So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ trong điều kiện thực nghiệm

Vietnam J. Agri. Sci. 2021, Vol. 19, No. 5: 605-615

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2021, 19(5): 605-615

www.vnua.edu.vn

SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NHIỄM CHÉO CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ PHI VÀ CÁ NHEO MỸ TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM

Đoàn Thị Nhinh¹, Đặng Thị Hóa¹, Trần Thị Trinh¹, Lê Việt Dũng¹,

Nguyễn Thị Hương Giang², Kim Văn Vạn¹, Đặng Thị Lụa³, Trương Đình Hoài^1*

¹Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

²Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam,

³Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1

^*Tác giả liên hệ: [email protected]

Ngày nhận bài: 05.01.2021

Ngày chấp nhận đăng: 23.04.2021

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện để so sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của chủng vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri gây bệnh trên cá rô phi và cá nheo Mỹ. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ

nhiễm bệnh được so sánh về đặc điểm sinh hóa, giám định PCR, liều gây chết LD₅₀và khả năng gây nhiễm chéo

cho loài cá còn lại. Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ khác nhau ở

2/22 phản ứng sinh hóa (citrate utilization, Voges-proskauer) nhưng tương đồng về kết quả định danh bằng PCR.

Chủng vi khuẩn E. ictaluri từ cá rô phi có độc lực rất cao cho loài cá này (LD₅₀= 2,5 × 10¹CFU/cá) nhưng thể hiện

độc lực thấp khi được gây nhiễm chéo cho cá nheo Mỹ (LD₅₀= 2,0 × 10⁶CFU/cá). Tương tự, chủng vi khuẩn phân

lập từ cá nheo Mỹ có độc lực cao trên cá nheo Mỹ (LD₅₀= 4,7 × 10³CFU/cá) nhưng giảm độc lực đáng kể khi gây

nhiễm chéo cho cá rô phi (LD₅₀= 2,5 × 10⁶CFU/cá). Như vậy, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá nheo Mỹ và cá rô

phi là khác nhau, nhưng ở nồng độ cao vẫn gây chết khi gây nhiễm chéo, do đó cần có các biện pháp đảm bảo an

toàn sinh học để tránh việc lây lan mầm bệnh giữa các hệ thống nuôi.

Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, rô phi, nheo Mỹ, độc lực, nhiễm chéo.

Comparison and Evaluation of Cross-infection Possibility of Edwardsiella ictaluri Isolated

from Tilapia and Channel Catfish under the Experimental Conditions

ABSTRACT

The study was conducted to compare and evaluate the cross-infection possibility of Edwardsiella ictaluri causing

diseases in tilapia and Channel catfish. The strains of E. ictaluri isolated from tilapia and Channel catfish were

compared based on the biochemical characteristics, PCR confirmation, lethal doses and the possibility of cross-

infection among other fish species. The results revealed that E. ictaluri isolated from tilapia and Channel catfish

differed in 2/22 biochemical reactions (citrate utilization, Voges-proskauer) but they were identical in PCR assay. The

virulence of E. ictaluri strains from tilapia was high when they were challenged to tilapia (LD₅₀= 2.5  10¹CFU/fish)

but remarkably decreased to Channel catfish (LD₅₀= 2.0  10⁶CFU/fish). Similarly, the isolates from Channel catfish

exhibited a high virulence in this fish (LD₅₀= 4.7  10³CFU/fish) but reduced their pathogenicity to tilapia

(LD₅₀= 2.5  10⁶CFU/fish). The primary result demonstrates that E. ictaluri causing diseases in Channel catfish and

tilapia differed in several characteristics. However, they cause relatively high mortality of fish when cross-infection

among fish species at high bacterial densities. Thus, biosafety is required to avoid the spreading of pathogens in the

culture systems.

Keywords: Edwardsiella ictaluri, tilapia, Channel catfish, lethal dose, cross-infection ability.

nên được người nuôi lựa chọn và dần trở thành

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

một trong những loài phổ biến ở khu vực phía

Bắc, đặc biệt là các mô hình nuôi lồng bè hiện

đang được phát triển và mở rộng nhanh trên

Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) là đối

tượng nuôi mới, lớn nhanh, có giá trị kinh tế cao

605

So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ

trong điều kiện thực nghiệm

sông và các hồ chứa (Trương Đình Hoài & cs.,

2020; Kim Văn Vạn, 2017). Cá rô phi

(Oreochromis sp.) cũng là đối tượng nuôi truyền

thống quan trọng của Việt Nam, đặc biệt có sự

phát triển rộng khắp về diện tích nuôi ở nhiều

tỉnh Miền Bắc trong những năm gần đây. Cá rô

phi được coi là đối tượng nuôi chủ lực, được tạo

điều kiện mở rộng quy mô nuôi và tăng sản

lượng để phục vụ chế biến và xuất khẩu. Năm

2018, xuất khẩu cá rô phi đạt 7.900 tấn với tổng

giá trị đạt khoảng 15,3 triệu USD. Năm 2019,

xuất khẩu cá rô phi đạt hơn 8.000 tấn với kim

ngạch 16 triệu USD. Bộ Nông nghiệp và Phát

triển Nông thôn đã đề ra mục tiêu nâng sản

lượng cá rô phi từ 225.000 tấn (2017) lên

400.000 tấn vào 2030, ở thời điểm này diện tích

nuôi có thể tăng lên 40.000ha và 1,8 triệu m³

nuôi lồng (MARD, 2019). Chính vì vậy, hiện nay

các mô hình nuôi cá nheo Mỹ và cá rô phi đang

phát triển mạnh, mang lại lợi nhuận cao, giải

quyết sinh kế, mang lại thu nhập và giải quyết

công ăn việc làm cho người dân địa phương.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Cá rô phi (n = 40) và cá nheo Mỹ (n = 20)

