pháp pha loãng và trải đĩa lại cho thấy không có
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mật đꢀ vi
khuẩn giữa các tốc đꢀ khuấy (đồ thị 8).
Thí nghiệm 6: Kết quả ở đồ thị 7 cho thấy
giá trị OD550nm cao nhất khi vi khuẩn E. ictaluri
được nuôi với tốc đꢀ khuấy đảo 250 vòng/phút,
tiếp theo là 200 vòng/phút và thấp nhất ở 150
vòng/phút từ giờ thứ 21 đến giờ thứ 36.
Đồ thị 7. Ảnh hưởng của tốc đꢀ khuấy lên sự
phát triển của E. ictaluri trong nồi lên men
thông qua giá trị OD550nm
Đồ thị 8. Ảnh hưởng của tốc đꢀ khuấy lên sự
phát triển của E. ictaluri trong nồi lên men
thông qua mật đꢀ tế bào vi khuẩn (CFU/ml)
Đồ thị 9. Giá trị OD của E. ictaluri khi nuôi
cấy trong nồi lên men với tốc đꢀ khuấy 200
vòng/phút ở các mức lượng khí thổi vào
khác nhau
Đồ thị 10. Mật đꢀ vi khuẩn trên môi trường
BHIA ở các thời điểm thu mẫu trong nồi lên
men với tốc đꢀ khuấy 200 vòng/phút và lượng
khí thổi vào 2, 4, 6 và 8 lít/phút
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
116
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
3.5. Ảnh hưởng của lượng khí thổi vào
lên sự phát triển của E. ictaluri
Thí nghiệm này được thử nghiệm 2 tốc đꢀ
khuấy (150 và 200 vòng/phút) và 2 lượng khí
thổi vào (6 và 8 lít/phút) và tiến hành thu vi
khuẩn tại các thời điểm 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ
sau đó tiến hành sốc nhiệt vi khuẩn ở nhiệt đꢀ
410C trong 30 phút (điều kiện tối ưu sốc nhiệt
như đã trình bày ở phần trên) sau đó bất hoạt vi
khuẩn bằng formalin 0,4% trước khi thử nghiệm
vaccine để đánh giá thời gian thu vi khuẩn để sản
Thí nghiệm 7: Kết quả khảo sát tốc đꢀ
khuấy 200 vòng/phút với các lượng khí thổi vào
lần lượt là 2, 4, 6 và 8 lít/phút ở nồi lên men cho
thấy ở nghiệm thức với lượng khí thổi vào là
6 lít/phút vi khuẩn phát triển đến mức cực đại
sau 36h nuôi cấy trong nồi lên men (đồ thị 9).
Tuy nhiên, sau đó mật đꢀ vi khuẩn giảm dần.
So với các nghiệm thức khác thì ở nghiệm thức xuất vaccine tốt nhất thông qua tỷ lệ bảo hꢀ của
với lượng khí thổi vào là 8 lít/phút cho thấy vi
khuẩn tăng nhanh mật đꢀ sau 30h nuôi cấy, sau
đó có sự biến đꢀng tăng giảm nhưng vẫn duy trì
ở mức mật đꢀ cao cho đến 48h nuôi cấy trong
nồi lên men. Nghiệm thức có lượng khí thổi vào
2 lít/phút cho thấy có giá trị OD thấp nhất so
với các nghiệm thực khác ở hầu hết các điểm
thu mẫu.
các nghiệm thức này. Trong quá trình thực hiện
thí nghiệm này chúng tôi cũng thu mẫu kiểm tra
OD và mật đꢀ vi khuẩn cho từng nghiệm thức.
