Báo cáo tóm tắt Đề tài Nghiên cứu các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ nhằm ứng dụng trong xử lý nước thải từ khu công nghiệp dịch vụ thủy sản Thọ Quang, Đà Nẵng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

NGHIÊN CỨU CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS CÓ KHẢ

NĂNG PHÂN GIẢI HỢP CHẤT HỮU CƠ NHẰM ỨNG DỤNG

TRONG XỬ LÝ NƢỚC THẢI TỪ KHU CÔNG NGHIỆP DỊCH

VỤ THỦY SẢN THỌ QUANG, ĐÀ NẴNG

Mã số: Đ2014-03-65

Chủ nhiệm đề tài: Th.S Nguyễn Thị Lan Phƣơng

Đà Nẵng, tháng 12/2014

1

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Công nghiệp chế biến thủy sản là một trong những

ngành công nghiệp mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nƣớc nói

chung và thành phố Đà Nẵng nói riêng.

Đà Nẵng hiện có 6 khu công nghiệp (KCN) với tổng

diện tích gần 1.150 ha, trong đó KCN dịch vụ thủy sản Đà

Nẵng đƣợc xác định là điểm có nguy cơ gây ô nhiễm cao. Với

đặc tính dòng chất thải là giàu hữu cơ, việc sử dụng các chủng

vi sinh vật có hoạt tính phân giải các chất hữu cơ để xử lý nƣớc

thải thủy sản đƣợc xem là giải pháp hiệu quả.

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus đƣợc biết nhƣ là nhóm vi

khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào cao, nhiều loài Bacillus

phổ biến nhƣ B.cereus, B.sterothermophilus, B.mojavensis,

B.megaterium, B.subtilis,… khi đƣợc bổ sung vào nƣớc thải đã

chứng tỏ hiệu lực phân hủy các chất hữu cơ giàu protein, tinh

bột, lipit, xenlulo cao hơn hẳn so với các chủng tự nhiên khác

sẵn có trong nƣớc thải.

Từ những cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên

cứu các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng phân giải hợp

chất hữu cơ nhằm ứng dụng trong xử lý nước thải từ khu

công nghiệp dịch vụ thủy sản Thọ Quang, Đà Nẵng” nhằm

tuyển chọn đƣợc một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt lực

2

phân giải protein, tinh bột, xenlulo cao trong nƣớc thải, thử

nghiệm đánh giá hiệu quả sử dụng chúng trong mô hình xử lý

nƣớc thải bằng bể hiếu khí, làm cơ sở cho việc ứng dụng vào

xử lý các loại nƣớc thải tại địa phƣơng.

2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Mục tiêu của đề tài là tuyển chọn đƣợc các chủng vi

khuẩn Bacillus có đặc tính phân giải tốt các hợp chất hữu cơ

phân tử lớn từ nƣớc thải khu công nghiệp dịch vụ thủy sản Thọ

Quang, nghiên cứu đặc điểm sinh học của chúng, đồng thời xác

định đƣợc hiệu quả ứng dụng chúng trong quy trình xử lý nƣớc

thải thủy sản bằng mô hình bể xử lý hiếu khí

3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

Về mặt khoa học, kết quả của đề tài sẽ bổ sung thêm cơ sở dữ

liệu về các loài vi khuẩn Bacillus có khả năng phân giải chất

hữu cơ có mặt trong nƣớc thải thủy sản, những đặc điểm sinh

học cũng nhƣ điều kiện nuôi cấy và khả năng sinh hoạt tính

enzyme ngoại bào của chúng, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu

ứng dụng chúng để sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý môi

trƣờng, đặc biệt là xử lý các loại nƣớc thải giàu hữu cơ.

Về mặt thực tiễn, việc phân tích các mẫu nƣớc từ một số nhà

máy chế biến thủy hải sản là cơ sở để đánh giá hiện trạng của

nƣớc thải và xử lý nƣớc thải ở địa phƣơng, đặc biệt là tại một

số địa điểm thuộc các KCN dịch vụ thủy sản trên địa bàn thành

phố Đà Nẵng.