nhiễm bệnh và các chủng vi khuẩn E. ictaluri

phân lập và giám định từ cá rô phi (n = 4) và cá

nheo Mỹ (n = 4) thu từ các vùng nuôi lồng khu

vực phía Bắc Việt Nam năm 2020. Cá rô phi (cỡ

30-40g) và cá nheo Mỹ (cỡ 40-50g) phục vụ đánh

giá độc lực và cảm nhiễm chéo. Môi trường

Tryptic soya broth và Tryptic soya Agar (TSB và

TSA; Merck). Bộ thuốc nhuộm vi khuẩn Gram

(Merck); kit chiết tách DNA thương mại Insta

Gene Matrix (Bio-Rad), GoTaq PCR green

(Promega) và các hóa chất, máy móc, thiết bị

trong phòng thí nghiệm phục vụ trong kỹ thuật

PCR, phân tích kết quả, hệ thống bể thí nghiệm

và một số trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Địa điểm và phương pháp thu mẫu

Một vấn đề đặt ra hiện nay là dịch bệnh do

Edwardsiella ictaluri đã và đang xuất hiện, gây

bệnh trên cả cá nheo Mỹ (Trương Đình Hoài &

cs., 2020), cá rô phi (Dong & cs., 2019; Soto &

cs., 2012) tại Việt Nam. Tuy nhiên, sự xuất hiện

của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cả cá nheo

Mỹ và cá rô phi có liên quan đến nhau hay

không, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá

nheo Mỹ và cá rô phi có giống nhau về đặc tính

sinh học và có thể lây chéo cho nhau hay không

là những câu hỏi cần được giải đáp để đề ra giải

pháp trong quá trình phòng trị bệnh trên các hệ

thống nuôi hiện nay.

Để thực hiện nghiên cứu, chúng tôi đã tiến

hành thu thập mẫu cá nheo Mỹ và cá rô phi nuôi

lồng trên sông và hồ chứa nhiễm bệnh, có dấu

hiệu hoại tử nội tạng và gây chết với tỷ lệ cao tại

một số tỉnh miền Bắc như Hưng Yên, Hải Dương,

Thái Bình và Hòa Bình. Mẫu được vận chuyển về

và phân tích tại Phòng thí nghiệm Bệnh thủy

sản, Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt

Nam, bằng phương pháp vận chuyển kín. Thời

gian thu thập mẫu và thực hiện các thí nghiệm

từ tháng 3 đến tháng 11/2020.

2.2.2. Phân lập vi khuẩn gây bệnh

Sau khi giải phẫu, tiến hành lựa chọn

những cá thể cá có dấu hiệu bệnh tích điển hình

của bệnh do vi khuẩn E. ictaluri như xuất hiện

nhiều đốm hoại tử trên các cơ quan gan, thận,

lách. Dùng que cấy vô trùng thu mẫu vi khuẩn

từ tiền thận cá bị bệnh và nuôi cấy trên môi

trường TSA ở nhiệt độ 28C. Các chủng vi

khuẩn phân lập được quan sát hình dạng, màu

sắc, kích thước khuẩn lạc và xác định hình thái

vi khuẩn bằng nhuộm Gram theo hướng dẫn

của nhà sản xuất kit nhuộm Gram (Merck). Các

chủng vi khuẩn sau phân lập được sử dụng để

thử đặc tính sinh hóa bằng kít API 20E theo

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành

phân lập và giám định các chủng vi khuẩn

E. ictaluri gây bệnh trên cá rô phi và cá nheo

Mỹ nuôi lồng trên các hệ thống sông và hồ chứa

ở một số tỉnh miền Bắc. Các chủng vi khuẩn sau

đó được xác định mức độ độc lực trên động vật

cảm nhiễm và được gây nhiễm chéo để so sánh

và đánh giá khả năng gây bệnh giữa 2 loài cá ký

chủ. Kết quả nghiên cứu nhằm cung cấp thông

tin cho việc xây dựng các giải pháp phòng trừ

dịch bệnh do E. ictaluri trên 2 đối tượng nuôi

đang được ưa chuộng và phát triển mạnh tại

miền Bắc Việt Nam.

