Sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
SÀNG LꢀC VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI
KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN
CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
Trần Thị Ngọc Phương1*, Đặng Thị Hoàng Oanh1
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên và sàng lọc
các chủng có khả năng kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra. Kết
quả cho thấy, 96 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli được
chọn, với 29 chủng phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)), 24 chủng từ
cá lăng (Mystus nemurus (Valenciennes, 1839)), 21 chủng từ cá vồ đém (Pangasius larnaudii (Bocourt,
1866)), 12 chủng từ cá trê (Clarias macrocephalus (Gunther, 1864)) và 8 chủng từ cá hú (Pangasius
larnaudii (Bocourt, 1866)). Kết quả nhuộm Gram và kiểm tra sinh hóa cho thấy hầu hết các chủng vi
khuẩn lactic được chọn đều là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hình cầu, hình oval, que ngắn
hay que dài, oxidase và catalase âm tính. Kết quả xác định tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin,
thu được 46 chủng thể hiện tính đối kháng và 3 chủng vi khuẩn thể hiện khả năng kháng khuẩn (sinh
bacteriocin thô).
Từ khóa: Aeromonas hydrophila, chế phẩm sinh học (probiotic), khả năng kháng khuẩn, vi khuẩn
lactic
88% đối với bệnh xuất huyết trong các hộ nuôi
được khảo sát so với các bệnh khác và gây thiệt
hại lớn cho người nuôi.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Với khoảng 600.000 ha diện tích mặt nước
ngọt, Đồng bằng sông Cửu Long được đánh giá
có tiềm năng to lớn cho sự phát triển ngành nuôi
trồng thủy sản. Bên cạnh các đối tượng nuôi như
tôm thꢀ chân trắng, tôm sú,… cá tra cũng được
xem là đối tượng nuôi chủ lực, đem lại lợi nhuận
cao cho người nuôi và góp phần vào giá trị xuất
khẩu của cả nước. Theo báo cáo của Hiệp hội
cá tra Việt Nam, tính đến ngày 30/6/2015 diện
tích nuôi thả mới tại ĐBSCL là 1.959 ha (tăng
0,21% so với cùng kỳ năm 2014), sản lượng đạt
516.140 tấn (tăng 1,22% so với cùng kỳ), tổng
kim ngạch xuất khẩu cá tra đến 31/5/2015 đạt
hơn 616 triệu USD. Tuy nhiên, trong hiện trạng
thâm canh hóa mô hình nuôi cá tra như hiện nay,
tình hình dịch bệnh đang diễn ra phức tạp và
khó kiểm soát gây ra thiệt hại lớn cho người
nuôi cá tra, trong đó, bệnh xuất huyết (tác nhân
gây bệnh là A. hydrophila) là một trong những
bệnh nguy hiểm với tần suất xuất hiện khoảng
Trước tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh
không đúng cách dẫn đến nhiều tác hại nghiêm
trọng như hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn
gây bệnh, hay dư lượng thuốc kháng sinh
trong vật nuôi có thể gây hại đến sức khꢁe con
người. Đặc biệt, đối với vi khuẩn gây bệnh A.
hydrophila, hiện tượng kháng thuốc kháng sinh
diễn ra ngày càng phức tạp, Quách Văn Cao
Thi và ctv., (2014) đã chỉ ra rằng hầu hết các
chủng A. hydrophila kháng hoàn toàn với kháng
sinh nhóm penicillin, cefalexin và trimetroprim/
sunfamethoxazol. Nên, việc nghiên cứu để tìm
những giải pháp thay thế tốt hơn cho phòng và trị
bệnh là việc cần thiết. Trong số những giải pháp
tìm được, chế phẩm sinh học được xem như một
giải pháp thay thế tiềm năng vì vi khuẩn hữu ích
có khả năng bám dính cao trong biểu mô ruột và
còn nâng cao hệ miễn dịch của động vật. Trong
1. Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ.
* Email: [email protected]
55
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
đó, vi khuẩn lactic được chứng minh có chức
(Nirunya et al., 2008)
năng như probiotics, có lợi với sức khꢁe vật
chủ khi được bổ sung đủ số lượng trong đường
ruột (Nirunya et al., 2008), vi khuẩn lactic có
thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau
như các sản phẩm lên men, đường ruột gia súc,
đường ruột các loài thủy sản,… Vi khuẩn lactic
là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình cầu hoặc
hình que, catalase âm tính, không sinh bào tử.
Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn tạo ra acid lactic,
ethanol, hợp chất thơm và bacteriocin (Chen và
Hoover, 2003).
Mỗi mẫu ruột cá được lấy khoảng 25 gram/
cá rồi cho vào ống nghiệm chứa nước muối
sinh lý (NaCl 0,9%) đã tiệt trùng và dùng que
vô trùng để nghiền. Tiến hành pha loãng về các
nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 và 10-4 bằng nước muối
NaCl 0,9%. Lấy 1ml mỗi dung dịch pha loãng
và trộn với 20ml MRS (de Man, Rogosa and
Sharpe) (450C) rồi đổ lên đĩa petri đã được tiệt
trùng. Đĩa petri được ủ ở 280C trong 24 giờ.
2.3. Phương pháp nuôi tăng sinh vi
Tuy việc sàng lọc vi khuẩn lactic từ ruột
cá không còn là chủ đề mới, và những chủng
vi khuẩn có khả năng sử dụng làm probiotic đã
được tìm thấy trước đây bao gồm Lactobacillus
acidophilus, L. johnsonii, L. casei, L. gasseri,
L. plantarum, L. rhamnosus, Bifidobacterium
longum, B. breve, B. bifidum, B. infantis,
Enterococcus faecalis và Enterococcus faecium.
Nhưng hầu hết những nghiên cứu trước đây vẫn
chưa thực hiện nhiều trên cá da trơn nước ngọt
thu từ tự nhiên.
khuẩn chꢀ thị (Nirunya et al., 2008)
Các loài vi khuẩn chỉ thị A. hydrophila và
E. coli được nuôi khoảng 20 giờ trong 10ml
môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) ở 280C.
1ml vi khuẩn đã nuôi cấy được lấy chuyển sang
9ml môi trường lꢁng và ủ trong 18 giờ ở 280C,
mật độ vi khuẩn sau đó được điều chỉnh để đạt
106 CFU/ml dùng cho việc xác định hoạt động
kháng khuẩn.
2.4. Phương pháp chọn lọc vi khuẩn có
tính kháng khuẩn (Nirunya et al., 2008)
Do vậy nghiên cứu này được thực hiện
nhằm phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn
lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên có khả
năng kháng với vi khuẩn A.hydrophila gây bệnh
xuất huyết trên cá tra, có tiềm năng sử dụng làm
probiotics, tạo bộ sưu tập vi khuẩn cho những
nghiên cứu sâu hơn về vi sinh hữu ích từ các
loài cá tự nhiên hoặc cho các thí nghiệm trong
điều kiện in vivo để phòng bệnh xuất huyết trên
cá tra.
Chọn lấy những đĩa petri có từ 20-30 khuẩn
lạc của vi khuẩn lactic. Phủ lên đĩa petri đã chọn
10 ml môi trường MHB (Mueller-Hinton Broth)
(0,75% agar) chứa vi khuẩn chỉ thị E.coli với
mật độ 105-106 CFU/ml và ủ trong 24h ở 280C.
Quan sát và ghi nhận kích thước vòng tròn vô
trùng xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn.
2.5. Phương pháp xác định tính đꢁi
kháng và khả năng sinh bacteriocin (Nirunya
et al., 2008)
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương pháp thu mẫu
Tiến hành đổ đĩa môi trường NA (Nutrient
Agar), sau đó tráng lên 10 ml MHA (Mueller-
Hinton Agar) (0,75% agar) có bổ sung vi khuẩn
gây bệnh A. hydophila mật độ 105 – 106 CFU/
ml agar; và tạo các giếng trên đĩa thạch (d=5-
6mm). Vi khuẩn lactic sau khi nuôi trong MRS
(de Man, Rogosa và Sharpe) lꢁng ở 280C trong
48 giờ, đem ly tâm 7.000 vòng/phút trong 15
Mẫu cá da trơn: cá tra, cá lăng, cá trê, cá vồ
đém được mua từ chợ và từ các ghe cào, tình
trạng cá thu mẫu còn khꢁe, bên ngoài không
trầy xướt, không xuất huyết. Mỗi loại cá thu 10
con, cỡ cá khoảng 300 – 400 gram/con, sẽ được
chuyển bằng thùng xốp có sục khí về phòng thí
nghiệm để phân tích. Mẫu cá được xịt cồn tiệt phút. Thu phần dung dịch bên trên và chia làm
trùng bên ngoài, sau đó cắt lấy đoạn ruột giữa hai phần. Với phần (i) không xử lý, phần (ii)
điều chỉnh pH (6,5 – 7,0) dung dịch bằng NaOH
1M để thu dung dịch có khả năng có bacteriocin
và dạ dày trong điều kiện vô trùng để tiến hành
phân lập vi khuẩn.