3

Đồng thời, kết quả tuyển chọn và đánh giá hiệu quả sử dụng

chủng vi khuẩn nghiên cứu sẽ là cơ sở cho những ứng dụng

nhằm giải quyết vấn đề chất thải tại địa phƣơng, mà trƣớc tiên

là ứng dụng trong xử lý nƣớc thải thủy sản. Ngoài ra, đề tài còn

góp phần đào tạo sinh viên các ngành Quản lý tài nguyên môi

trƣờng, cử nhân Sinh học và Môi trƣờng, và cử nhân Sƣ phạm

Sinh học.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN BACILLUS

1.3. GIỚI THIỆU VỀ ENZYME AMYLASE, PROTEASE VÀ

CELLULASE

1.3.1. Enzyme amylase

1.3.2. Enzyme protease

1.3.3. Enzyme cellulase

1.4. TỔNG QUAN VỀ NƢỚC THẢI THỦY SẢN

1.5. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ NƢỚC

THẢI

1.5.1. Phƣơng pháp xử lý cơ học

1.5.2. Phƣơng pháp xử lý hóa lý

1.5.3. Phƣơng pháp hóa học

1.5.4. Phƣơng pháp xử lý sinh học

1.6. TỔNG QUAN VỀ KHU CÔNG NGHIỆP DỊCH VỤ

THỦY SẢN THỌ QUANG VÀ THỰC TRẠNG XỬ LÝ

NƢỚC THẢI THỦY SẢN

4

CHƢƠNG 2:

ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN

CỨU

* Đối tƣợng nghiên cứu

-

Nƣớc thải từ các KCN dịch vụ thủy sản phố Đà Nẵng.

Các chủng VK Bacillus sinh hoạt tính protease,

amylase, xellulase có trong nƣớc thải thủy sản

Mô hình xử lý nƣớc thải bằng bể hiếu khí sử dụng các

chủng VSV.

-

* Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 01 đến tháng 12

năm 2014. Trong giới hạn nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tập

trung vào đối tƣợng VK Bacillus và khả năng sinh hoạt tính

phân giải protein, tinh bột, xellulo là thành phần hữu cơ có mặt

trong loại nƣớc thải này. Trong giới hạn về thời gian và điều

kiện của đề tài, chúng tôi thu thập các mẫu nƣớc thải đƣợc lấy

từ khu xử lý nƣớc thải của các nhà máy, xí nghiệp và trạm xử

lý nƣớc thải tập trung KCN dịch vụ thủy sản Thọ Quang, quận

Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.

Nhằm đánh giá hiệu quả ứng dụng chủng VK phân lập

đƣợc trong quá trình xử lý sinh học hiếu khí, chúng tôi tập

trung vào các chỉ tiêu pH, COD, BOD₅và N_tổngqua thời gian

5

xử lý, là các yếu tố chính đƣợc xem xét khi đánh giá tiêu chuẩn

vệ sinh nguồn nƣớc.

* Địa điểm nghiên cứu

Quá trình phân lập, xác định hoạt tính, nghiên cứu đặc

điểm sinh học, sử dụng VSV để xử lý nƣớc thải thủy sản và

phân tích các chỉ số đƣợc tiến hành ở các phòng thí nghiệm

(PTN) khoa Sinh – Môi trƣờng, trƣờng Đại học Sƣ Phạm Đà

Nẵng (PTN Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh; PTN Công nghệ sinh

học; PTN Phân tích môi trƣờng), PTN Đài Khí tƣợng Thủy văn

khu vực Trung Trung Bộ.

Nghiên cứu định danh chủng VK tuyển chọn đƣợc tiến

hành ở PTN Trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh

học, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để thực hiện đƣợc mục tiêu của đề tài, chúng tôi thực

hiện các nội dung nghiên cứu sau:

-

Phân lập, tuyển chọn các chủng VK Bacillus từ nƣớc

thải thủy sản.

-

Khảo sát khả năng sinh hoạt tính enzyme ngoại bào

(protease, amylase, xellulase) của các chủng VK phân

lập đƣợc.

-

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải

protein, tinh bột, xellulo mạnh nhất.

6

-

Nghiên cứu đặc điểm sinh học (hình thái, nhuộm gram,

điều kiện nuôi cấy…) của các chủng VK tuyển chọn.

Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phƣơng

pháp sinh hóa và bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Ứng dụng khả năng phân giải protein của chủng đƣợc

chọn trong quy trình xử lý nƣớc thải ở quy mô phòng

thí nghiệm và so sánh hiệu quả với khi không bổ sung

VSV vào quy trình xử lý.