606

Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng,

Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài

hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux,

2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm xác định liều

Pháp) và bảo quản trong môi trường TSB bổ

sung 20% glycerol (v/v) và giữ trong điều kiện

âm sâu (-80C) theo phương pháp của Trương

Đình Hoài & cs. (2019) và Trương Đình Hoài &

cs. (2020) để sử dụng cho các nội dung nghiên

cứu tiếp theo.

gây chết LD₅₀

Sau khi phân lập và giám định bằng kỹ

thuật PCR, 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri gây

bệnh từ mỗi loài cá với triệu chứng và bệnh tích

điển hình được lựa chọn phục vụ thí nghiệm

cảm nhiễm để xác định liều gây chết 50% (LD₅₀)

cho từng chủng. Các chủng vi khuẩn được nuôi

cấy vào môi trường Nutrient Broth đạt mật độ

5,0  10⁸CFU/ml (xác định bằng phương pháp

đếm đĩa kết hợp đo mật độ quang ở bước sóng

OD₆₀₀). Dãy nồng độ vi khuẩn có nồng độ từ 10²

đến 10⁸CFU/ml cho mỗi chủng vi khuẩn được

chuẩn bị để cảm nhiễm cho cá với liều 0,1 ml/cá

(tương ứng với liều 10¹đến 10⁷CFU/cá).

2.2.3. Định danh và giám định vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri

DNA từ vi khuẩn (n = 8; 4 chủng phân lập

từ cá nheo Mỹ, 4 chủng phân lập từ cá rô phi)

được tách chiết theo kit InstaGene™ Matrix

(Bio-Rad). Quy trình chiết tách DNA được thực

hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kỹ

thuật PCR dùng để giám định các chủng vi

khuẩn sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại

đoạn gene 16S rRNA và gene xác định loài vi

khuẩn E. ictaluri (Bảng 1).

Cá nheo Mỹ và cá rô phi được nuôi thích

nghi 7 ngày trước khi sử dụng cho các thí

nghiệm, được lấy mẫu kiểm tra để đảm bảo cá

khỏe mạnh và không nhiễm bệnh. Với mỗi

chủng vi khuẩn thử nghiệm, sử dụng hệ thống

bể nuôi loại 100 lít, mỗi bể nuôi chứa 15 cá, được

tiêm các nồng độ vi khuẩn từ 10¹đến 10⁷

CFU/cá, và 1 bể đối chứng được tiêm Phosphat

buffer saline (PBS), thí nghiệm được lặp lại 3

lần. Liều gây chết LD₅₀được tính theo phương

pháp của Reed & Muench (1938). Môi trường

nước nuôi thí nghiệm được duy trì ở nhiệt độ 27

± 1C, pH 7,0-7,5 và không tiến hành thay nước

trong quá trình nuôi cảm nhiễm. Những thay

đổi về tập tính của cá, dấu hiệu bệnh lý và số

lượng cá chết hàng ngày được theo dõi và ghi

chép. Mẫu mô gan, thận, lách của cá cảm nhiễm

được nhuộm Gram để kiểm tra sự hiện diện của

vi khuẩn trong cơ thể, tiến hành phân lập và

giám định lại vi khuẩn từ cá được cảm nhiễm

bằng kỹ thuật PCR. Thí nghiệm được thực hiện

trong 14 ngày sau khi tiêm cảm nhiễm.

Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 5,5

nuclease-free water; 12,5µl 2X Go Taq green

master mix (Promega); 1µl Mồi ngược (10

pmole); 1µl mồi xuôi (10 pmole) và 5µl khuôn

mẫu DNA. Đối chứng dương sử dụng trong phản

ứng PCR là chủng Edwardsiella ictaluri LMG

7860, đây là chủng đối chứng dương chuẩn quốc

tế phân lập từ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

được cung cấp từ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng

thủy sản II.

Chu trình nhiệt được thực hiện đối với đoạn

mồi xác định giống Edwardsiella bao gồm: tiền

biến tính ở 94°C trong 3 phút; chu kỳ lặp lại 30

lần: biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở

55°C trong 30 giây, tổng hợp kéo dài ở 72°C

trong 2 phút; hoàn thành ở 72°C trong 5 phút.

Chu trình nhiệt được thực hiện đối với đoạn mồi

xác định loài Ed –ictaluri có 3 bước bao gồm:

tiền biến tính ở 94°C trong 3 phút; chu kỳ lặp

lại 35 lần: biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn

mồi ở 62°C trong 30 giây, tổng hợp kéo dài ở

72°C trong 60 giây; hoàn thành ở 72°C trong 5

phút (Sakai & cs., 2009). Sản phẩm PCR được

điện di trên gel 1,5% (TBE 1X) với thang DNA

chuẩn 100bp (marker). Sử dụng nguồn điện di ở

hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian

chạy điện di trong 30 phút. Sản phẩm PCR nếu

dương tính sẽ cho vạch sáng ở vị trí lần lượt là

848 và 470bp.