56
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
thô. Sau đó cho 80µl phần mỗi dung dịch (i) và (1998) đã phân lập và định danh vi khuẩn lactic
(ii) vào mỗi giếng. Dung dịch Doxycycline 100 trong đường ruột và phân cá đã xác định rằng vi
ppm và MRS broth được sử dụng để làm đối
chứng dương và đối chứng âm. ꢂ ở 28oC trong
24 giờ.
khuẩn lactic chỉ tồn tại một phần rất nhꢁ trong
hệ đường ruột cá (Nirunya B. và ctv., 2008).
Tuy nhiên, nghiên cứu của Nirunya B. và ctv.,
(2008) đã chỉ ra rằng, vi khuẩn lactic tồn tại với
số lượng lớn trong đường ruột cá biển với 160
chủng phân lập được. Nguyễn Văn Thành và
Nguyễn Ngọc Trai (2012) đã phân lập được 45
dòng vi khuẩn từ dạ dày, ruột cá tra và cá rô
phi thu từ các ao nuôi thâm canh. Dương Thị
Kim Loan (2013) đã phân lập được 64 chủng
vi khuẩn lactic từ ruột cá tra và cá rô phi được
thu từ chợ và ao nuôi. Cùng với những nghiên
cứu trên, nghiên cứu này đã phân lập được 96
chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn
nước ngọt, sống tự nhiên, thu từ các chợ và ghe
cào. Từ đây, có thể kết luận rằng, hệ vi sinh
đường ruột cá (cả cá nước mặn và cá nước ngọt)
là nguồn dự trữ phong phú vi khuẩn lactic, đặc
biệt đối với cá da trơn, trong đó vi khuẩn phân
lập từ cá tra chiếm số lượng nhiều nhất (30%)
trong tổng số chủng vi khuẩn phân lập được.
Các dòng vi khuẩn phân lập từ cá da trơn này
có nguồn gốc từ môi trường nước tự nhiên, xâm
nhập và cư trú hệ tiêu hóa của cá thông qua thức
ăn tự nhiên hoặc môi trường nước (Nguyễn Văn
Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012).
Xác định tính đối kháng của các chủng vi
khuẩn lactic đối với vi khuẩn gây bệnh thông
qua đường kính các vòng vô trùng theo Aslim
và ctv., (2005).
2.6. Phương pháp định danh vi khuẩn
Hình dạng, kích thước và tính vòng của vi
khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm
Gram (Barrow và Feltham, 1993). Đặc điểm
sinh lý sinh hóa được kiểm tra bằng phản ứng
catalase, oxidase, nhuộm bào tử và xác định
theo cẩm nang của Cowan và Steels (Barrow và
Feltham, 1993). Sau đó các chủng có tính đối
kháng mạnh với A.hydrophila và có khả năng
sinh bacteriocin đối kháng được giải trình tự
định danh tại công ty công nghệ sinh học Nam
Khoa bằng phương pháp sinh học phân tử.
2.7. Phương pháp xꢂ lꢃ sꢁ liꢄu
Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel
2007 để thống kê và so sánh đường kính vòng
vô trùng gây ra bởi các chủng vi khuẩn lactic.
Từ đó, xác định được các chủng có tính kháng
khuẩn cao từ các loài cá và xác định chủng tốt
nhất thuộc loài cá nào.
3.2. Nhận diꢄn các dòng vi khuẩn phân
lập được
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic
có tính kháng khuẩn từ đường ruột cá da trơn
Những chủng được chọn được tiến hành
kiểm tra đặc điểm sinh lí sinh hóa trước khi tiếp
tục thực hiện thử tính đối kháng với vi khuẩn
A.hydophila. Kết quả cho thấy, hầu hết chúng
đều có khuẩn lạc tròn, bóng, bìa nguyên và có
đường kính dao động từ 0,5mm đến 1,2mm.
Ngoài ra, quan sát dưới kinh hiển vi quang học
cho thấy chúng là những vi khuẩn Gram dương,
không sinh bào tử, hình cầu, hình oval, hình que
ngắn hay que dài, catalase và oxidase âm tính.