-

Xử lý số liệu thực nghiệm và đƣa ra kết luận về các

thông số động học của quá trình.

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu ngoài thực địa.

2.3.2. Phƣơng pháp phân lập và giữ giống VSV

2.3.3. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh hoạt tính enzyme

protease của VSV

Để xác định các chủng VSV có hoạt tính protease,

chúng tôi dùng phƣơng pháp đục lỗ thạch. Phƣơng pháp này

dựa trên nguyên tắc: khi bổ sung enzyme protease vào trong lỗ

thạch, chúng sẽ khuếch tán ra môi trƣờng thạch xung quanh,

thủy phân casein có trong môi thạch đĩa, sau một thời gian nhất

định sẽ xuất hiện vòng phân giải màu trong suốt quanh lỗ thạch

này. Dựa vào hiệu số đƣờng kính vào phân hủy và đƣờng kính

lỗ thạch mà ta xác định đƣợc đƣờng kính vòng phân giải, từ đó

xác định đƣợc hoạt tính

7

2.3.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh hoạt tính enzyme

amylase của VSV

Nguyên tắc: trên môi trƣờng chứa tinh bột, nấm mốc sẽ

tiết ra enzyme amylase ngoại bào phân hủy cơ chất để sinh

trƣởng và làm cho môi trƣờng trong hơn khi nhuộm màu bằng

thuốc thử Lugol. Độ lớn của khuẩn lạc và khoảng môi trƣờng

trong suốt phản ánh khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc.

2.3.5. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh hoạt tính enzyme

cellulase của VSV

Để kiểm tra hoạt tính với cellulo, chúng tôi sử dụng

phƣơng pháp thử hoạt tính cellulase trên đĩa thạch có bổ sung

cơ chất CMC (carboxyl methyl cellulo).

2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của VSV

2.3.7. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật

2.3.7.1. Nhuộm Gram

2.3.7.2. Xác định Gram (–)/(+) nhanh với KOH 3%

2.3.7.3. Nhuộm bào tử

2.3.7.4. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số

2.3.7.5. Phƣơng pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR

2.3.7.6. Phƣơng pháp giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự

2.3.7.7. Phƣơng pháp xác lập mô hình tiến hóa

2.3.7.8. Phƣơng pháp xây dựng cây tiến hóa

8

2.3.8. Phƣơng pháp khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh

trƣởng phát triển của VSV.

2.3.8.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH

2.3.8.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ

2.3.9. Phƣơng pháp định lƣợng VSV

Nhằm xác định số lƣợng VSV trên một đơn vị thể tích, chúng

tôi sử dụng phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc trên môi

trƣờng đặc.

2.3.10. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm xử lý nƣớc thải bằng hệ

thống bể xử lý sinh học hiếu khí

Thí nghiệm xử lý nƣớc thải bằng VSV đƣợc tiến hành trên bể

xử lý sinh học Aeroten – pilot KT 11 với dung tích:

-

V_A= 30 lít

V_B= 25 lít

Cấp khí: dùng 1 bơm thổi khí với công suất 40L/phút

đảm bảo lƣợng oxy hòa tan tối ƣu cho quá trình oxy

hóa.

-

Vận tốc dòng chảy đƣợc điều chỉnh nhờ một bơm định

lƣợng sao cho phù hợp với tốc độ oxy hóa, đảm bảo

dòng ra đạt tiêu chuẩn thải:

(COD < 80 mg/l, BOD₅< 50mg/l)

Sau đó bổ sung dung dịch nuôi cấy lắc của chủng VK Bacillus

đƣợc chọn vào hệ thống xử lý nƣớc thải bằng bể xử lý sinh học

hiếu khí với tỉ lệ số lƣợng VK/V_{nƣớc thải}đã đƣợc xác định.