2.2.5. Gây nhiễm chéo

Sau khi xác định được giá trị LD₅₀của các

chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá rô phi

và cá nheo Mỹ. Tiến hành lựa chọn chủng có giá

trị LD₅₀thấp nhất (độc lực cao nhất) để tiến

hành cảm nhiễm chéo. Thí nghiệm gây nhiễm

chéo được bố trí và thực hiện tương tự như thí

nghiệm xác định liều gây chết LD₅₀đã trình bày

ở phần 2.2.4. Tuy nhiên, điểm khác biệt trong

607

So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ

trong điều kiện thực nghiệm

thí nghiệm này là chủng vi khuẩn có độc lực cao

phân lập từ cá rô phi được sử dụng để tiêm chéo

cho cá nheo Mỹ và ngược lại. Dãy nồng độ vi

khuẩn sử dụng để tiêm chéo là từ 10¹-10⁷

CFU/cá. Môi trường nước của các bể thí nghiệm

được giữ ở nhiệt độ 27±1C, pH 7,0-7,5 và không

tiến hành thay nước trong quá trình cảm nhiễm.

Tình trạng sức khỏe, dấu hiệu bệnh lý và số

lượng cá chết hàng ngày được theo dõi và ghi

chép chi tiết. Các mẫu cá chết sau quá trình

cảm nhiễm được giải phẫu để tổng hợp triệu

chứng bệnh tích và phân lập vi khuẩn. Vi khuẩn

sau phân lập lại được thử đặc tính sinh hóa và

giám định bằng kỹ thuật PCR. Dấu hiệu lâm

sàng, khả năng gây chết khi gây nhiễm trực tiếp

và gây nhiễm chéo được so sánh và đánh giá.

Thí nghiệm được thực hiện trong 14 ngày sau

khi tiêm cảm nhiễm.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm bệnh tích,

phân lập và giám định Edwardsiella

ictaluri từ cá rô phi và nheo Mỹ

Cá rô phi và cá nheo Mỹ nhiễm bệnh

xuất hiện các triệu chứng và bệnh tích điển

hình do vi khuẩn E. ictaluri gây ra (Hình 1).

Quan sát lâm sàng và giải phẫu kiểm tra cho

thấy, cá nheo Mỹ nhiễm bệnh thường xuất hiện

các đốm mủ tập trung dày ở gan và phân bố rải

rác ở thận, trong khi đó với cá rô phi nhiễm

bệnh, các đốm mủ thường xuất hiện nhiều ở

lách, thận (đặc biệt là thận trước), tần xuất bắt

gặp đốm mủ trên gan rất thấp so với trên cá

nheo Mỹ.

Chúng tôi tiến hành phân lập, thử đặc tính

sinh hóa và giám định bằng kỹ thuật PCR cho 4

chủng đại diện phân lập từ mỗi loài cá. Kết quả

cho thấy, vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ 2 loài

cá đều phát triển trên môi trường thạch TSA

sau 48h nuôi cấy trong điều kiện 28C, khuẩn

lạc có kích cỡ nhỏ, dạng đầu kim, màu trắng đục

có rìa và bề mặt không đồng nhất. Vi khuẩn

Gram âm, có dạng hình que (Hình 2).

2.2.6. Xử lý số liệu

Các giá trị LD₅₀, tỷ lệ sống của cá trong các

lô thí nghiệm và nồng độ gây nhiễm đều được

biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình cộng và

độ lệch chuẩn (SD) sử dụng phần mềm

Microsoft Excel.

Bảng 1. Các cặp mồi sử dụng để giám định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

phân lập từ cá nheo Mỹ và cá rô phi

Gen đích

Ed genus

Trình tự đoạn mồi (5′→3′)

F: ACAGCCTGGAAGAGTCCTAC

R: TTGAGAGTCGCTGCTTAC

F: CAGATGAGCGGATTTCACAG

R: CGCGCAATTAACATAGAGCC

Độ dài gen đích (bp)

848

Nguồn tham khảo

Sakai & cs. (2009)

Ed-ictaluri

470

Hình 1. Bệnh tích trên cá nheo Mỹ (A) và cá rô phi (B) nhiễm vi khuẩn E. ictaluri

với đốm mủ trắng trên gan, thận ở cá nheo Mỹ và trên lách, thận ở cá rô phi (mũi tên)

608

Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng,

Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài

Hình 2. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA, hình thái khuẩn lạc

và hình dạng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá nheo Mỹ (A-C) và cá rô phi (D-E)

Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa của

các chủng vi khuẩn phân lập được tổng hợp ở

bảng 2 cho thấy 04 chủng vi khuẩn gây bệnh

trên cá rô phi phân lập được trong nghiên cứu

2019), trong khi các chủng phân lập được từ cá

nheo Mỹ trong nghiên cứu có đặc tính sinh hóa

hoàn toàn tương đồng với chủng E. ictaluri phân

lập được trên cá tra (Nguyễn Thị Ngọc Huyền &

Đặng Thị Hoàng Oanh, 2020) và trên cá nheo

Mỹ đã phân lập trước đây (Hawke & cs., 1981).

(RPHB-02.20,

RPTQ-04.20,

RPHD-05.20,

RPTB-05.20) có kết quả khác biệt đối với 2 phản

ứng sinh hóa (Citrate utilization và Voges-

proskauer) so với 04 chủng phân lập được trên

cá nheo Mỹ nhiễm bệnh (NMHB-03.20, NMTQ-

06.20, NMHD-04.20, NMTB-08.20) (Bảng 2). So

sánh và đối chiếu kết quả thử đặc tính sinh hóa

thu được trong nghiên cứu hiện tại với nghiên

cứu trước đây cho thấy, các chủng vi khuẩn E.

ictaluri phân lập được từ cá rô phi trong nghiên

cứu đều có sự tương đồng ở hầu hết các chỉ tiêu

sinh hóa với chủng phân lập bởi Dong & cs.