Đặc biệt, xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vùng
trong suốt của một trường do CaCO3 bị phân
giải, khi phát triển trên môi trường MRS có 0,5%
Kết quả phân lập từ 5 loài cá da trơn nước
ngọt đã tuyển chọn được 96 chủng vi khuẩn
lactic, trong đó có 29 chủng được phân lập cá
tra (P. hypophthalmus), 24 chủng từ cá lăng (M.
nemurus), 21 chủng từ cá vồ đém (P. larnaudii),
12 chủng từ cá trê (C. macrocephalus) và 8
chủng từ cá hú (P. larnaudii) dựa trên khả năng
ức chế vi khuẩn E.coli khi tạo ra vùng vô trùng
trên môi trường có chứa E. coli (Hình 1A). Mặc
dù trước đây, vi khuẩn lactic được phân lập chủ
yếu từ thực phẩm lên men, từ sữa hay trong
ruột của nhiều loài động vật như chuột, lợn, gà CaCO3 (Hình 1B, 1C). Những đặc điểm này phù
và người; thêm vào đó, Ringø và Gatesoupe hợp với đặc điểm của giống Lactobacillus được
57
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
mô tả bởi Kandler và Wiss (1986) (Nguyễn Văn Lactobacillus, trong đó, vi khuẩn hình oval và
hình que ngắn chiếm ưu thế với số chủng theo
thứ tự là 43 chủng (45%) và 39 chủng (41%)
(Bảng 1).
Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012). Vì vậy có
thể kết luận rằng, 96 chủng vi khuẩn phân lập từ
ruột cá da trơn sống tự nhiên đều thuộc giống
Hình 1: A: Khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên đĩa thạch MRS được tráng bằng MHB 0,75% agar
chứa vi khuẩn E.coli; B, C: Vi khuẩn lactic có khả năng làm tan vôi khi phát triển trên đĩa thạch
MRS có chứa 0,5% CaCO3
Bảng 1: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn lactic phân lập được từ ruột cá da trơn tự nhiên
Hình thái tế bào vi khuẩn
Nguồn phân lập
Hình cầu
CT1.1
Hình oval Hình que ngắn Hình que dài
Cá tra (Pangasius
hypophthalmus (Sauvage, 1878))
CT1.2
CT2.1
CT4.6
CT4.9
CT4.14
CT7.1
CT7.2
CT7.3
CT8.6
CT10.1
CT2.8
CT2.9
CT3.3
CT3.4
CT3.6
CT3.7
CT3.8
CT4.4
CT4.10
CT8.7
CT8.10
CT8.11
CT8.15
CT8.16
CT10.8
CT4.8
CT8.3
CT10.2
58
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Cá lăng (Mystus nemurus
CL9.5
CL2
CL1
(Valenciennes, 1839))
CL10.20
CL3
CL8.23
CL8.26
CL10.1
CL10.4
CL10.6
CL10.7
CL10.10
CL10.37
CL10.3
CL4
CL8.20
CL8.21
CL9.3
CL9.6
CL10.8
CL10.14
CL10.22
CL10.23
CL10.29
TV2
Cá trê (Clarias
TV8.7
TV3
macrocephalus (Gunther, 1864))
TV8.3
TV8.6
TV8.11
TV8.14
TV8.15
TV8.16
TV8.17
TV8.18
TV8.23
CH4.1
CH4.2
TV4
TV8.10
Cá hú (Pangasius
CH2
CH5.1
conchophilus (Roberts &
Vidthayanon, 1991))
CH4.3
CH4.4
CH4.5
CH4.7
VD3.3
VD3.8
VD3.11
VD4.1
Cá vồ đém (Pangasius
VD1.4
VD4.3
VD4.11
VD5.2
VD1.5
VD1.6
VD2.1
VD2.2
VD3.6
VD3.7
VD3.10
VD3.12
VD4.7
VD4.8
VD5.1
VD4.6
VD5.3
larnaudii (Bocourt, 1866))
59
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
3.3. Tính đꢁi kháng và khả năng sinh
bacteriocin thô
có nhiều khả năng đối kháng được với hai chủng
vi khuẩn gây bệnh trên. Thực tế từ nghiên cứu
này đã cho thấy, trong 96 chủng vi khuẩn lactic
chọn lọc được, có 46 chủng thể hiện tính đối
kháng và 3 chủng có khả năng sinh bacteriocin.