9

2.3.11. Phƣơng pháp xác định pH trong nƣớc thải

2.3.12. Phƣơng pháp xác định COD trong nƣớc thải

2.3.13. Phƣơng pháp xác định BOD₅trong nƣớc thải

2.3.14. Phƣơng pháp xác định N tổng số trong nƣớc thải

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VK TỪ NƢỚC THẢI THỦY

SẢN

Từ 9 mẫu nƣớc thải thủy sản thu đƣợc tại các nhà máy

chế biến thủy sản và từ trạm xử lý nƣớc thải tập trung KCN

dịch vụ thủy sản Thọ Quang tại thành phố Đà Nẵng đã phân lập

đƣợc 31 chủng VK, đƣợc kí hiệu H1, H2, H3, …, H31, có đặc

điểm hình thái khuẩn lạc đặc trƣng

Kết hợp những kết quả nghiên cứu khả năng bắt màu

với thuốc nhuộm Gram, nhuộm bào tử với khóa định loại của

Bergey có thể kết luận chủng tất cả các chủng VK H1 – VK

H31 phân lập đƣợc đều thuộc chi Bacillus. Đó là những trực

khuẩn Gram dƣơng, sinh bào tử và hiếu khí.

3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỦNG VK CÓ HOẠT TÍNH

PROTEASE

Từ 31 chủng VK Bacillus phân lập đƣợc, xác định

đƣợc 15 chủng có hoạt tính protease (sau 48h nuôi cấy lắc).

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỦNG VK CÓ HOẠT TÍNH

AMYLASE

10

Khảo sát 31 chủng VK Bacillus VK H1 --- H31 có khả

năng phân giải tinh bột, chúng tôi xác định đƣợc 12 chủng có

hoạt tính amylase.

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỦNG VK CÓ HOẠT TÍNH

CELLULASE

Sau thời gian nghiên cứu, 6 trong số 31 chủng VK H1 -

-- H31 đƣợc xác định là có hoạt tính xellulase.

3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

CÁC CHỦNG VI KHUẨN TUYỂN CHỌN

Sau khi khảo sát 3 hoạt tính phân giải protein, tinh bột,

xenlulo của 31 chủng VK Bacillus phân lập đƣợc VK H1 ---

VK H31, chúng tôi lựa chọn 2 chủng VK H1 và VK H3 là 2

chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục cho những nghiên cứu

tiếp theo.

3.4.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh

trƣởng của chủng VK H1 và VK H3

3.4.1.1. Ảnh hưởng của pH

Khoảng pH thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng của VK

H1nằm trong khoảng 6,5 – 7,5, VK H3 nằm trong khoảng 7-7,5

(đều thuộc khoảng trung tính). Với chủng VK H1, sinh trƣờng

đạt cực đại ở pH 7, ở các điểm pH 5-5,5 (quá axit) hoặc pH 8,5

(quá kiềm) thì sự sinh trƣởng của chủng VK H1 bị hạn chế

hơn. Điều tƣơng tự cũng xảy ra khi nghiên cứu VK H3: sinh

trƣởng tối ƣu ở pH 7 và khi pH môi trƣờng quá axit (5-5,5) hay

11

quá kiềm (8-8,5) sự sinh trƣởng đều bị ức chế rõ rệt, thể hiện

qua số lƣợng tế bào bị giảm sút.

3.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong khoảng nhiệt độ khảo sát, khả năng sinh trƣởng

của chủng VK H1 và VK H3 tỉ lệ thuận với sự tăng nhiệt độ.

Sinh trƣởng đạt cực đại ở khoảng 30^oC. Tiếp tục tăng nhiệt độ

hơn nữa chỉ số CFU giảm. Nhƣ vậy, nhiệt độ cao quá cũng kìm

hãm sự sinh trƣởng phát triển của chủng VK H1. Khoảng nhiệt

độ thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng của chủng VK H1 là từ

30^oC – 35^oC, VK H3 nằm trong khoảng 30^oC – 37^oC.

3.4.2. Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng sinh hoạt tính

enzyme của VK

Tại mỗi thời điểm nuôi cấy khác nhau, nồng độ

enzyme do các chủng VK H1, VK H3 tiết ra môi trƣờng khác

nhau, tƣơng ứng với hiệu số (D-d), trong đó lớn nhất là sau

48h. Cụ thể, tại thời điểm sau 48h nuôi cấy lắc, đƣờng kính

vòng phân giải enzyme protease là 28 ± 0,5mm, xellulase là 22

± 0,5mm, amylase là 32 ± 0,5mm, lớn hơn nhiều so với kết quả

đo đƣợc tại thời điểm sau 24h và sau 72h. Do đó, có thể xác

định thời điểm sinh hoạt tính enzyme mạnh nhất của chủng VK

H1 và VK H3 là vào khoảng 48h nuôi cấy lắc.