Kết quả giá trị OD và số lượng tế bào/ml ở các
nghiệm thức (đồ thị 11 và 12) cho thấy ở tốc
đꢀ khuấy 200 vòng/phút và 150 vòng/phút với
lượng khí thổi vào 8 lít/phút vi khuẩn phát triển
tốt hơn so với nghiệm thức có tốc đꢀ khuấy như
trên nhưng lượng khí thổi vào 6 lít/phút. Bên
cạnh đó, số lượng tế bào bắt đầu phát triển mạnh
trong thời gian 33-36 giờ và bắt đầu giảm dần
đến thời điểm 39 giờ. Trong khoảng thời gian
33-39 giờ thu sinh khối vi khuẩn và sốc nhiệt
kiểm tra khả năng bảo hꢀ của vaccine ở 3 thời
điểm 33, 36, 39 giờ với điều kiện trục khuấy
150, 200 vòng/phút và lượng khí thổi vào 6 và 8
lít/phút. Ở phần sản xuất vaccine cho thí nghiệm
này vi khuẩn được sốc nhiệt ở 41oC trong thời
gian 30 (dựa trên kết quả các nꢀi dung khác
thuꢀc phạm vi nghiên cứu của đề tài này)
Kết quả thu mẫu cấy trải đĩa trên môi
trường BHIA cho thấy mật đꢀ vi khuẩn cao
nhất ở nghiệm thức có tốc đꢀ khuấy là 200
vòng/phút và lượng khí thổi vào là 6 lít/phút
(đồ thị 10). Tiếp theo đó là 200 vòng/phút và
lượng khí thổi vào là 8 lít/phút. Cũng giống
như kết quả đo OD, mật đꢀ vi khuẩn ở lượng
khí thổi vào 2 lít/phút là thấp nhất. Điều này
cho thấy đối với vi khuẩn hiếu khí thì oxy rất
cần thiết cho sự phát triển.
3.6. Sản xuất vaccine bất hoạt thông qua
sốc nhiệt protein trong vaccine
Đồ thị 11. Giá trị OD của E. ictaluri khi nuôi cấy
trong nồi lên men với tốc đꢀ khuấy 150 và 200 vòng/
phút ở các mức lượng khí thổi vào 6 và 8 lít/phút
Đồ thị 12. Mật đꢀ E. ictaluri khi nuôi cấy trong nồi
lên men với tốc đꢀ khuấy 150 và 200 vòng/phút ở
lượng khí thổi vào 6 và 8 lít/phút
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
117
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Kết quả tỷ lệ chết được trình bày ở đồ thị Heart Infusion (BHI) với nhiều nồng đꢀ muối
13 cho thấy tỷ lệ chết các nghiệm thức với trục khác nhau Hajmeer và ctv (2006) tìm thấy nhiều
khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi vào 6lít/ tế bào bị tổn thương ở nồng đꢀ muối 5-10%.
phút tại thời điểm thu mẫu 36, 39 giờ và trục
khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi vào 8 tại
thời điểm thu mẫu 39 giờ có tỷ lệ chết dưới 50%
và khác biệt đáng kể với các nghiệm thức còn
lại (p<0,05). Ngoài ra, tỷ lệ RPS (%) cho thấy tỷ
lệ bảo hꢀ của vaccine ở nghiệm thức 200-6-36H
(200 vòng/phút, lượng khí thổi vào 6lít/phút,
thu mẫu ở thời gian 36 giờ) là 53%, trong khi
đó các nghiệm thức 200-6-39H, 200-8-39H lần
lượt là 49,4% và 48,2%. Các nghiệm thức còn
lại dao đꢀng 23%-33%. Điều này có thể khẳng
định pH môi trường cho quá trình lên men, tốc
đꢀ khuấy, lượng khí thổi vào và thời gian thu
hoạch vi khuẩn có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả
của vacvine.