Trong đó, các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ
cá tra chiếm số lượng nhiều nhất với 22 chủng,
15 chủng phân lập từ cá lăng. Vi khuẩn lactic
phân lập từ cá vồ đém có 7 chủng, từ cá trê chỉ
có 2 chủng thể hiện tính đối kháng và vi khuẩn
phân lập từ cá hú không thể hiện tính đối kháng
với A. hydrophila. Hầu hết các chủng vi khuẩn
lactic đều thể hiện tính kháng trung bình (với
đường kính vùng vô trùng trung bình (d) từ
4,5mm đến 9,5mm) và yếu (d= 2mm ÷ 4mm)
(Aslim và ctv., 2005) (Hình 2).
Vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của
tác nhân gây bệnh bằng việc sinh ra các acid
hữu cơ và H2O2. Các acid hữu cơ ức chế vi
khuẩn Gram âm, vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn
gây hư hꢁng thực phẩm, nấm,… Trong đó,
acid hữu cơ có khả năng sinh chất ức chế và
diệt khuẩn với acid acetic mạnh hơn acid lactic,
ngoài ra vi khuẩn lactic còn sinh H2O2 có khả
năng diệt khuẩn Gram âm và cả Gram dương
với cơ chế sinh ra supeoxide (O2-) và các gốc
hydroxyl (OH-) tự do phá hủy DNA tạo hiệu
quả diệt khuẩn (Dilek, 2014). Bên cạnh đó, A.
hydrophila và E. ictaluri đều là vi khuẩn Gram
âm cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được
Hình 2: Đường tròn vô trùng tạo ra bởi vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin đối với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila. (+): đối chứng dương (kháng sinh Doxycycline 100ppm); (-): đối chứng âm
(môi trường MRS lꢁng); 1.1, 2.1: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic không xử lý; 1.2, 2.2: dung dịch
ly tâm từ vi khuẩn lactic chuẩn pH (6,5-7) bằng dung dịch NaOH 1M.
Ngoài acid hữu cơ và H2O2, vi khuẩn lactic acidilactici) là những bacteriocins phổ biến và
còn có khả năng sinh bacteriocin, bacteriocin là được sử dụng nhiều nhất trong các sản phẩm
những chuỗi peptide hay protein được sinh ra lên men (Dilek, 2014). Nhiều báo cáo đã chứng
bởi một vài chủng vi khuẩn, hầu hết bacteriocin minh dòng Lactobacillus có khả năng sinh
diệt những tế bào đích bằng tính thấm của màng bacteriocins “lactocidin”. Thực tế, nghiên cứu
tế bào và hoạt động đặc hiệu vì chúng yêu cầu đã tìm ra được 3 chủng CL2, CL10.20 (phân
những chất thụ cảm đặc hiệu trên bề mặt tế lập từ cá lăng) và CT3.7 (phân lập từ cá tra)
bào đích. Bacteriocin được phân loại theo đặc có khả năng sinh bacteriocin trung bình và yếu
điểm sinh hóa và đặc điểm di truyền, trong với đường kính vòng vô trùng lần lượt là 9mm,
đó Nisin (L. lactis) và Pediocin (Pediococcus 4mm và 2mm (Bảng 2).
60
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bảng 2: Bảng đường kính vòng vô trùng gây ra bởi hoạt động kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn
chỉ kháng với Aeromonas hydrophila
A.hydrophila
Khả năng đối kháng
Khả năng sinh bacteriocin
Nguồn
Tên chủng
Đường kính vòng
Đường kính vòng
Độ nhạy(*)
Độ nhạy(*)
phân lập
vô trùng (mm)
vô trùng (mm)
Cá tra
CT8.3
8
7
(++)
(++)
(++)
(++)
(++)
5. (++)
(++)
(++)
(++)
(++)
(++)
(++)
(++)
(+)
0
0
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
7. (+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
CT7.3
CT8.7
CT8.15
CT3.6
3. CT3.7
CT4.4
CT8.11
CT8.16
CT10.8
CT7.1
CT8.6
CT10.2
CT3.8
CT4.9
CT4.10
CT2.8
CT2.1
CT2.9
CT3.3
CT3.4
CT7.2
7
0
7
0
6
0
4. 6
6
6. 2
0
6
0
6
0
6
0
5
0
5
0
5
0
4
0
4
(+)
0
4
(+)
0
3
(+)
0
2
(+)
0
2
(+)
0
2
(+)
0
2
(+)
0
2
(+)
0
61
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Cá lăng CL2
CL10.20
13
6
(++)
(++)
(+)
9
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
(++)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
CL8.20
CL8.21
CL9.3
3
3
(+)
3
(+)
CL9.6
3
(+)
CL10.14
CL10.22
CL10.29
CL3
3
(+)
3
(+)
3
(+)
2
(+)
CL8.26
CL10.7
CL10.10
CL10.23
CL10.37
TV3
2
(+)
2
(+)
2
(+)
2
(+)
2
(+)
Cá trê
4
(+)
TV4
4
(+)
Cá vồ
đém
VD4.8
VD4.11
VD5.3
VD1.5
VD4.6
VD4.7
VD1.6
DC(+)
10
9
(++)
(++)
(++)
(++)
(++)
(++)
(+)
9
5
5
5
2
Đối
14
(++)
chứng
DC(-)
0
(-)
(*) (+): khả năng kháng khuẩn yếu (d=2÷4mm), (++) khả năng kháng khuẩn trung bình (d=4÷14mm), (+++) khả
năng kháng khuẩn mạnh (d=14÷24mm), (-) Không nhạy (d=0)
3.4. Định danh các chꢅng vi khuẩn lactic
có khả năng sinh bacteriocin thô
Kết quả, 2 chủng CL2 và CL10.20 phân lập từ
cá lăng xác định là chủng Lactobacillus reuteri