3.4.3. Kết quả nghiên cứu định danh chủng VK H1 và VK H3

3.4.3.1. Kết quả tách chiết, làm sạch ADN tổng số và

nhân bản trình tự DNA với cặp mồi 27F/1492R chủng VK H1

12

DNA tổng số của 02 mẫu VK H1 đã đƣợc tách chiết

thành công với chất lƣợng DNA cao. Sản phẩm PCR điện di

trên gel chỉ xuất hiện 1 băng duy nhất, có kích thƣớc khoảng

1500 bp, phù hợp với kích thƣớc lý thuyết dự đoán.

3.4.3.2. Kết quả giải trình tự gen chủng VK Bacillus H1

Kết quả xác định trình tự vùng gen 16S cho ảnh điện di

đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cƣờng độ mạnh và rõ ràng.

Sau khi loại bỏ trình tự mồi và các vùng tín hiệu nhiễu, chúng

tôi đã thu đƣợc trình tự nucleotide của chủng H1 có độ dài là

1285 nucleotide.

3.4.3.3. Kết quả giải trình tự gen chủng VK Bacillus H3

Kết quả xác định trình tự vùng gen 16S cho ảnh điện di

với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cƣờng độ mạnh và rõ ràng

(kết quả chỉ ra ở Phụ lục). Sau khi loại bỏ trình tự mồi và các

vùng tín hiệu nhiễu, chúng tôi đã thu đƣợc trình tự nucleotide

của chủng H3 có độ dài là 1329 nucleotide.

3.4.3.4. Kết quả giải BLAST và xây dựng cây phát sinh

chủng loại

Kiểm tra tính tƣơng đồng của trình tự 16S mẫu VK

Bacillus H1 và H3 với các trình tự sẵn có trên ngân hàng

Genbank bằng công cụ BLAST cho thấy trình tự gen VK H1

và H3 tƣơng đồng cao (99%) với một số loài trong chi Bacillus

thuộc họ Bacillaceae, trong đó, VK H1 tƣơng đồng cao với

Bacillus subtilis KM047486, Bacillus lichenformis KF051999,

13

Bacillus cereus KF699134; VK H3 tƣơng đồng với các loài

Bacillus vallismortis JF912890; Bacillus sp. KJ850507;

Bacillus sp. KM117159.

Do kết quả của BLAST cho ra những điểm nghi vấn

chƣa chuẩn xác, vì vậy chúng tôi sử dụng phƣơng pháp dựng

cây phát sinh chủng loại để tiếp tục xác định tên khoa học cho

chủng H1.

Cây tiến hóa đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp MP.

Kết quả đƣợc biểu thị ở hình 1:

Hình 1. Mối quan hệ họ hàng của VK H1 và VK H3 với các

loài/thứ trong cùng chi lấy trên Genbank theo phương pháp

MP. Staphylococcus epidermidis (JX131632) được xem như

loài ngoài nhóm (outgroup).

14

Kết quả phân tích cây tiến hóa này một lần nữa khẳng

định chủng chủng VK H1 và H3 đƣợc xếp vào chi Bacillus với

giá trị bootstrap trên 93% (H1) và trên 97% (H3) (Hình 3.13).

Trong cây tiến hóa, VK H1 cũng với 3 loài có quan hệ gần gũi

(Bacillus subtilis KM047486, Bacillus lichenformis KF051999,

Bacillus cereus KF699134) tách ra thành 1 nhánh riêng. Cây

tiến hóa này cũng chỉ ra, mức độ gần gũi của VK H1 với 3 loài

là tƣơng đƣơng nhau, với giá trị bootstrap 64%, do đó, chƣa thể

khẳng định chính xác đƣợc VK H1 là thuộc nhóm nào trong 3

loài gần gũi này.