(2019). Sự khác biệt chỉ thể hiện ở phản ứng

citrate utilization, trong khi 4/4 chủng vi khuẩn

phân lập được trong nghiên cứu đều cho kết quả

thử (+), chỉ có 3/4 chủng phân lập bởi Dong & cs.

(2019) cho kết quả (+) và 1/4 chủng cho kết quả

(-). Kết quả (+) với phản ứng citrate của các

chủng từ cá rô phi trong nghiên cứu cũng tương

đồng với đặc tính của chủng E. ictaluri phân lập

từ cá điêu hồng ở khu vực Nam Bộ (Nguyễn Thị

Ngọc Huyền & Đặng Thị Hoàng Oanh, 2020;

Trương Trọng Nghĩa & Đặng Thị Hoàng Oanh,

Kết quả giám định bằng kỹ thuật PCR cho

thấy 4 chủng E. ictaluri phân lập được từ cá

nheo Mỹ và 4 chủng phân lập được từ cá rô phi

đều cho kết quả dương tính với cả 2 cặp mồi: cặp

mồi giám định giống Edwardsiella (848bp) và

cặp mồi giám định loài E. ictaluri (470bp) sử

dụng trong nghiên cứu. Do vậy, tất cả các chủng

vi khuẩn phân lập được đều được định danh là

E. ictaluri (Hình 3).

3.2. Kết quả xác định liều gây chết 50%

trên cá thí nghiệm của các chủng vi khuẩn

E. ictaluri

Kết quả gây nhiễm thực nghiệm xác định

liều gây chết 50% của 04 chủng vi khuẩn gây

bệnh trên cá nheo Mỹ và 04 chủng phân lập từ

rô phi được thể hiện ở bảng 3 cho thấy giá trị

LD₅₀của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô

phi ở mức 2,5-2,9 × 10¹CFU/cá, trong khi các

chủng vi khuẩn phân lập từ cá nheo Mỹ có giá

trị LD₅₀trong khoảng 4,7-5,4 × 10³CFU/cá.

609

So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ

trong điều kiện thực nghiệm

Trong đó chủng E. ictaluri NMHB-03.20 phân

lập từ cá nheo Mỹ và chủng vi khuẩn E. ictaluri

RPHB-02.20 phân lập từ cá rô phi có độc lực cao

nhất, tương ứng với liều LD₅₀thấp nhất, lần

lượt là 4,7 × 10³CFU/cá và 2,5 × 10¹CFU/cá.

xuất hiện ở gan. Bệnh tích đại thể chính biểu

hiện trên gan là xuất huyết và tụ huyết (Hình

5). Tất cả các lô cá được cảm nhiễm bệnh bị chết

hoặc còn sống sau 14 ngày thí nghiệm đều được

giám định đúng tác nhân gây bệnh là E. ictaluri

bằng các phương pháp nhuộm tươi, nuôi cấy và

giám định lại bằng kỹ thuật PCR. Như vậy, cá

thí nghiệm sau khi được cảm nhiễm bằng vi

khuẩn phân lập từ đúng loài cá ký chủ biểu

hiện các triệu chứng và bệnh tích điển hình

tương tự như trên cá nhiễm bệnh tự nhiên thu

ngoài thực địa (Trương Đình Hoài & cs., 2020;

Dong & cs., 2019).

Kết quả kiểm tra triệu chứng bệnh tích trên

cá thí nghiệm cho thấy cá nheo Mỹ sau khi gây

nhiễm xuất hiện các đốm trắng hoại tử tập

trung nhiều ở gan và thận, rất ít xuất hiện đốm

trắng ở lách (Hình 4). Trong khi đó, cá rô phi

sau khi được tiêm cảm nhiễm vi khuẩn

E. ictaluri có xuất hiện các đốm mủ trắng tập

trung chủ yếu ở lách và thận, ít quan sát thấy

Bảng 2. So sánh đặc tính sinh hóa

của các chủng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cá nheo Mỹ và cá rô phi

Chủng E. ictaluri trên cá rô phi

Chủng E. ictaluri trên cá nheo Mỹ

NMHB-03.20

RPHB-02.20

Đặc điểm sinh hóa

NMTQ-06.20

NMHD-04.20

NMTB-08.20

Đối chứng

(Dong & cs., 2019)

RPTQ-04.20

RPHD-05.20

RPTB-05.20

Đối chứng

(Hawke & cs., 1981)

Nhuộm gram

Gram âm

Hình thái vi khuẩn

Oxidase

Trực khuẩn

-

+

-

+

-

+

-

+

-

Catalase

ONPG

Arginine dihydrolase

Lysine decarboxylase

Ornithine decarboxylase

Citrate utilization

H₂S production

Urease

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

D

-

TDA

-

Indole production

Voges-proskauer

Gelatin

-

+

-

+

-

Acid production

D-glucose

+

-

+

-

+

-

+

-

D-mannitol

Inositol

D-sorbitol

L-rhamnose

D-sucrose

D-melibiose

Amygdalin

L-arabinose

Ghi chú: D: dao động (+ hoặc -).