HFI-LD5 có độ tương đồng theo thứ tự 100%
(548/548bp) và 99% (551/552bp), chủng CT3.7
phânlậptừcátraxácđịnhlàchủngLactobacillus
fermentum JCM- 1173 với độ tương đồng 100%
(539/539bp). Trình tự gen của các chủng vi
khuẩn này được trình bày ở Bảng 4.
Sau khi đã tìm được 3 chủng vi khuẩn
lactic (CL2, CL20 và CL3.7) có khả năng sinh
bacteriocin thô, các chủng này được phục hồi và
tách ròng trên đĩa thạch MRS. Sau đó gửi mẫu
đến Công tyTNHHThương mại và Dịch vụ Nam
Khoa, thực hiện định danh, giải trình tự gen 16S
rRNA và được tra cứu trên BLAST SEARCH
62
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bảng 4: Trình tự gen của Lactobacillus fermentum JCM- 1173 và Lactobacillus reuteri HFI-
LD5
Chủng
Trình tự gen
AT C C T G G C T C A G G AT G A A C G C C G G C G G T-
GTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGTTG-
GCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT-
GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT-
GAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAG-
CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATAC-
CGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCT-
TAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATG-
GACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAAC-
GGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTT-
GAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGA-
CACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAG-
TAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATG-
GAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCG-
GCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACG-
TATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTA-
ACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAG
Lactobacillus
fer-
mentum JCM- 1173
GGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGC-
CGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACG-
CACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCT-
GATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGAC-
GGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGC-
GGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCG-
CATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAA-
GATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCT-
GCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCT-
TACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGA-
CTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTC-
CATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC-
CACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGC-
GTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCT-
GTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACT-
GTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGT-
CACGGCTAACTACGTGCCAG
Lactobacillus reuteri
HFI-LD5
Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram trong quá trình lên men nguyên liệu động vật
dương, thuộc loài Lactobacillus, được tìm thấy và thực vật. L. fermentum được xác định như
63
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
probiotic tiềm năng với khả năng làm giảm hoạt động trong khoảng pH rộng và kháng với
cholesterol tốt hơn hꢃn các loài Lactobacillus enzyme phân giải protein và lipid, có khả năng
khác bằng việc hấp thụ cholesterol, thúc đẩy ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gây hại
quá trình chuyển hóa cholesterol. Một nghiên gram dương và Gram âm, các loài thuộc nấm
cứu khác của Allameh và ctv., 2013, đã xác định và động vật nguyên sinh. Đã có những nghiên
L. fermentum HM579790, được phân lập từ dạ cứu tìm thấy L. reuteri có thể sinh đủ lượng
dày cá lóc (Channa striatus) sống tự nhiên, có reuterin để gây ra những hiệu quả diệt khuẩn
tiềm năng làm probiotic trong nuôi cá lóc khi đáng mong đợi (Lei et al., 2011). Nghiên cứu
cho thấy khả năng ức chế A. hydrophila cao này được xem như nghiên cứu khởi phát cho
nhất trong 13 chủng vi khuẩn phân lập được việc phát hiện L. reuteri tồn tại trong ruột động
trong điều kiện in vitro với đường kính vùng vô vật thủy sản, cụ thể là cá lăng sống tự nhiên với
trùng 8mm và khả năng cải thiện tỉ lệ sống của khả năng đối kháng và sinh bacteriocin đối với
cá lóc (Channa striatus) có ý nghĩa thống kê A. hydrophila.