Sử dụng phƣơng pháp so sánh kiểu hình khuẩn lạc ở

cùng điều kiện nuôi cấy, nhận thấy chủng VK Bacillus H1 có

các đặc điểm sinh học rất giống với loài Bacillus subtilis. Cụ

thể: sau 2 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc có màu trắng đục, dẹt,

không tròn đều, có rìa nhỏ ở mép. Nội bào tử hình thành ở gần

tâm, kích thƣớc tế bào 2µm X 1- 1,5 µm. Ngoài ra, khuẩn lạc

không có dạng phân thùy hình vảy địa y nhƣ Bacillus

lichenformis và khi nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, khuẩn

lạc VK H1 không hình thành, do đó VK H1 không phải là

Bacillus cereus. Nhƣ vậy, có thể kết luận chủng VK H1 thuộc

loài Bacillus subtilis.

Cây tiến hóa ở hình 3.13 cũng cho thấy đối với chủng

VK H3 và loài Bacillus vallismortis JF912890 tách ra thành 1

nhành riêng, chứng tỏ chúng có quan hệ cực kỳ gần gũi với

15

nhau, gần nhƣ có thể kết luận chúng là 1. Đối chiếu với kiểu

hình khuẩn lạc ở cùng điều kiện nuôi cấy, chúng tôi xác định

đƣợc các đặc điểm sinh học của chủng VK Bacillus H3 rất

giống với loài Bacillus vallismortis JF912890. Cụ thể: sau 2

ngày nuôi cấy, khuẩn lạc có màu trắng đục, không tròn đều,

mép mỏng dẹt, rìa mép có chia thùy sâu, có dạng nhƣ rễ giả ăn

sâu vào thạch, bề mặt khuẩn lạc không nhẵn mà gợn sóng. Nội

bào tử hình thành ở tâm, kích thƣớc tế bào 2µm X 1,5µm. Do

đó, chúng tôi khẳng định VK H3 thuộc loài Bacillus

vallismortis.

3.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ VI KHUẨN CHO

VÀO BỂ XỬ LÝ SINH HỌC HIẾU KHÍ

Kết quả định lƣợng chủng VK H1 có trong 1ml mẫu dung

dịch nuôi cấy lắc sau 48h:

-

Tại nồng độ pha loãng 10^-6, đếm đƣợc trên đĩa petri có

trung bình 83 khuẩn lạc. Cho vào bể xử lý 200ml dung dịch

nuôi cấy lắc, vậy lƣợng chủng VK H1 cho vào bể xử lý là:

83.10⁶x 200 = 16,6.10⁹(CFU). Bể xử lý có thể tích 30 lít, vậy

mật độ VK H1 cho vào bể là khoảng 55. 10⁷(CFU/L).

Tiến hành song song với chủng VK H3, chúng tôi đếm đƣợc

đƣợc 56 khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa petri. Tính toán

tƣơng tự, chúng tôi xác định đƣợc mật độ VK H3 cho vào bể là

khoảng 37. 10⁷(CFU/L).

3.6. KẾT QUẢ XỬ LÝ NƢỚC THẢI THỦY SẢN BẰNG

16

BỂ XỬ LÝ SINH HỌC HIẾU KHÍ

-

Sau quá trình xử lý, pH của nƣớc thải đầu ra nằm trong

khoảng cho phép tại cột B (5 - 9) của QCVN 11:2008/BTNMT

– Quy chuẩn kĩ thuật Quốc gia về nƣớc thải công nghiệp chế

biến thủy sản và nằm trong khoảng thích hợp cho sự sinh

trƣởng của 2 chủng VK nghiên cứu (khoảng trung tính đến

kiềm yếu).

3.6.2. COD

- Sau 5 ngày xử lý với việc bổ sung chủng VK H1, COD

giảm còn 74 mg/l, đạt mức quy định tại cột B của QCVN

11:2008/BTNMT – Quy chuẩn kĩ thuật Quốc gia về nƣớc thải

công nghiệp chế biến thủy sản. Trong khi nếu không bổ sung

VSV, sau 7 ngày COD vẫn cao hơn khoảng 8 lần so với tiêu

chuẩn cho phép.

3.6.3. BOD₅

-

Sau 4 ngày xử lý với việc bổ VK H1, H3, BOD₅giảm

còn 46 mg/l, đạt mức quy định tại cột B của QCVN

11:2008/BTNMT – Quy chuẩn kĩ thuật Quốc gia về nƣớc thải

công nghiệp chế biến thủy sản. Khi không bổ sung VSV, sau 7

ngày COD vẫn cao hơn khoảng 14 lần so với tiêu chuẩn cho

phép.

