Phân lập và khảo sát đặc tính probiotic của các chủng Bacillus spp. từ môi trường ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng Tháp

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA CÁC

CHỦNG BACILLUS spp. TỪ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA

TẠI TỈNH ĐꢀNG THÁP

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh¹, Văn Thị Thúy¹, Nguyễn Văn Chắc²

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6/2013 đến tháng 8/2013 tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên

cứu Nuôi trꢀng Thủy sản 2. Vật liệu cho quá trình phân lập (bao gꢀm 40 mẫu hệ tiêu hꢁa cá tra giống và

thương phꢂm, 6 mẫu nước và 6 mẫu bꢃn ao nuôi cá tra) được thu thập từ hai huyện Thanh Bình và Hꢀng Ngự

thuộc tỉnh Đꢀng Tháp. Quá trình phân lập các chủng vi khuꢂn cꢁ đặc tính probiotic thuộc nhꢁm Bacillus spp.

được thực hiện theo 3 bước. Sàng lọc bước một dựa trên đặc điểm hình thái (Gram dương, trực khuꢂn, sinh

nội bào tử) và phản ứng catalase dương tính, kết quả cꢁ 76 chủng cꢁ được các đặc điểm hình thái tiêu biểu

cho nhꢁm Bacillus. Kết quả sàng lọc bước hai dựa trên khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào (protease,

amylase, lipase, cellulase) cho thấy cꢁ 46 chủng cꢁ khả năng sinh từ 3 loại enzyme trở lên. Kết quả sàng lọc

bước ba dựa vào khả năng đối kháng với các chủng vi khuꢂn gây bệnh (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi,

V. parahaemolyticus, V. alginolyticus) bằng phương pháp thạch khuếch tán và vạch thẳng vuông gꢁc, cho thấy

cꢁ 11 chủng đối kháng với ít nhất 1 trong 4 chủng vi khuꢂn kiểm định. 11 chủng Bacillus đã tuyển chọn được

lưu giꢄ trong bộ sưu tập giống của Phòng Sinh học Thực nghiệm và cꢁ tiềm năng ứng dụng làm probiotic

trong nuôi trꢀng thủy sản.

Từ khꢁa: Bacillus, cá tra, đối kháng, enzyme ngoại bào, probiotic.

I. MỞ ĐẦU

Nhꢁm vi khuꢂn Bacillus spp. là một

spp. cꢁ mặt trong đa số các chế phꢂm vi sinh lưu

hành trên thị trường trong nước và trên thế giới.

Hiện nay, trên thế giới cꢁ hàng trăm sản phꢂm

thương mại của các chế phꢂm vi sinh cꢁ chứa

nhꢁm Bacillus trong thành phần, được sử dụng

cho người, động vật nuôi và nuôi trꢀng thủy sản

(Hong và ctv., 2005).

chi lớn (với 51 loài đã được định danh chính

xác và nhiều loài chưa được phân loại rõ ràng),

thuộc họ Bacillaceae. Đặc điểm chung của chi

Bacillus là vi khuꢂn hình que, Gram dương,

catalase dương tính, là vi khuꢂn hiếu khí hoặc

kỵ khí tꢃy nghi, cꢁ phổ chịu đựng pH, nhiệt độ,

độ muối rộng. Đa số các loài vi khuꢂn thuộc

chi Bacillus cꢁ khả năng sinh nội bào tử, giúp

cho chúng đạt được nhꢄng ưu thế khi sử dụng

làm chế phꢂm vi sinh như thời gian bảo quản

dài, dễ dàng vận chuyển, sức đề kháng cao với

điều kiện khô hạn và chịu được nhiệt độ cao đến

60-70^oC. Với nhꢄng ưu điểm nêu trên, Bacillus

Nhꢁm Bacillus spp. đã và đang được ứng

dụng rất rộng rãi trong nuôi trꢀng thủy sản. Việc

sử dụng Bacillus spp. như là vi khuꢂn probiotic

đã giúp nâng cao tăng trưởng, tăng sức đề kháng

bệnh và tăng cường hoạt động của hệ enzyme

đường ruột đối với các đối tượng giáp xác và

cá biển như tôm thẻ chân trắng Litopenaeus

vannamei (Liu và ctv., 2010; Nimrat và ctv.,

¹Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trꢀng Thủy sản 2

Email: [email protected]

²Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hꢀ Chí Minh

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

71

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

2012; Zokaeifar và ctv., 2012), ấu trꢃng tôm được nuôi cấy trong môi trường chứa 30 g L^-1

hꢃm Homarus gammarus (Daniels và ctv.,

2010), ấu trꢃng cá tráp (Avella và ctv., 2010), ấu

trꢃng cá bống mú Epinephelus coioides (Sun và

ctv., 2013), cá bơn Paralichthys olivaceus (Cha

và ctv., 2013).

chất thải từ ao nuôi tôm như là nguꢀn cacbon

và nitơ duy nhất. Dịch protease thô thu được

cꢁ chứa ít nhất 7 loại protease khác nhau, được

ứng dụng trong việc tách đạm để thu hꢀi chitin

từ chất thải ao nuôi tôm và trong quá trình phân

hủy lông vũ của gia cầm, và cꢁ tiềm năng ứng

dụng trong nhiều quá trình công nghệ sinh học

khác (Haddar và ctv., 2011).

Cꢁ khá nhiều báo cáo về các chủng Bacillus

spp. được phân lập từ môi trường nuôi trꢀng

thủy sản. Chúng được tìm thấy trong môi trường

nước, lớp bꢃn đáy ao, hệ tiêu hꢁa của cá, giáp

xác, nhuyễn thể hai mảnh vỏ và tôm (Sharmila

và ctv., 1996; Gatesoupe, 1999).

Khả năng sản sinh các hợp chất kháng

khuꢂn được xem như là một trong nhꢄng cơ

chế chủ yếu để ức chế và loại trừ các nhꢁm vi

sinh vật gây bệnh trong hệ tiêu hꢁa cũng như

trong môi trường. Nhꢁm vi khuꢂn Bacillus

cꢁ khả năng tiết ra một số lượng lớn các hợp

chất kháng khuꢂn. Nhꢁm hợp chất này bao

gꢀm bacteriocin, các hợp chất ức chế tương

tự bacteriocin (Subtilin, Coagulin), các chất

kháng sinh (Surfactin, Iturins A, C, D, E,

Bacilysin) (Urdaci và Pinchuk, 2004). Nhiều

chủng Bacillus chứa trong thành phần của các

chế phꢂm vi sinh thương mại được biết đến với

khả năng sản xuất chất kháng khuꢂn. Chủng B.

clausii trong sản phꢂm Enterogermina^®cꢁ khả

năng tiết ra các hợp chất kháng khuꢂn với hoạt

tính ức chế các vi khuꢂn Gram dương (Duc và

ctv., 2004). Chủng B. polyfermenticus chứa

trong sản phꢂm Bispan của Hàn Quốc sản xuất

một loại bacteriocin nhạy cảm với protease và

không bền với nhiệt, polyfermenticum, cũng

cꢁ đặc tính đối kháng với nhꢁm vi khuꢂn Gram

dương (Lee và ctv., 2001). Chủng B. subtilis

var. natto cꢁ khả năng ức chế nấm gây bệnh

(Candida albicans) trong đường ruột, thông

qua việc tiết ra hợp chất kháng khuꢂn surfactin

(Nagal và ctv., 1996).

Hai cơ chế tác động chủ yếu của nhꢁm

Bacillus spp., đꢁ là khả năng sinh các enzyme

ngoại bào giúp hỗ trợ tiêu hꢁa và khả năng

sinh các hợp chất kháng khuꢂn đối kháng với

vi sinh vật gây bệnh. Trong số các nghiên cứu

về khả năng sinh enzyme ngoại bào của nhꢁm

Bacillus spp., cꢁ thể kể đến các nghiên cứu của

Ghosh và ctv. (2002), Nejad và ctv. (2006) và

Wang (2007).

Các enzyme ngoại bào cꢁ khả năng tiết

ra bởi Bacillus spp. bao gꢀm 4 loại enzyme

chính: protease, amylase, lipase và cellulase.

Trong số đꢁ các protease kiềm nhận được sự

quan tâm lớn do khả năng ứng dụng cao của

nhꢁm enzyme này. Theo nghiên cứu của Dias

và ctv. (2008), hai chủng Bacillus, B. subtilis

và một chủng hoang dại Bacillus sp. phân lập

từ quá trình lên men cà phê ở Brazil, được

đánh giá khả năng tiết ra các protease kiềm.