Theo Jiang và Chai (1996), sự khác biệt
về tổng số vi khuẩn đếm được trên môi trường
chọn lọc và không chọn lọc phản ánh số lượng
tế bào bị tổn thương do yếu tố vật lý hoꢁc hóa
học. Lee và ctv (2006) mô tả ảnh hưởng của đꢀ
mꢁn và pH lên khả năng mọc của V. parahaemo-
lyticus trên môi trường TCBS. Nhóm tác giả
này đi đến kết luận rằng PBS-3% NaCl (pH 6.6)
thích hợp nhất cho V. parahaemolyticus phát
triển. Sự khác biệt về môi trường có thể dẫn
đến vận tốc phát triển khác nhau. So sánh 4 loại
môi trường nuôi cấy V. vulnificus (1) cellobiose-
colistin (CC) agar, (2) Vibrio vulnificus medium
(VVM), (3) a modification ofVVM agar (VVMc
agar), và môi trường TCBS, Cerdà-Cuéllar và
ctv (2001) tìm thấy VVMc
agar là môi trường tốt nhất
cho V. vulnificus. Kết quả
ở đồ thị 4.3 cho thấy ở môi
trường BHIB E. ictaluri
phát triển mạnh hơn so với
các môi trường còn lại. Đꢁc
biệt đối với môi trường
Hottinger giá trị OD ở các
thời điểm thu mẫu rất thấp
và hầu như vi khuẩn không
phát triển trong suốt thời
gian thí nghiệm. Có thể là
đối với môi trường này và
với lượng vi khuẩn cấy vào ban đầu ít làm ảnh
hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn.
Đồ thị 13. Tỷ lệ chết cꢀng dồn cá thí nghiệm
sau khi được tiêm các nghiệm thức vaccine
khác nhau và gây nhiễm với E. ictaluri
Nghiên cứu ảnh hưởng của khẩu phần dinh
dưỡng đến tăng trưởng, thành phần các chất
trong cơ thể, các chỉ tiêu huyết học và đꢁc biệt
là khả năng đề kháng với Edwardsiella ictaluri
của cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus, Lim và ctv
(2009) cũng đã dùng môi trường BHIB để tăng
sinh vi khuẩn cho thí nghiệm gây cảm nhiễm.
TSB được nhóm tác giả Crumlish và ctv (2002)
sử dụng làm môi trường tăng sinh E. ictaluri
IV. THẢO LUẬN
Sự khác biệt về tốc đꢀ phát triển của vi
khuẩn trên các loại môi trường khác nhau.
Điều này cũng được ghi nhận ở các nghiên
cứu khác khi sử dụng các loại môi trường khác
nhau. Khi cấy Escherichia coli O157:H7 và
Staphylococcus aureus trong môi trường Brain
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
118
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
trong nghiên cứu phân lập định danh tác nhân môi trường sử dụng và có bổ sung hay không bổ
gây bệnh gan thận mủ trên cá tra thu tại ĐBSCL. sung các chất ức chế. Việc nghiên cứu đường
Các nghiên cứu trong nước cho thấy BHIB đã môi trường nuôi cấy thích hợp và đường cong
được mꢀt số tác giả dùng để tăng sinh E. ictaluri sinh trưởng trong đề tài này giúp cho việc quyết
như Phạm Công Thành (2010), Nguyễn Quốc định thời gian thu hoạch vi khuẩn chuẩn bị cho
Bình và ctv (2010), Nguyễn Hữu Thịnh và ctv phản ứng gây bệnh thực nghiệm, các phản ứng
(2009). Tuy nhiên các tác giả này không có gây sốc hoꢁc thu vi khuẩn để sản xuất vaccine.
nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của E.
ictaluri trên các loại môi trường mà chúng tôi sử
dụng trong thí nghiệm này.
Qua khảo sát cho thấy ở tốc đꢀ 250 vòng/
phút mꢁc dù OD có giá trị cao nhất nhưng số
khuẩn lạc trên đĩa thạch không khác biệt lớn
Theo Natha và ctv (2009) khi nghiên cứu so với tốc đꢀ khuấy 200 vòng/phút. Sự khác
sự phát triển của E. ictaluri cho thấy loài vi biệt này có thể là do khi đo mật đꢀ OD có cả vi
khuẩn này không có khả năng phát triển trên khuẩn chết trong canh khuẩn. Hơn nữa, với tốc
môi trường BHIB ở pH thấp. Tuy nhiên, khi có đꢀ khuấy mạnh trong nồi lên men sẽ làm lượng
bổ sung thêm nguồn urea thì vi khuẩn này có bọt nhiều và việc điều chỉnh lượng khí trong nồi
khả năng phát triển ở pH = 5. Shotts và Waltman lên men trở nên khó khăn hơn.
