Luận văn Xác định hàm lượng Crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ LIÊN
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN
TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ
SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ LIÊN
XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CRINAMIDIN
TRONG THUỐC VÀ THỰC PHẨM BẢO VỆ
SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Nguyên Hà
PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo
HÀ NỘI 2018
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận được sự
giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu viên, các anh chị
kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và bạn bè đã dành cho tôi.
Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần
Nguyên Hà và PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo đã giao đề tài, luôn tâm huyết và tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Trần Cao Sơn đã
cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều kiện tối đa giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Cao Công Khánh cùng các anh chị, các
bạn khoa Nghiên cứu thực phẩm, khoa Độc học & dị nguyên, khoa Chất lượng, phụ
gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện
luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ
môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy
và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng
hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tôi
những ngày qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 28 tháng 03 năm 2018
Học viên
Lê Thị Liên
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
PHẦN 1. TỔNG QUAN............................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật.........................................................................................3
1.1.4. Tác dụng sinh học.........................................................................................5
1.2. Tổng quan về crinamidin................................................................................5
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu....................................................................................15
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ................................................................................15
2.2.1. Chất chuẩn..................................................................................................15
2.2.2. Hóa chất, dung môi.....................................................................................16
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .........................................................................................16
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu..............................................................................17
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu.............................................................................21
crinamidin bằng GC-MS/MS ................................................................................29
3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống .......................................................................39
3.2.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc...............................................................................40
3.2.3. Khoảng tuyến tính.......................................................................................44
3.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ....................................................45
3.2.5. Độ lặp lại ....................................................................................................46
3.2.6. Độ thu hồi ...................................................................................................48
Việt Nam IV ..........................................................................................................52
phương pháp .........................................................................................................54
phương pháp .........................................................................................................55
PHẦN 4. BÀN LUẬN..............................................................................................61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................64
Kết luận .................................................................................................................64
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh)
Acetonitril
Viết tắt
ACN
AOAC
Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức
(Association of Official Analytical Communities)
Điện di mao quản (Capillary electrophoresis)
Cloroform
CE
CHCl3
DĐVN IV
EI
Dược điển Việt Nam IV
Bắn phá electron (Electron ionization)
Sắc ký khí (Gas Chromatography)
Acid hydrocloric
GC
HCl
H3PO4
HPLC
LOD
LOQ
MEKC
MeOH
m/z
Acid phosphoric
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)
Giới hạn phát hiện (Limit of detection)
Giới hạn định lượng (Limit of quantification)
Sắc ký điện động micell (Micellar electrokinetic chromatography)
Methanol
Tỷ số khối lượng và điện tích của ion (Mass-to-charge ratio)
Giám sát đa phản ứng (Multiple reaction monitoring)
Khối phổ (Mass Spectrometry)
MRM
MS
NH3
Amoniac
NXB
PDA
RSD
Nhà xuất bản
Dãy diod quang (Photodiode array)
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)
Chiết lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction)
Thời gian lưu
SFE
tR
TNHC
TPBVSK
UV-VIS
Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
Thực phẩm bảo vệ sức khỏe
Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visible)
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 3.3: Điều kiện tối ưu hóa GC-MS/MS .............................................................28
Bảng 3.4: Khảo sát quy trình xử lý mẫu ...................................................................29
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu.......................................................30
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu............................................................33
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu.......................................................35
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết ......................................................37
phương pháp xây dựng..............................................................................................52
Bảng 3.21: Kết quả phân tích hàm lượng crinamidin trong mẫu chuẩn và thử bằng
phương pháp tiêu chuẩn và phương pháp xây dựng.................................................56
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin ....................................................................6
Hình 3.2: Phổ khối của cafein sau khi bắn phá ion..................................................23
Hình 3.14: Quy trình xử lý mẫu tối ưu......................................................................39
Hình 3.15: Sắc ký đồ dung môi CHCl3 .....................................................................41
Hình 3.23: Sắc ký đồ độ lặp lại trên nền trà túi lọc..................................................48
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội, mô hình bệnh tật ngày càng trở nên phức
tạp. Bệnh tật không chỉ làm rút ngắn tuổi thọ mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến chất
lượng cuộc sống con người. Khoa học và y – dược học ngày nay đã có những bước
tiến vượt bậc và đạt được nhiều thành tựu to lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị
bệnh. Sự phát triển này đã góp phần phong phú hóa số lượng và đa dạng hóa chủng
loại thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) trên thị trường, trong đó thuốc
và sản phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày càng tỏ ra ưu thế và chiếm được niềm tin
của người sử dụng vì sự an toàn của các hợp chất thiên nhiên.