610

Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng,

Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài

Hình 3. Kết quả giám định PCR các chủng E. ictaluri trên cá nheo Mỹ (A-B)

và cá rô phi (C-D) sử dụng cặp mồi định danh giống Edwardsiella (848bp)

và cặp mồi định danh loài Edwardsiella ictaluri (470bp)

Bảng 3. Kết quả xác định liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD₅₀)

của các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập được từ cá bệnh

Loài cá phân lập

Cá nheo Mỹ

Tên chủng vi khuẩn

E. ictaluri NMHB-03.20

E. ictaluri NMTQ-06.20

E. ictaluri NMHD-04.20

E. ictaluri NMTB-08.20

E. ictaluri RPHB-02.20

E. ictaluri RPTQ-04.20

E. ictaluri RPHD-05.20

E. ictaluri RPTB-05.20

Loài cá cảm nhiễm

Nheo Mỹ

Địa điểm thu mẫu

Hòa Bình

Liều gây chết LD₅₀* (CFU/cá)

4,7 × 10³

Tuyên Quang

Hải Dương

Thái Bình

5,4 ×10³

4,9 ×10³

5,3 × 10³

2,5 × 10¹

2,8 ×10¹

Cá rô phi

Rô phi

Hòa Bình

Tuyên Quang

Hải Dương

Thái Bình

2,7 × 10¹

2,9 ×10¹

Ghi chú: ^*Liều gây chết LD₅₀trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại.

và cá nheo Mỹ tại hồ Hòa Bình. Kết quả xác

định độc lực, khả năng gây chết khi gây nhiễm

chéo được thể hiện ở hình 6 và hình 7.

3.3. Kết quả gây nhiễm chéo và đánh giá

độc lực

Dựa vào kết quả đánh giá độc lực các chủng

vi khuẩn gây bệnh cho từng loài cá, chủng vi

khuẩn có độc lực cao nhất trên cá nheo Mỹ

(E. ictaluri NMHB-03.20) và cá rô phi (E.

ictaluri RPHB-02.20) được lựa chọn để gây

nhiễm chéo cho nhau. Đây cũng là 2 chủng vi

khuẩn được phân lập từ các trại nuôi cá rô phi

Kết quả gây nhiễm chéo cho thấy vi khuẩn

E. ictaluri NMHB-03.20 phân lập từ cá nheo

Mỹ không thể hiện độc lực mạnh trên cá rô phi

như khi gây nhiễm trực tiếp cho cá nheo Mỹ.

Liều gây chết LD₅₀của chủng E. ictaluri

NMHB-03.20 trên cá rô phi là 2,51 × 10⁶

611

So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ

trong điều kiện thực nghiệm

CFU/cá. Ngoài ra, các biểu hiện bệnh tích trên

cá rô phi khi tiêm cảm nhiễm chủng E. ictaluri

NMHB-03.20 phân lập từ cá nheo Mỹ không

giống với biểu hiện khi cá rô phi mắc bệnh

ngoài thực địa, các đốm trắng đặc trưng chỉ

xuất hiện rải rác ở thận, tần xuất bắt gặp ở

gan cũng rất thấp và hoàn toàn không xuất

hiện trong lách (Hình 8A). Tương tự như vậy,

chủng vi khuẩn E. ictaluri RPHB-02.20 phân

lập từ cá rô phi khi gây nhiễm cho cá nheo Mỹ

có liều gây chết 50% LD₅₀là 1,99 × 10⁶CFU/cá,

cao hơn rất nhiều so với giá trị LD₅₀khi gây

nhiễm cho cá rô phi (2,5 × 10¹CFU/cá). Kết quả

kiểm tra tất cả các lô cá nheo Mỹ được gây

nhiễm cũng không xuất hiện bệnh tích điển

hình, không xuất hiện các đốm trắng hoại tử

trên gan và thận như khi được gây nhiễm trực

tiếp hoặc khi cá nhiễm bệnh tự nhiên ngoài

thực địa (Hình 8C). Kiểm tra mẫu thận từ cá

được gây nhiễm chéo bằng phương pháp nhuộm

tươi đều cho thấy sự có mặt của vi khuẩn E.

ictaluri mật độ cao trên mẫu mô thận (Hình 8B

và 8D). Như vậy, mặc dù tồn tại với mật độ cao

trong cơ thể cá cảm nhiễm nhưng khả năng gây

bệnh của vi khuẩn E. ictaluri trên loài cá được

gây nhiễm chéo đã giảm đi rất đáng kể.

Ghi chú: A-C: Các đốm trắng xuất hiện trên gan, thận cá; D: vi khuẩn E. ictaluri nhuộm tươi thận cá.

Hình 4. Cá nheo Mỹ gây nhiễm thực nghiệm chủng vi khuẩn E. ictaluri NMHB-03.20

Ghi chú: A-C: Các đốm trắng hoại tử xuất hiện rõ trên lách và thận cá; D: vi khuẩn E. ictaluri nhuộm tươi trên

mẫu thận cá.