(1990) khi nghiên cứu phát triển của E. ictaluri
trên môi trường Edwardsiella ictaluri agar cũng
chọn pH = 7-7,2. Các dẫn liệu này cho thấy kết
quả của thí nghiệm này khá tương thích với các
kết quả trước đây nghiên cứu pH lên sự phát
triển của E. ictaluri. Theo Collins và Thune
(1996) khi khảo sát sự phát triển của E. ictaluri
trên môi trường pha chế có bổ sung nhiều thành
phần bao gồm khoáng, vitamine, acid amine,...
với các giá trị pH khác nhau cho thấy mật đꢀ vi
khuẩn cao nhất ở pH = 7-7,5. Ở các giá trị pH
khác quan sát có sự giảm về mật đꢀ vi khuẩn từ
23-61%. Đꢁc biệt không thấy sự phát triển của
vi khuẩn ở pH = 4 và 9. Điều này cũng phù hợp
với nghiên cứu của Plumb và Vinitnantharat cho
thấy khoảng pH thích hợp cho E. ictaluri phát
triển trên môi trường BHI là 7-7,5.
V. KẾT LUẬN
E. ictaluri có thể phát triển trên các môi
trường Nutrient Broth (NB), Brain Heart
Infusion Broth (BHIB), Tryptic Soy Broth
(TSB) nhưng phát triển tốt nhất trên BHIB.
E. ictaluri phát triển tốt ở pH = 6. Tuy
nhiên, pH vừa thích hợp cho sự phát triển và
duy trì đꢀc lực của của E. ictaluri là 7,0.
Liều vaccine 3 x 109 có khả năng kích
thích sinh miễn dịch và bảo hꢀ cho cá với tỷ lệ
chết khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm
đối chứng.
Tốc đꢀ khuấy 200 vòng/phút, lượng khí thổi
vào 6 phút/lít cho sự phát triển và kích thích sinh
miễn dịch tốt của E. ictaluri với RPS = 53%.
Tất cả các loài vi khuẩn đều có thời gian
thích nghi với môi trường trước khi trãi qua pha
phát triển theo cấp số nhân, khoảng thời gian
này dài hay ngắn tùy thuꢀc vào loài vi khuẩn.
Nghiên cứu trênE. ictaluri cho thấy loài vi khuẩn
này phát triển chậm hơn so với các loài vi khuẩn
khác. Vì vậy phase lag thường kéo dài hơn 10h.
Israil và ctv (2009) theo dõi đường cong sinh
trưởng của Vibrio ghi nhận pha lag mất khoảng
6-8h. Nhóm tác giả này cũng ghi nhận điễn biến
đường cong sinh trưởng khác nhau tùy theo loại
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Trọng Bình, Vũ Thị
Thanh Hương, Dương Vân Anh, Trần Hạnh Triết,
Trần Thị Thanh Xuân, Đinh Thị Cao Khánh, Võ
Hy Lan Anh, Văn Xuân Thành, Trần Thị Thanh
Thanh, 2010. Các hướng nghiên cứu về vaccine
phòng bệnh gan thận mủ cho cá Tra đang được
triển khai tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học
Thành phố Hồ Chí Minh. Hꢀi nghị Công Nghệ
Sinh Học toàn quốc, Tp.HCM ngày 02/12/2010.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
119
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Phạm Công Thành, 2010. Khảo sát đáp ứng miễn
Lim, C., Yildirim-Aksoy, M. and Klesius, P.H., 2009.
Growth Response and Resistance to Edwardsiella
ictaluri of Channel Catfish, Ictalurus punctatus,
Fed Diets Containing Distiller’s Dried Grains
with Solubles. Journal of the World Aquaculture
Society 40 (2), 182-193.
dịch của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)
nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Luận văn
Cao học trường Đại Học Nông Nông Tp.HCM.
Tài liệu tiếng Anh
Cerdà-Cuéllar, M., Permin, L., Larsen, J.L. and
Blanch, A.R., 2001. Comparison of selective
media for the detection of Vibrio vulnificus
in environmental samples. Journal Appllied
Microbiology 91, 322-327.
Natha, J. B., Judith, B. B., and Ronald, L.T.,
2009. Edwardsiella ictaluri Encodes an
Acid-Activated Urease That Is Required for
Intracellular Replication in Channel Catfish
(Ictalurus punctatus) Macrophages. Applied and
Environmental Microbiology 75 (21), 6712-6720.