Tại Việt Nam, với mục tiêu bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân
dân, nhiều chính sách, chiến lược quốc gia trong lĩnh vực y – dược học được đưa ra,
trong đó bảo tồn và phát triển ngành dược liệu Việt Nam là một định hướng quan
Thủy tiên (Amaryllidaceae) là loại dược liệu quý được biết đến với tác dụng hỗ trợ
nữ hoàng cung (TNHC) chứa nhiều thành phần, trong đó đáng quan tâm nhất là
nhóm alkaloid vì có tác dụng sinh học, điển hình như crinamidin, ambellin,
lycorin,...Sự hiện diện của TNHC được biểu thị qua hoạt chất đặc trưng điển hình,
đồng thời là hoạt chất chính trong cây cho tác dụng sinh học là crinamidin. Chế
phẩm chứa TNHC được bán tại các nhà thuốc, quầy thuốc, cửa hàng đông y, thậm
chí cửa hàng tạp hóa và các kênh bán hàng online. Mỗi chế phẩm lại có một công
thức bào chế khác nhau, từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, hệ quả là hàm
lượng crinamidin trong từng chế phẩm cũng không như nhau. Trong khi tiêu chuẩn
cho các chế phẩm này chưa được hoàn thiện, nhà sản xuất đã lợi dụng kẽ hở để trục
lợi, sử dụng nhiều nguồn nguyên liệu không rõ nguồn gốc đưa vào sản xuất, sử
dụng các nguyên liệu khác thay thế mà không có tác dụng sinh học theo công bố
trên nhãn. Đây cũng chính là mấu chốt của vấn nạn thuốc và TPBVSK thật hay giả
hiện đang là chủ đề mang tính thời sự, nhận được nhiều sự quan tâm của báo chí và
dư luận thời gian qua. Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa chất lượng chế phẩm chứa TNHC
là vô cùng quan trọng và cấp thiết.
1
Hiện nay, Dược điển Việt Nam IV bản bổ sung năm 2015 quy định hàm
lượng crinamidin (C17H19NO5) trong nguyên liệu lá TNHC không thấp hơn 0,08%
tính theo khối lượng khô kiệt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
định chất lượng sản phẩm TNHC, hàm lượng crinamidin là đại lượng quy chiếu
được lựa chọn. Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-
MS/MS) là phương pháp ưu việt, có khả năng xác định các hợp chất hữu cơ trong
hỗn hợp với độ phân giải cao, chọn lọc và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp
HPLC. GC-MS/MS là phương pháp rất thích hợp cho việc định lượng hoạt chất
trong các chế phẩm thuốc và TPBVSK với nền mẫu phức tạp đồng thời hàm lượng
crinamidin giảm nhiều lần so với hàm lượng trong nguyên liệu lá TNHC.
Để góp phần kiểm soát chất lượng của các chế phẩm trên thị trường, đảm bảo
quyền lợi của người sử dụng và sự chặt chẽ trong quản lý, chúng tôi thực hiện đề tài
nghiên cứu: “Xác định hàm lượng crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ
sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ”, với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng crinamidin trong thuốc
và TPBVSK bằng sắc ký khí khối phổ.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng crinamidin trong
thuốc và TPBVSK.