Hình 5. Cá rô phi gây nhiễm thực nghiệm chủng vi khuẩn E. ictaluri RPHB-02.20

612

Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng,

Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài

Hình 6. Kết quả gây nhiễm thực nghiệm chủng E. ictaluri NMHB-03.20 trên cá rô phi

Hình 7. Kết quả gây nhiễm thực nghiệm chủng E. ictaluri RPHB-02.20 trên cá nheo Mỹ

Ghi chú: Cá rô phi được gây nhiễm chủng vi khuẩn phân lập từ cá nheo Mỹ (A) và sự hiện diện của vi khuẩn

E. ictaluri trong thận cá rô phi cảm nhiễm (B). Cá nheo Mỹ được gây nhiễm chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô

phi (C) và sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri trong thận cá nheo Mỹ được cảm nhiễm (D)

Hình 8. Bệnh tích của cá được gây nhiễm chéo chủng vi khuẩn E. ictaluri

613

So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ

trong điều kiện thực nghiệm

Như vậy, có thể thấy khi gây nhiễm chéo

chủng vi khuẩn E. ictaluri liều cao có thể gây

chết cho cá nheo Mỹ và rô phi trong điều kiện

thực nghiệm. Tuy nhiên so với gây nhiễm trực

tiếp, khi được gây nhiễm chéo cho kết quả khác

biệt về liều gây chết LD₅₀, độc lực và dấu hiệu

lâm sàng của bệnh. Kết hợp các kết quả xác

định đặc điểm sinh hóa, giám định bằng PCR và

kết quả gây nhiễm chéo có thể kết luận rằng vi

khuẩn E. ictaluri gây bệnh ở cá nheo Mỹ và rô

phi là có sự khác nhau về một số đặc tính sinh

hóa, khả năng gây bệnh và bệnh tích gây ra

trên từng loài cá. Sự suy giảm độc lực của vi

khuẩn E. ictaluri khi được gây nhiễm sang loài

cá ký chủ khác như giữa cá tra và cá điêu hồng

hay từ cá nheo Mỹ sang cá rô phi đã được mô tả

ở một số nghiên cứu trước đó. Kết quả nghiên

cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Ngọc Huyền

& Đặng Thị Hoàng Oanh (2020) trên chủng

E. ictaluri phân lập từ cá điêu hồng bị bệnh gan

thận mủ chỉ có khả năng gây bệnh ở cá điêu

hồng mà không gây bệnh ở cá tra. Tương tự như

vậy, nghiên cứu tại Mỹ của Plumb & Sanchez

(1983) cho thấy chủng vi khuẩn E. ictaluri phân

lập từ cá nheo Mỹ không gây chết cho cá rô phi

xanh khi được cảm nhiễm, trừ khi sử dụng liều

tiêm rất cao (10⁸CFU/cá). Kết quả nghiên cứu

chúng tôi một lần nữa cung cấp minh chứng

chứng minh rằng chủng vi khuẩn E. ictaluri từ

cá rô phi có sự khác biệt với chủng gây bệnh ở cá

nheo Mỹ. Nghiên cứu gần đây của Griffin & cs.

(2016) cho thấy chủng vi khuẩn E. ictaluri có

nguồn gốc từ ký chủ khác nhau thì có sự khác

biệt về hệ gene, đây có thể là lý do chính làm

cho mức độ độc lực suy giảm khi gây nhiễm chéo

giữa các loài. Do vậy, cần có thêm các nghiên

cứu tiếp theo để giải trình tự toàn bộ hệ gene

của chủng E. ictaluri phân lập từ cá nheo Mỹ và

rô phi phân lập được trong nghiên cứu này để

tìm ra điểm khác biệt về hệ gene giữa chúng,

thiết lập được các cặp mồi đặc hiệu phục vụ

chẩn đoán phân biệt chủng gây bệnh ở hai loài

cá này.

(LD₅₀= 4,7 × 10²CFU/cá) và gây ra các đốm

hoại tử trên nội quan loài cá này với dấu hiệu

bệnh lý tương tự như trên cá bệnh thu thập ở

lồng bè nuôi ngoài thực địa ở một số tỉnh miền

Nam. Kết hợp với kết quả thu mẫu và phân tích

ở nhiều địa điểm khác nhau ở khu vực phía Bắc

trong nghiên cứu này, có thể thấy rằng chủng

E. ictaluri độc lực cao gây bệnh trên cá rô

phi/điêu hồng có thể đã lây lan và hiện diện tại

nhiều vùng nuôi cá rô phi của Việt Nam. Do

vậy, cần có các giải pháp ngăn chặn để hạn chế

dịch bệnh bùng phát và giảm thiểu gây thiệt hại

cho nghề nuôi cá rô phi, phục vụ phát triển bền

vững loài nuôi này.

4. KẾT LUẬN

Chủng Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên

cá nheo Mỹ và cá rô phi khác nhau về một số

đặc tính sinh hóa nhưng tương đồng về kết quả

phân tích PCR khi sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu

phân tích giống Edwardsiella và loài E. ictaluri

trên cá nheo Mỹ.