khi bổ sung 2x106CFU/g vi khuẩn L. fermentum
Kết quả này có ý nghĩa rất lớn cho những
vào khẩu phần. Trong nghiên cứu này, chủng
L. fermentum JCM-1173 được sàng lọc từ
đường ruột cá tra, tuy khả năng đối kháng (sử
dụng dịch huyền phù được lọc vô trùng) của
L. fermentum JCM-1173 (6mm) nhꢁ hơn L.
fermentum HM-579790 (8mm) nhưng nghiên
cứu đã xác định được khả năng sinh bacteriocin
đối với A.hydrophila.
nghiên cứu về vi khuẩn có tiềm năng làm
probiotic trong phòng bệnh gan thận mủ và
bệnh xuất huyết trên cá tra khi mà việc sử dụng
sinh vật đối kháng và bacteriocin để ức chế lại
A.hydrophila là vấn đề tương đối mới vì hiện
nay chưa tìm thấy nghiên cứu nào được thực
hiện trong và ngoài nước sử dụng Lactobacillus
spp. hay bacteriocin do vi khuẩn sinh ra để ức
Lactobacillus reuteri được ghi nhận vào chế lại.
phân loại khoa học của vi khuẩn lactic vào đầu
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
thế kỉ 20, mặc dù vào thời điểm này, loài này
bị nhầm lẫn với nhóm vi khuẩn Lactobacillus
fermentum. Đến những năm 60 của thế kỉ 20,
nhà vi sinh học người Đức Gerhard Reuter đã
phân biệt L. reuteri và L. fermentum và phân
loại vào loài L. fermentum dạng sinh học II.
Đến năm 1980, Kandler và cộng sự đã xác định
sự khác biệt rõ giữa L. reuteri và những dạng
sinh học khác của L. fermentum, từ đó tên khoa
học “reuteri” đã được chọn theo tên của nhà
khoa học Gerhard Reuter để phân biệt với L.
fermentum. L. reuteri được phân lập từ nhiều
nguồn thực phẩm, đặc biệt là các sản phẩm từ
thịt và sữa. L. reuteri là vi khuẩn lên men dị
hình, Gram dương, hình que cong với đầu tròn
đơn, theo cặp hoặc những cụm nhꢁ, hoạt động
probiotic của loài này được thể hiện qua khả
năng ức chế hoạt động của tác nhân gây bệnh,
kết hợp nhiều cơ chế bao gồm sản sinh acid
lactic, H2O2 và bacteriocin. Bacteriocin sinh ra
bởi loài này là reuterin. Reuterin là hợp chất
trung tính của các phân tử nhẹ, tan trong nước,
Kết luận: Trong nghiên cứu này đã thực
hiện phân lập được 96 chủng vi khuẩn lactic
từ ruột cá da trơn tự nhiên, trong đó có 46
chủng thể hiện tính đối kháng vi khuẩn gây
bệnh A.hydrophila. Từ nghiên cứu, đã tìm
được 3 chủng vi khuẩn có khả năng sinh
bacteriocin thô, có tiềm năng sử dụng làm
probiotic. Kết quả định danh đã xác định 2
chủng sinh bacteriocin phân lập từ cá lăng là
Lactobacillus reuteri, chủng phân lập từ cá tra
là Lactobacillus fermentum.
Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu về tối ưu hóa
điều kiện môi trường nuôi đối với khả năng
đối kháng và sinh bacteriocin của L. reuteri
và L. fermentum, tiếp tục nghiên cứu hợp chất
bacteriocin sinh ra bởi L. fermentum, thực
hiện nghiên cứu khả năng đối kháng và sinh
bacteriocin của hai chủng vi khuẩn này đối với
các chủng vi khuẩn gây bệnh khác trên động vật
thủy sản, thực hiện thí nghiệm trong điều kiện
in vivo,…
64
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Aslim, B., Z. N. Yuksekdag, E. Sarikaya and
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liꢄu tiếng Viꢄt
Y. Beyatli, 2005. Determination of the
bacteriocin-like substances produced by some
lactic acid bacteria isolated from Turkish dairy
products. LWT. 38: 691-694.