2
Phần 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây trinh nữ hoàng cung
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây trinh nữ hoàng cung (TNHC), còn gọi là hoàng cung trinh nữ, tây nam
văn châu lan, thập bát học sĩ (Trung Quốc), tỏi Thái Lan, tỏi lơi lá rộng, có tên khoa
TNHC là một loại cây cỏ, thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 –
15cm, bẹ lá úp vào nhau thành một thân giả dài 10 – 15cm, có nhiều lá mỏng kéo
dài từ 80 – 100cm, rộng 3 – 8cm, hai bên mép lá lượn sóng. Gân lá song song, mặt
trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có
màu đỏ tím. Hoa mọc thành tán gồm 6 – 18 hoa, trên một cán hoa dài 30 – 60cm.
Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ, từ thân hành mọc rất nhiều củ con có thể
Hình 1.1: Cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)
3
1.1.2. Nguồn gốc và phân bố, bộ phận sử dụng
TNHC là cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và
phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới. Cây TNHC
hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia,
Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc. Ở Việt Nam, cây mọc
hoang ven suối trong rừng một số nơi thuộc tỉnh Đồng Nai và Bà Rịa-Vũng Tàu, tự
mọc và được trồng chủ yếu ở Huế, Đà Nẵng, Nha Trang và một số tỉnh phía Nam,
1.1.3. Thành phần hóa học của cây Crinum latifolium L.
Các nhà khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam đã nghiên cứu thành phần
hóa học của cây Crinum latifolium L. như sau:
+ Crinum latifolium L. Ấn Độ: 11-O-Acetylambellin, 11-O-Acetyl-1,2-β-
epoxyambellin, Ambelin, Crinafolidin, Crinafolin, (-) 2-Epilycorin, 2-
Epipancrassidin, 1,2-β-epoxyambellin, Hippadin (Pratorin, Alkalois N3), Latindin,
Latisodin, Latisolin (Latisodin-O-β-D-glucopyranosyl), (-) Lycorin, (-) Lycorin-1-
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản: 3-O-Acetylhamayn, (-) Acetyllycorin,
Cheryllin (S), (+) Crinamin, (-) Crinin (Vittatin, Crinidin), Hamayn (Bulbispermin,
+ Crinum latifolium L. Việt Nam: 9-Octadecenamid, Dihydro-oxo-
demethoxyhaemanthamin, Augustamin, Oxoassoanin, Crinan-3-α-ol, Buphannidrin,
Powellin, Undulatin, Ambellin, 6-hydroxybuphannidrin,
1β,2β-epoxyambellin, 6-hydroxycrinamidin, Epoxy-3,7-dimethoxycrinan-11-one,
Lycorin và Pratorin (Hippadin) và các flavonoid: 4’7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan,
Từ lá cây TNHC, Võ Thị Bạch Huệ cũng đã tách được 18 vết bằng kỹ thuật
sắc ký ghép khối phổ, trong đó xác định được cấu trúc của 3 vết là ambellin,
4
crinamidin và 6 – OH – crinamidin sau khi so sánh thời gian lưu, khối phổ với 3
Thành phần hóa học khác của cây Crinum latifolium L.
+ Crinum latifolium L. Nhật Bản có Glucan a và Glucan b.
+ Crinum latifolium L. Việt Nam có 32 chất bay hơi và saponin, acid hữu cơ,
amino acid, p-hydroxycinnamat metyl, 3,4’-dihydroxycinnamat ethyl, keampferol-
3-4-di-O-β-D-glucopyranosit.
1.1.4. Tác dụng sinh học
Ở Ấn Độ, người ta dùng bẹ của cây xào nóng giã đắp làm thuốc trị bệnh thấp
khớp; cũng dùng đắp mụn nhọt và áp xe để gây mưng mủ. Còn dịch lá dùng làm
Từ những năm 1989 – 1990, người dân Việt Nam đã biết cách sử dụng
TNHC để chữa những trường hợp u xơ và ung thư cổ tử cung (ở phụ nữ) và ung thư
TNHC còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh u xơ tử cung, ung thư vú, tử
cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt, viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa. Hoạt tính
chống oxi hóa, giảm đau, chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế
Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, E. Zvetkova và cộng sự cũng đã chứng
minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam có thể kích thích hữu hiệu sự
sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế
Lá tươi và thân hành dùng ngoài, hơ nóng xoa bóp vào chỗ sưng đau do thấp
1.2. Tổng quan về crinamidin
Crinamidin là alkaloid trong cây TNHC (Crinum latifolium L.), có công thức
cấu tạo như hình 1.2.