Giá trị LD₅₀của chủng vi khuẩn phân lập

từ cá rô phi và từ cá nheo Mỹ khi tiêm cho đúng

loại ký chủ tương ứng ở mức 2,5-2,9 × 10¹

CFU/cá và 4,7-5,4 × 10³CFU/cá. Khi được gây

nhiễm chéo, mức độ độc lực của các chủng vi

khuẩn đều suy giảm lớn với giá trị LD₅₀khi cảm

nhiễm chủng phân lập cá nheo Mỹ cho rô phi và

chủng phân lập từ rô phi cho cá nheo Mỹ tương

ứng ở mức 2,51 × 10⁶CFU/cá và 1,99 × 10⁶

CFU/cá. Với nồng độ gây nhiễm cao (10⁷

CFU/cá) vẫn gây chết tỷ lệ cao (> 80%) trên loài

cá được gây nhiễm chéo.

Kết quả nghiên cứu là thông tin cần thiết

cho việc xây dựng kế hoạch, quy hoạch phát triển

các mô hình nuôi trên sông, hồ chứa và định

hướng phòng trị bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây

ra trên cá nheo Mỹ và cá rô phi nuôi khi hai loài

cá này đang được phát triển nuôi tập trung trên

cùng một hệ thống mở như hiện nay.

Về mức độ lưu hành, theo kết quả của

Nguyễn Trọng Nghĩa & Đặng Thị Hoàng Oanh

(2019) khi cảm nhiễm chủng E. ictaluri phân

lập từ cá điêu hồng có độc lực khá cao

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được thực hiện dưới sự tài trợ

của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

614

Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng,

Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài

KHCN trong nuôi cá rô phi quy mô hàng hóa, Hòa

Bình, ngày 05/04/2019.

trong khuôn khổ dự án Worldbank với mã số đề

tài ĐTKHCN.WB.11/20. Tác giả xin chân

thành cảm ơn sự hỗ trợ của các hộ nuôi cá nheo

Mỹ và cá rô phi tại các tỉnh đã phối hợp thực

hiện, tạo điều kiện thu mẫu để hoàn thành

nghiên cứu này.

Nguyễn Thị Ngọc Huyền & Đặng Thị Hoàng Oanh

(2020). Đặc điểm bệnh học của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá

tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá điêu

hồng (Oreochromis sp.). Tạp chí Khoa học,

Trường Đại học Cần Thơ. 56(1): 947-969

Nguyễn Trọng Nghĩa & Đặng Thị Hoàng Oanh (2019).

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.).

Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ.

55: 123-131

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Dong H.T., Senapin S., Jeamkunakorn C., Nguyen

V.V., Nguyen N.T., Rodkhum C., Khunrae P. &

Rattanarojpong T. (2019). Natural occurrence of

edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in

farmed hybrid red tilapia (Oreochromis sp.) in

Southeast Asia. Aquaculture. 499: 17-23.

Plumb J.A. & Sanchez D.J. (1983). Susceptibility of

five species of fish to Edwardsiella ictaluri. J. Fish

Dis. 6: 261-266.

Griffin M., Reichley S., Greenway T., Quiniou S.,

Ware C., Gao D., Gaunt P., Yanong R., Pouder D.

& Hawke J. (2016). Comparison of Edwardsiella

ictaluri isolates from different hosts and

geographic origins. Journal of Fish Diseases.

39(8): 947-969.

Reed L.J. & Muench H. (1938) A simple method of

estimating fifty per cent endpoints. American

journal of epidemiology. 27: 493-497

Sakai T., Yuasa K., Sano M. & Iida T. (2009).

Identification of Edwardsiella ictaluri and E. tarda

by species-specific polymerase chain reaction

targeted to the upstream region of the fimbrial

gene. J. Aquat. Anim. Health. 21: 124-132.

Hawke J.P., Mcwhorter A.C., Steigerwalt A.G. &

Brenner D.J. (1981). Edwardsiella ictaluri sp.

nov., the causative agent of enteric septicemia of

catfish. International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology. 31(4): 396-400.

Soto E., Griffin M., Arauz M., Riofrio A., Martinez A.,

& Cabrejos M.E. (2012). Edwardsiella ictaluri as

the causative agent of mortality in cultured Nile

tilapia. Journal of Aquatic Animal Health.

24(2): 81-90.

Hoai T.D., Trang T.T., Van Tuyen N., Giang N.T.H. &

Van Van K. (2019). Aeromonas veronii caused

disease and mortality in channel catfish in

Vietnam. Aquaculture. 513: 734425.

Trương Đình Hoài, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh,

Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Văn Tuyến, Vũ Đức

Mạnh, Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang

Lâm & Nguyễn Thị Lan (2020). Đặc điểm bệnh lý

và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh

gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus

punctatus). Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt

Nam. 18(2): 94-104.

Kim Văn Vạn (2017). Xây dựng mô hình nuôi cá nheo

mỹ (Ictalurus punctatus) trong ao tại Hưng Yên.

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

15(6): 738-745.

MARD (2019). Quy hoạch phát triển nuôi cá rô phi đến

năm 2020, định hướng 2030. Diễn đàn ứng dụng

615