Plant, J., 2009. A mutation in Thermosensitive Male
Sterile 1, encoding a heat shock protein with
DnaJ and PDI domains, leads to thermosensitive
gametophytic male sterility in Arabidopsis. Mar
57(5), 870-82.
Collines, L.A. and Thune, R.L., 1996. Development
of a Defined Minimal Medium for the Growth of
Edwardsiella ictaluri. Applied and Environemntal
Microbiology 62(3), 848-852.
Crumlish, M., Dung, T., Turnbull, J., Ngoc, N. and
Ferguson, H., 2002. Identification of E. ictaruli
from the diseased freshwater catfish Pangasius
hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong
Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25,
733-736.
Shotts, E. B., andWaltman, W. D., 1990. “AMedium for
The Selective Isolation of Edwarsiella ictaluri”.
Journal of Wildlife Diseases 26 (2), 214-218.
Yeong, Y. S., Van Damme, E. J. M., Sorgeloos, P., and
Bossier, P., 2007. Non-lethal heat shock protect
gnotobiotic Artemia franciscana larvae against
virulent Vibrios. Fish & Shellfish Immunology
22, 318-326.
Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J.L. and Fung,
D.Y.C., 2006. Impact of sodium chloride on
Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus
aureus analysed using transmission electron
microscopy. Food Microbiology 23, 446-452.
Yeong, Y. S., Pineda, C., MacRae, T. H., Sorgeloos,
P., and Bossier, P., 2008. Exposure of gnotobiotic
Artemia franciscana larvae to abiotic stress
promotes heat shock protein 70 synthesis and
entăngces resistance to pathogenic Vibrio
campbellii. Cell Stress Chaperones 13(1), 59-66.
Jiang, X., and Chai, T. J., 1996. Survival of Vibrio
parahaemolyticus at low temperatures under
starvation conditions and subsequent resuscitation
of viable, nonculturable cells. Applied
Environmental Microbiology 62, 1300-1305.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
120
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
STANDARDIZATION OF CONDITIONS FOR PRODUCING INACTIVAED
VACCINE IN PREVENTING OF BACILLARY NECROSIS OF PANGASIUS
Le Hong Phuoc1, Vo Hong Phuong1, Nguyen Thi Hien1, Ngo Thi Bich Phuong1,
Nguyen Pham Hoang Huy1, Chung Minh Loi1
ABSTRACT
This study was conducted to standardize the conditions for producing inactivated vaccine in preventing of
Bacillary Necrosis of Pagasius (BNP). The bacterial strain, Edwardsiella ictaluri, was isolated from diseased
fish collected from Mekong Delta with the typical signs of BNP. Edwardsiella ictaluri was cultured in four
different broth medium e.g. Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth
(TSB) và Hottinger. It was found that E. ictaluri grew best in BHIB. The optimal pH for developing and
mentaining the virulence of this bacterial strain is 7.0. Different conditions in the fermentor were also tested.
It was verified that stiring at 200 rpm, oxygen supplied 6 l/min and harvesting of bacteria at 36h resulted in a
good effectiveness in stimulating immune response of striped catfish to Edwardsiella ictaluri. Inactivaed vac-
cine showed no toxic to the stripe catfish. Vaccinated dose of 3 x 109 CFU/fish can stimimlated the immune
reponse of fish as the result of getting RPS = 53%. There was a significant different in mortality between the
control and vaccinated groups (p < 0.05).
Keywords: striped catfish, vaccine, Edwarsiella ictaluri
Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Hảo
Ngày nhận bài: 10/06/2014
Ngày thông qua phản biện: 16/06/2014
Ngày duyệt đăng: 20/6/2014
1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2
Email: lehongphu[email protected]
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 3 - THAÙNG 6/2014
121
12 trang
16660
Free
Bạn đang xem tài liệu "Tối ưu hóa các điều kiện sản xuất vaccine bất hoạt phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- toi_uu_hoa_cac_dieu_kien_san_xuat_vaccine_bat_hoat_phong_ben.pdf