5
Hình 1.2: Công thức cấu tạo crinamidin
Bảng 1.1: Tính chất lý hóa và tác dụng sinh học của crinamidin
Crinamidin
Công thức phân tử
C17H19NO5
(Khối lượng phân
tử)
(M = 317,34 g/mol)
Tên IUPAC
(1β,2β,3α)-7-Methoxy-1,2-epoxycrinan-3-ol
Phổ IR có các băng hấp thụ cực đại (cm-1) ở 3200 – 3400 (-
OH), 1499, 1278 (epoxy), 1035, 918 (-OCH2O-), 802 (epoxy).
Phổ UV – VIS có bước sóng hấp thụ cực đại ở 220 và 285 nm.
Phổ HR – MS cho mảnh có số khối 318,1369 m/z tương ứng
Phổ hấp thụ
Crinamidin là chất bột kết tinh màu trắng, điểm chảy 215 –
Tính chất vật lý, hóa
học
217oC,
6
Crinamidin là một alkaloid trong cây TNHC, cùng với các
alkaloid khác cho tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tử cung, ung
thư tuyến tiền liệt, kháng khối u, kháng viêm, chống oxi hóa
Các nhà khoa học đã chứng minh tác dụng đối một số bệnh
ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và các bệnh
viêm da lở loét, dị ứng mẩn ngứa, chống oxi hóa, giảm đau,
chống viêm, chống lại sự tăng sinh quá mức của các tế bào và
thành mạch máu của các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của
Tác dụng sinh học
1.3. Một số nghiên cứu xác định crinamidin
Các nghiên cứu xác định crinamidin bao gồm khảo sát, định tính, định lượng
và tinh chế, trong đó có tiêu chuẩn DĐVN IV đưa ra quy định về hàm lượng
crinamidin trong lá TNHC. Kỹ thuật chính được sử dụng để định lượng là HPLC.
Kỹ thuật GC-MS được sử dụng để khảo sát thành phần trong cây và định tính. Chưa
có nghiên cứu về định lượng crinamidin bằng GC-MS/MS. Các nghiên cứu xác
định crinamidin được tổng hợp trong bảng 1.2.
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu xác định crinamidin và nhận xét
Tài
Phương pháp nghiên cứu
Kết quả
Nhận xét
liệu
Thời gian lưu của Thời gian sắc ký
crinamidin khoảng dài, quy trình chiết
Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C18. Pha động: ACN – đệm
phosphat 100 mM, pH 3,0.
Gradient thành phần pha động
(0 – 65 phút). Detector UV 285
nm. Tốc độ dòng: 1 – 1,5
mL/phút. Thể tích tiêm: 50 µL.
33 phút.
chưa thực sự tối
Khoảng tuyến tính ưu, cụ thể:
của crinamidin từ - Quy trình áp
30 µg/mL đến 300 dụng cho lá: phải
µg/mL.
siêu âm và lọc
7
LOQ trong lá nhiều lần, phương
Phương pháp xử lý mẫu:
- Lá: Làm ẩm bột dược liệu bằng
NH3, sau 1 giờ, thêm 50 mL
CHCl3 – MeOH (3:1), siêu âm 30
phút, lọc. Bã chiết thêm 4 lần. Cô
dịch chiết. Hòa cắn bằng 20 mL
HCl 0,1N.
TNHC
là
4,2 pháp chưa có bước
µg/mL, trong viên loại tạp.
nang là 4,9 µg/mL. - Quy trình áp
dụng cho viên
nang: quy trình
chiết xuất mất
nhiều thời gian do
- Viên nang: Làm ẩm bột bằng
NH3, sau 1 giờ, chiết Soxhlet,
ngâm qua đêm. Đun hồi lưu 5
giờ. Cô dịch chiết. Hòa cắn bằng
HCl nhiều lần. Kiềm hóa đến pH
10 – 11, lắc với CHCl3 5 lần. Cô
dịch CHCl3. Hòa cắn bằng 20 mL
HCl 0,1N.
thời gian ngấm kiệt
kéo dài và một số
giai đoạn tiến hành
làm lặp nhiều lần
Yêu cầu hàm Thời gian sắc ký
lượng crinamidin dài, quy trình chiết
không nhỏ hơn chưa thực sự tối
0,08% (theo khối ưu, phải siêu âm và
lượng) crinamidin lọc nhiều lần,
(C17H19NO5) tính phương pháp chưa
theo dược liệu khô có bước loại tạp.
kiệt.
Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C18. Pha động: ACN – đệm
phosphat 100 mM, pH 3,0.
Gradient thành phần pha động
(0 – 65 phút). Detector UV, bước
sóng phát hiện 285 nm.
Tốc độ dòng: 1 – 1,5 mL/phút.
Thể tích tiêm: 50 µL.
Phương pháp xử lý mẫu:
Làm ẩm bột lá bằng NH3, sau 1
giờ, thêm 50 mL CHCl3 – MeOH
(3:1), siêu âm 30 phút, lọc. Bã
được chiết thêm 4 lần. Cô dịch
chiết. Hòa cắn bằng HCl 0,1N.
8
Xây dựng được bộ Cao alkaloid toàn
dữ liệu chuẩn phần có thể chất
crinamidin và thiết sạch, ít tạp nhày,
lập được 500 mg nhựa, tuy nhiên hệ
chất chuẩn với độ thống chiết SFE
tinh khiết 98,74%. không phổ biến tại
các phòng thí
Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C8. Pha động: MeOH –
H3PO4 pH 2,3 (15 : 85). Nhiệt độ
cột 40oC. Thể tích tiêm 10 µL.
Detector PDA 214 nm.
Phương pháp xử lý mẫu:
Bột lá TNHC được chiết với CO2
lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết cao
toàn phần bằng cách ngấm kiệt.
GĐ1: Làm ẩm bột lá TNHC bằng
cồn 96% trong 12 giờ. Nạp vào
bình chiết, thu hồi dung môi được
cao SFE.
nghiệm, vận hành
phức tạp, tốn kém.
Thời gian chiết
xuất kéo dài.
GD2: Chiết cao alkaloid toàn
phần bằng phương pháp ngấm
kiệt.
Crinamidin
thời gian lưu ~ 6,8 dựng để thiết lập
phút. chuẩn crinamidin
cho Quy trình được xây
Điều kiện phân tích HPLC:
Cột C8. Pha động:
MeOH – H3PO4 0,1% (35 : 65).
Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Nhiệt
độ cột: 30oC. Thể tích tiêm: 20
µL.
Thu được 1,5 g và phương pháp
crinamidin đạt tiêu này chưa thật sự
chuẩn chuẩn gốc phù hợp để cải tiến
với hàm lượng thành phương pháp
Phương pháp xử lý mẫu:
Bột lá TNHC (100kg) được chiết
ngấm kiệt với ethanol 96%, cô
thu hồi dung môi được cao
ethanol.
99,85%.
định
lượng
crinamidin trong
TNHC do thời gian
chiết xuất kéo dài.
Tiếp tục chiết xuất thu được cao
chiết pH = 4 (2,5kg), cao chiết
9
pH = 9 (210g).
Cao pH 9 (130g) được sắc ký cột
nhanh (VLC) trên silicagel với hệ
dung
môi:
dicloromethan –
MeOH.
Xây dựng được Kết
hợp
chiết
và
Điều kiện phân tích HPLC:
Cột: C8. Pha động: MeOH –
H3PO4 pH 3,0 và 0,2%
Triethanolamin.
quy trình định alkaloid
lượng đồng thời 6 flavonoid,
định
alkaloid
phương
HPLC.
bằng lượng đồng thời
pháp được
alkaloid
nhiều
và
Gradient thành phần pha động (0-
30 phút). Detector PDA ở 214
nm.
Chiết SFE thu flavonoid.
được
Tuy
alkaloid nhiên trang thiết bị
0,24%, ngấm kiệt SFE tốn kém, vận
được 0,60%. hành phức tạp, cần
Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Thể tích
tiêm: 10 µL. Nhiệt độ cột: 40oC.