Các chủng này được nuôi cấy trong môi trường

dinh dưꢅng cꢁ chứa các nꢀng độ khác nhau của

bột phô mai trong 72 giờ. Hoạt tính protease

cực đại đạt được sau 24 giờ (tương ứng với giai

đoạn cuối của pha tăng trưởng), đạt 839,8 U

mg^-1đối với B. subtilis và 975,9 U mg^-1đối với

chủng hoang dại. Chủng B. licheniformis RP1

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành

phân lập một số chủng Bacillus spp. từ môi

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

72

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

2.1. Vật liệu

Vật liệu cho quá trình phân lập bao gꢀm

trường ao nuôi cá tra tại tỉnh Đꢀng Tháp theo

hai tiêu chí là khả năng sinh enzyme ngoại bào

và khả năng đối kháng với vi khuꢂn gây bệnh,

nhằm đánh giá khả năng sử dụng các chủng này

làm chế phꢂm vi sinh cho nuôi trꢀng thủy sản.

mẫu bꢃn, nước thu từ ao nuôi cá tra giống và

thương phꢂm, hệ tiêu hꢁa cá tra giống và thương

phꢂm, thu từ huyện Thanh Bình và huyện Hꢀng

Ngự thuộc tỉnh Đꢀng Tháp. Số lượng mẫu thu

được mô tả trong Bảng 1.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Bảng 1: Số lượng mẫu thu từ môi trường ao nuôi cá tra, tỉnh Đꢀng Tháp

Địa điểm

Loại mẫu

Nước

Bùn

Hệ tiêu hóa

Thanh Bình, Đồng Tháp (cá thương phẩm)

3

10

Hồng Ngự, Đồng Tháp (cá giống)

Tổng

3

6

3

6

30

40

2.2. Phương pháp nghiên cứu

dương, sinh nội bào tử và catalase dương tính.

Tiến hành nhuộm Gram các chủng đã phân lập

được và quan sát hình thái và sự hiện diện của

nội bào tử dưới kính hiển vi (vật kính 100X).

Các tế bào Gram dương sẽ bắt màu tím, nội bào

tử (thường nằm ở vị trí trung tâm) không bắt

màu. Phản ứng catalase được thực hiện bằng

cách nhỏ một giọt dung dịch hydrogen peroxide

(H₂O₂) lên khuꢂn lạc đặt trên lame kính. Bọt khí

xuất hiện trong vòng 10 giây thể hiện phản ứng

catalase dương tính.

2.2.1. Sàng lọc các chủng Bacillus từ các

mẫu đã thu

Trước tiên các mẫu được xử lý để thu thập

các hỗn hợp vi sinh vật. Mẫu hệ tiêu hꢁa (chỉ thu

phần ruột non) được cắt nhỏ, cho vào ống falcon

cꢁ chứa 1ml nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) và

nghiền bằng chày cho đến khi mẫu được đꢀng

nhất. Mẫu bꢃn được pha loãng trong nước muối

sinh lý (1 g bꢃn trong 9 ml nước muối sinh lý),

để lắng và thu phần dịch nổi. Mẫu nước được

lấy trực tiếp từ mẫu đã thu.

2.2.2. Phân lập dựa vào khả năng sinh các

enzyme ngoại bào

Tiếp theo, tiến hành loại bỏ các tế bào sinh

dưꢅng bằng cách gia nhiệt mẫu trong bể ổn nhiệt

ở 75^oC trong 15 phút. Hút 100 µl dịch đã gia nhiệt

trải trên môi trường DSM (Difco Sporulation

Medium) agar và ủ ở 30^oC trong 24 giờ. Lựa

chọn các khuꢂn lạc riêng lẻ dựa vào sự khác biệt

về hình thái và màu sắc, làm thuần bằng cách cấy

ria lặp lại trên môi trường DSM agar.

a. Thử nghiệm amylase

Phản ứng sinh amylase (cꢁ tác dụng phân

hủy tinh bột thành các đường đơn) được nhận

biết khi nhỏ dung dịch lugol vào trong môi

trường thạch nuôi cấy cꢁ chứa tinh bột. Phản

ứng dương tính thể hiện qua việc tạo thành vòng

trong suốt xung quanh khꢁm khuꢂn lạc. Trong

trường hợp phản ứng âm tính thì môi trường sẽ

cꢁ màu xanh đậm xung quanh khuꢂn lạc.