3.6.4. Nitơ tổng

-

Sau 6 ngày xử lý với việc bổ sung VK, N_tổnggiảm còn

55,8 mg/l, đạt mức quy định tại cột B của QCVN

17

11:2008/BTNMT – Quy chuẩn kĩ thuật Quốc gia về nƣớc thải

công nghiệp chế biến thủy sản.

Nhƣ vậy, kết quả sau 7 ngày xử lý có bổ sung 2 chủng VK và

không bổ sung VSV vào quá trình xử lý bằng bể sinh học hiếu

khí đƣợc thể hiện ở bảng sau:

Bảng 1. Giá trị các chỉ tiêu của nước thải sau 7 ngày xử lý

Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày

Chỉ

QCVN

thứ

4

thứ

tiêu

11:2008

1

2

3

5

6

7

6,05 6,68 6,95

7,22 7,19 7,33

7,03

pH

5,5 – 9

80

6,12 6,33 6,36 6,38 6,31 6,39 6,38

974

385

830

156

778

178

87

725

46

61

665

31

58

642

26

74

680

37

COD

(mg/l) 913

1430 650

BOD₅

50

(mg/l) 1230 1085 987

907

71

833

62

772

56

717

49

173

(mg/l) 156

141

148

95

N_tổng

60

125

116

109

102

98

Dựa vào bảng 3.8, nhận thấy các chỉ tiêu ô nhiễm trong

nƣớc thải đều giảm mạnh, sau 7 ngày xử lý các chỉ tiêu đều đạt

dƣới mức tiêu chuẩn tại cột B của QCVN 11:2008/BTNMT –

Quy chuẩn kĩ thuật Quốc gia về nƣớc thải công nghiệp chế biến

thủy sản. Trong khi đó, nếu chỉ xử lý bằng bể xử lý sinh học

18

hiếu khí thông thƣờng thì các chỉ tiêu vẫn còn cao hơn nhiều

lần so với tiêu chuẩn cho phép.

Đồng thời, bằng trực quan có thể nhận thấy nƣớc thải sau 7

ngày xử lý có màu sắc nhạt và trong hơn so với ngày đầu, về

cảm quan, nƣớc thải cũng ít gây mùi khó chịu hơn sau quá

trình xử lý. Qua đó cho thấy hiệu quả xử lý của chủng VK H1

và VK H3 là khá tốt.

Hình 2. Nước thải trước xử lý

Hình 3. Nước thải sau 7 ngày xử lý

19

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Từ những mẫu nƣớc thải thủy sản của các công ty chế

-

biến thủy sản và trạm xử lý nƣớc thải tập trung KCNDVTS

Thọ Quang – Đà Nẵng, đã phân lập đƣợc 31 chủng VK

Bacillus, trong đó xác định đƣợc 16 chủng có hoạt tính

protease, 12 chủng có hoạt tính amylase và 6 chủng có hoạt

tính xellulase.

-

Xác định đƣợc chủng VK Bacillus H1 là chủng sinh

tổng hợp enzyme protease và xellulase mạnh nhất, tiến hành

nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng này cho thấy chúng

thuộc loại VK Gram (+), hình que ngắn, sinh trƣởng thích hợp

nhất ở khoảng pH trung tính (6,5 – 7,5), nhiệt độ 30⁰C – 35⁰C

và sinh hoạt tính enzyme mạnh nhất sau 48h nuôi cấy.

-

Tuyển chọn đƣợc chủng VK Bacillus H3 là chủng có

khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất, sinh trƣờng tốt nhất ở

pH trung tính hoặc hơi kiềm (7-7,5), nhiệt độ 30⁰C – 35⁰C và

sinh tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất sau khi nuôi cấy 48

giờ.

-

Định danh đƣợc đến tên loài 2 chủng VK sinh hoạt tính

mạnh nhất, chúng tôi xác định đƣợc VK H1 là thuộc loài

Bacillus subtilis, VK H3 là loài Bacillus valslismortis

-

Ứng dụng 2 chủng VK H1 và VK h3 vào xử lý nƣớc

thải thủy sản bằng bể xử lý sinh học hiếu khí với tỉ lệ 4.10⁹