Phương pháp xử lý mẫu
(HPLC)
Không có sự khác phải thực hiện
biệt kết quả định nhiều khảo sát để
lượng alkaloid và tìm các thông số
flavonoid trong lá tối ưu áp suất, thời
Chiết cao cồn: làm ẩm dược liệu
bằng dung môi chiết 12 giờ,
ngâm dược liệu 24 giờ. Gộp dịch
chiết, cô cách thủy được cao cồn.
Hòa tan cao cồn trong HCl. Lắc
dịch acid với ethyl acetat. Kiềm
hóa dịch acid, lắc với CHCl3. Cô
thu hồi dung môi CHCl3 được
phân đoạn alkaloid.
TNHC
bằng gian, nhiệt độ, khối
pháp lượng mẫu, dung
phương
HPLC hoặc CE.
môi hỗ trợ và tỷ lệ
dung môi hỗ trợ.
Phương pháp này
tốn nhiều thời gian
và chi phí cao, khó
phổ biến trên thực
tế.
Phương pháp xử lý mẫu (CE):
Chiết SFE bột lá thu được cao
SFE và dược liệu sau SFE. Hòa
tan cao trong acid, kiềm hóa, lắc
Alkaloid trong cây
10
với CHCl3 được phân đoạn
alkaloid.
tồn tại chủ yếu ở
dạng muối cũng là
trở ngại lớn trong
chiết SFE.
Dược liệu sau SFE được chiết
ngấm kiệt với cồn. Lấy phần dịch
chiết đã loại cồn, acid hóa, lắc
với ethyl acetat. Dịch chiết được
kiềm hóa, thêm CHCl3 được phân
đoạn alkaloid.
Kết quả (A) tách Nghiên cứu này
được 17 vết có nêu phương thức
thời gian lưu từ 15 chuyển đổi
Điều kiện sắc ký:
Cột DB 15m silica tan chảy, khí
mang heli. Chương trình nhiệt
60oC/phút, tăng đến 120oC
(30oC/phút) rồi tăng đến 320oC
(10oC/phút), 1µL không chia
dòng (1 phút).
đến 35 phút. Còn alkaloid chiết xuất
(B) tách không tốt từ lá TNHC thành
nên được tạo thành những chất dễ bay
dẫn chất dễ bay hơi để có thể dễ
hơi để tách bằng dàng tách bằng sắc
sắc ký khí. Kết quả ký khí.
GC – EIMS, cột silica tan chảy
30m x 0,25 mm x 0,25 µm. Tiêm
mẫu chia dòng 1/30, 1 µL, nhiệt
độ interface 280oC. Chương trình
nhiệt 60oC/phút, tăng dần đến
120oC (30oC/phút) rồi tăng đến
320oC (10oC/phút). Thế năng 70
eV. EIMS với nhiệt độ nguồn
200oC, thế năng 70 eV, dòng bẫy
200 µA. Chương trình nhiệt 300C
tăng lên đến 520oC (1oC/giây).
Phương pháp xử lý mẫu:
(B) tách được 18 Nghiên cứu này
vết có thời gian mới chỉ dừng ở
lưu từ 3 đến 15 việc khảo sát sơ bộ
phút, trong đó xác các alkaloid chiết
định được cấu trúc từ cây TNHC, xác
của 3 vết ambellin, định sự hiện diện
crinamidin và 6- của một số chất
hydroxo-
phân lập từ cắn
crinamidin sau khi alkaloid toàn phần
so sánh thời gian (phải qua giai
lưu, khối phổ với 3 đoạn tinh chế) mà
Lá TNHC ngấm kiệt bằng cồn
50o chứa HCl (pH = 6). Dịch
alkaloid đơn chất. chưa
đưa
ra
11
Tải về để xem bản đầy đủ
78 trang
05/04/2022
5100
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Xác định hàm lượng Crinamidin trong thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng sắc ký khí khối phổ", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_van_xac_dinh_ham_luong_crinamidin_trong_thuoc_va_thuc_p.pdf