Bước chọn lọc chính dựa trên các tiêu chí

sau đây: chọn lọc các chủng trực khuꢂn Gram

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

73

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

b. Thử nghiệm lipase

b. Phương pháp thạch khuếch tán (agar

diffusion) (Vaseeharan và Ramasamy, 2003)

Môi trường thử nghiệm được bổ sung CaCl₂

và Tween 80 (một loại hợp chất béo). Nếu vi

khuꢂn cꢁ khả năng tiết ra enzyme lipase sẽ phân

giải Tween 80 tạo các acid béo tự do, các acid

béo này sẽ kết tủa khi cꢁ mặt Ca²⁺, tạo nên vꢃng

mờ đục bên dưới và xung quanh khuꢂn lạc.

50 µl dịch vi khuꢂn gây bệnh được tráng

trên đĩa NA. Sau đꢁ dꢃng ống sắt hình trụ tiệt

trꢃng khoan 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch, dꢃng nhíp

tiệt trꢃng gắp bỏ các khối thạch để tạo thành các

giếng.

c. Thử nghiệm protease (thử nghiệm hai

loại enzyme gelatinase và caseinase)

50 µl dịch vi khuꢂn khảo sát được tráng trên

đĩa NA trước đꢁ 24 giờ, ủ ở 30^oC. Dꢃng ống sắt

hình trụ tiệt trꢃng khoan 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch,

dꢃng nhíp tiệt trꢃng gắp các khối thạch chuyển

sang các giếng bên đĩa NA đã tráng vi khuꢂn

gây bệnh.

Ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30^oC. Tiến

hành đo khoảng cách vòng kháng khuꢂn (D) tạo

thành xung quanh các giếng (nếu cꢁ) sau 24 giờ

và 48 giờ.

Đối với nhꢄng vi khuꢂn sinh enzyme

gelatinase, enzyme này sẽ phân hủy gelatine (bổ

sung trong môi trường nuôi cấy) tạo vòng trong

xung quanh khꢁm khuꢂn lạc khi cꢁ mặt dung

dịch TCA (Trichloric Acetic Acid) 25%.

Đối với nhꢄng vi khuꢂn sinh enzyme

caseinase, enzyme này sẽ phân hủy casein hiện

diện trong môi trường Skim Milk Agar 1%, tạo

vꢃng phân giải trong suốt xung quanh khꢁm

khuꢂn lạc.

Đánh giá mức độ đối kháng theo 3 mức:

D > 5 mm: Đối kháng mạnh (+++);

5 ≥ D > 2 mm: Đối kháng trung bình (++);

D ≤ 2 mm: Đối kháng yếu (+).

III. KẾT QUẢ

d. Thử nghiệm cellulase

Chủng vi khuꢂn khảo sát được nuôi cấy

trên môi trường cꢁ bổ sung 1% CMC (Carbonyl

Methyl Cellulose). Nhꢄng chủng sinh enzyme

cellulase sẽ phân giải CMC, sau khi nhuộm với

lugol sẽ tạo các vòng trong suốt xung quanh

khꢁm khuꢂn lạc.

3.1. Kết quả sàng lọc dựa trên đặc điểm

hình thái, phản ứng catalase và khả năng

sinh enzyme ngoại bào

2.2.3. Phân lập dựa vào khả năng đối kháng

với vi khuẩn gây bệnh

Từ 52 mẫu thu ban đầu, sau khi gây sốc

nhiệt và trải đĩa trên môi trường DSM, kết

quả chọn được 123 khuꢂn lạc dựa vào sự khác

nhau về địa điểm thu mẫu, hình thái và màu sắc

khuꢂn lạc. Sau đꢁ các khuꢂn lạc được cấy ria

làm thuần trên môi trường NA. Tiếp theo tiến

hành sàng lọc bước một dựa vào hình thái vi

khuꢂn và phản ứng catalase. Chúng tôi chọn lọc

được 76 chủng Gram dương, hình que, sinh nội

bào tử và phản ứng catalase dương tính.

Sử dụng phương pháp vạch thẳng vuông gꢁc

(cross-streak) và phương pháp thạch khuếch tán

(agardiffusion).Thựchiệntrên4chủnggâybệnh

kiểm định: Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus,

V. alginolyticus, Edwardsiella ictaluri.

a. Phương pháp vạch thẳng vuông góc

(cross-streak) (Jayaseelan và ctv., 2013)

Chủng vi khuꢂn khảo sát được cấy thành

một đường thẳng và ở giꢄa đĩa thạch Nutrient

Agar (NA). Tiếp tục cấy vi khuꢂn gây bệnh

theo các đường vuông gꢁc với đường cấy của vi

khuꢂn khảo sát. Ủ ở 30^oC. Tiến hành đo khoảng

cách kháng khuꢂn sau 24 giờ và 48 giờ.