Dương Thị Kim Loan, 2013. Phân lập và đánh giá
khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic đối
vớivikhuẩnEdwardsiellaictalurigâybệnhgan
thận mủ trên cá tra (Pangasius hypothalamus).
Luận văn cao học ngành nuôi trồng thủy sản,
2013, Trường Đại học Cần Thơ.
Barrow, G.I. and Feltham, R.K.A. (1993). Cowan
and steel’s manual for the identification of
medical bacteria. 3rd Edition, Cambridge
University Press, Cambridge, 331.
Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012.
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus
sp. có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan
thận mủ và đốm đꢁ trên cá tra. Tạp chí Khoa
học Đại học Cần Thơ, 2012:23a 224-234.
Chen, H. and Hoover, D., 2003. Bacteriocins and
their Food Applications. Compr. Rev. Food
Science. Food Safety, 2: 82-89.
Dilek Heperkan, 2014. Antimicrobial activity
of lactic acid bacteria on pathogens in foods
– Why successful? How successful?. Food
Technology 2014, 21-23 July, Las Vegas.
QuáchVănCaoThi,TừThanhDungvàĐặngPhạm
Hòa Hiệp, 2014. Hiện trạng kháng thuốc kháng
sinh trên hai loài vi khuẩn Edwardsiellaictaluri
và Aeromonashydrophila gây bệnh trên cá tra
(Pangasianodonhypophthamus) ở Đồng bằng
sông Cửa Long. Tạp chí Khoa học Trường Đại
học Cần Thơ, Số chuyên đề: Thủy Sản (2014)
(2): 7-14.
Lei, B., A. L. Molan, L. S. Maddox, Q. Shu,
2011. Antimicrobial activity of Lactobacillus
reuteri DPC16 supernatants against selected
food borne pathogens. World Journal of
Microbiology and Biotechnology (Impact
Factor: 1.78). 04/2011; 27(4):991-998.
Tài liꢄu tiếng Anh
Nirunya, B., C. Suphitchaya and H. Tipparat,
2008. Screening of lactic acid bacteria from
gastrointestinal tracts of marine fish for their
potential use as probiotics. Songklanakarin
J. Sci. Technol.30 (Suppl.1), 141-148, April
2008.
Allameh, S.K., F.M. Yusoff, H.M. Daud, E. Ringø,
A.Ideris and C. R.Saad, 2013. Characterization
of probiotic Lactobacillus fermentum isolated
from snakehead, Channa striatus, stomach.
Journal of the World Aquaculture Society.
Volume 44, Issue 6, pages 835–844, December
2013.
65
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
SCREENING OF LATIC ACID BACTERIA FOR THEIR
ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST Aeromonas hydrophila
CAUSING HEMORRHAGIC DISEASE IN TRA CATFISH
(Pangasianodon hypophthalmus)
Tran Thi Ngoc Phuong1*, Dang Thi Hoang Oanh1
ABSTRACT
The research was conduted to isolate acid lactic bacteria from the gastroinstestinal tracts of wild
freshwater catfish and then screen for their antimicrobial activity against Aeromonas hydrophila
causing Hemorrhagic disease in cultured Tra catfish. As the result, 96 strains of lactic acid bac-
teria which had inhibitory activity against indicator bacteria Escherichia coli were selected with
29 strains isolated from stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)), 24
strains from Mystus nemurus (Valenciennes, 1839), 21 strains from Pangasius larnaudii (Bocourt,
1866), 12 strains from Clarias macrocephalus (Gunther, 1864) and 8 strains from Pangasius larn-
audii (Bocourt, 1866). The result of Gram staining and biochemical characteristic tests illustrated
most of selected strains of lactic acid bacteria were Gram-positive; nonsporulating; spherical, oval,
short rod or long rod shape; negative oxidase and negative catalase. The result of antagonistic activ-
ity determination indicated that 46 LAB strains exhibited their inhibitory activity and three of them
presented the ability to produce bacteriocin-like substances.
Keywords: Aeromonas hydrophila, antimicrobial activity, lactic acid bacteria, probiotic.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 25/11/2016
Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016
Ngày duyệt đăng: 05/01/2017
1 College of Aquacutulre and Fisheries, Cantho University.
* Email: [email protected]
66
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
12 trang
16040
Free
Bạn đang xem tài liệu "Sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- sang_loc_vi_khuan_lactic_co_kha_nang_khang_vi_khuan_aeromona.pdf