Các chủng này tiếp tục được chọn lọc

bước hai, khảo sát khả năng sinh 5 loại enzyme

ngoại bào (gelatinase, caseinase, amylase,

lipase và cellulase). Kết quả sinh các enzyme

ngoại bào được minh họa trong hình 1.

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

74

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

Hình 1: Kết quả khảo sát khả năng sinh

enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus spp.

3.2. Kết quả sàng lọc dựa vào khả năng đối

kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh

A) Các khuꢂn lạc sinh gelatinase;

B) Các khuꢂn lạc sinh caseinase;

C) Các khuꢂn lạc sinh amylase;

D) Các khuꢂn lạc sinh cellulase.

46 chủng đã được sàng lọc ở bước hai (cꢁ

khả năng sinh từ 3 loại enzyme trở lên), tiếp tục

được sàng lọc bước ba, dựa trên khả năng đối

kháng với các chủng vi khuꢂn gây bệnh. Kết

quả cho thấy cꢁ 11 chủng cꢁ khả năng đối kháng

với ít nhất 1 trong 4 chủng vi khuꢂn gây bệnh

kiểm định (Bảng 3). Trong đꢁ cꢁ 6 chủng đối

kháng mạnh với E. ictaluri (khoảng cách vòng

kháng khuꢂn 8-18 mm), 2 chủng đối kháng

mạnh với V. harveyi (khoảng cách vòng kháng

Kết quả trong bảng 2 cho thấy tổng cộng

cꢁ 46/76 chủng khảo sát cꢁ khả năng sinh từ 3

loại enzyme trở lên. Trong đꢁ cꢁ 14 chủng sinh

3 loại enzyme, 9 chủng sinh 5 loại enzyme. Số

chủng sinh 4 enzyme là 23 chủng, chiếm 50% khuꢂn 7,5-8 mm), 2 chủng đối kháng mạnh với

V. parahaemolyticus (khoảng cách vòng kháng

trên tổng số chủng vi khuꢂn khảo sát.

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

75

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

khuꢂn 11-11,5 mm) và 2 chủng đối kháng mạnh

Từ 123 khuꢂn lạc ban đầu, chúng tôi đã

sàng lọc được 11 chủng Bacillus (chiếm 8,9%)

sau quá trình sàng lọc qua ba bước. Các chủng

này được giꢄ giống trong Ngân hàng vi sinh vật

và cꢁ tiềm năng được sử dụng làm probiotic

trong nuôi trꢀng thủy sản.

với V. alginolyticus (khoảng cách vòng kháng

khuꢂn 9-10 mm). Đặc biệt chủng B14 đối kháng

mạnh với hai chủng E. ictaluri và V. harveyi,

chủng B98 đối kháng mạnh với E. ictaluri và V.

parahaemolyticus, chủng B90 đối kháng mạnh

với V. parahaemolyticus và V. alginolyticus.

Bảng 2: Các chủng Bacillus spp. cꢁ khả năng sinh từ 3 loại enzyme ngoại bào trở lên

KH chủng

Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Số enzyme

Amylase

Cellulase

Lipase

Caseinase

Gelatinase

ngoại bào

B1

+

-

+

-

+

-

+

-

4

5

3

4

5

4

5

4

3

4

3

4

3

4

5

4

B4

B6

-

B7

-

B8

-

B13

B14

B15

B18

B19

B23

B26

B27

B29

B30

B32

B35

B36

B38

B39

B48

B51

B56

B58

B61

B68

B70

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

76

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

B75

B78

B80

B81

B84

B86

B87

B89

B90

B92

B93

B97

B98

B99

B102

B103

B110

B122

B123

+

-

+

-

+

-

+

-

4

5

3

4

3

5

4

3

4

3

4

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

+

B

A

Hình 2: Khả năng đối kháng bởi các chủng Bacillus spp. với các chủng vi khuꢂn kiểm định bằng

phương pháp vạch thẳng vuông gꢁc (chủng B14 đối kháng với chủng E. ictaluri (A) và phương

pháp thạch khuếch tán (chủng B90 đối kháng với chủng V. parahaemolyticus) (B).

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

77

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

Bảng 3: Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp sau 48 giờ

Thạch khuếch tán

Vạch thẳng vuông góc

E.

V. para-

haemo

lyticus

V.

E.

V. para-

haemo-

lyticus

V.

KH

Nguồn gốc

icta-

luri

har-

veyi

algino-

lyticus

icta-

luri

har-

veyi

algino-

lyticus

B7

Mẫu nước ao cá thịt

Mẫu nước ao cá giống

Mẫu bùn ao cá thịt

Mẫu bùn ao cá giống

Hệ tiêu hóa cá thịt

Hệ tiêu hóa cá giống

+++

-

+++

-

B14

B15

B27

B30

B35

B51

B56

B90

B97

B98

-

+++

-

+++

-

+++

++

+++

+

-

+

-

+++

-

+

-

+

-

+++

-

+++

-

+++

-

+++

-

+

-

+++

IV. THẢO LUẬN

bờ biển tây nam Ấn Độ. Trong số 4.870 khuꢂn

lạc được sàng lọc, chỉ cꢁ khoảng 1% thể hiện

đặc tính đối kháng mạnh đối với 6 chủng gây

bệnh trong nuôi trꢀng thủy sản (Vibrio harveyi,

Với nhꢄng đặc điểm ưu việt như khả năng

tạo bào tử, khả năng sinh enzyme ngoại bào

và khả năng tiết ra các hợp chất kháng khuꢂn,

nhꢁm vi khuꢂn Bacillus spp. được nghiên cứu V. anguillarum, V. alginolyticus, V. vulniﬁcus,

nhiều nhất trong số các nhꢁm vi sinh vật cꢁ tiềm

năng ứng dụng làm probiotic. Theo một nghiên

cứu gần đây thực hiện bởi nhꢁm tác giả Nair và

ctv. (2012) nhằm khảo sát sự đa dạng của quần

xã vi sinh vật cꢁ đặc tính đối kháng từ các mẫu

thu thập từ vꢃng cửa sông ở Cochin, dọc theo

V. parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila).

Theo kết quả định danh bằng phương pháp

sinh hꢁa và giải trình tự gen 16S rRNA, các

chủng đối kháng thuộc hai nhꢁm Bacillus và

Pseudomonas, trong đꢁ nhꢁm Bacillus chiếm

đến 81%.

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

78

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

Cꢁ khá nhiều nghiên cứu tiến hành phân lập nuôi tôm. Kết quả cho thấy trong số 7 chủng

các chủng Bacillus từ môi trường thủy sản hoặc khảo sát chủng Dahb1 cho vꢃng đối kháng

với mục tiêu ứng dụng trong nuôi trꢀng thủy mạnh nhất (6-12 mm, phương pháp vạch thẳng

sản. Phương pháp sàng lọc chủ yếu được sử vuông gꢁc) đối với 162 chủng Vibrio spp. phân

dụng là thử khả năng đối kháng với các chủng vi lập từ trại giống và ao nuôi tôm sú, bao gꢀm V.

khuꢂn gây bệnh cần quan tâm. Chủng Bacillus harveyi (53 chủng), V. anguillarum (42 chủng),

subtilis VSG1, phân lập từ hệ tiêu hꢁa của cá V. vulniﬁcus (31 chủng) và V. damselae (36

trôi Labeo rohita, cꢁ khả năng đối kháng rất chủng). Điều đáng lưu ý là kết quả khoảng cách

mạnh với 6 chủng Aeromonas hydrophila gây vꢃng đối kháng trong nghiên cứu của các nhꢁm

bệnh trên cá, với khoảng cách vꢃng đối kháng tác giả Nair và ctv. (2011), Luis-Villasenor và

19-21 mm theo phương pháp thạch khuếch tán ctv. (2011) và Jayaseelan và ctv. (2013) là tương

(Giri và ctv., 2011). Tương tự, chủng B. cereus tự với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Còn

TC-2 phân lập từ chất thải phụ phꢂm trái dừa, khoảng cách vꢃng đối kháng trong nghiên cứu

thể hiện hoạt tính kháng khuꢂn khá mạnh (theo của nhꢁm tác giả Giri và ctv. (2011) là cao hơn

phương pháp vạch thẳng vuông gꢁc) đối với nhiều so với nghiên cứu của chúng tôi.

V. harveyi (khoảng cách vꢃng đối kháng 13

Các nghiên cứu của một số nhꢁm tác giả đã

mm) và V. parahaemolyticus (khoảng cách

khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của

vꢃng đối kháng 12 mm) (Nair và ctv., 2011).

nhꢁm vi khuꢂn Bacillus spp. cũng như khả năng

Theo Yilmaz và ctv. (2006), B. cereus cꢁ khả

kích thích vật chủ tiết ra các enzyme tiêu hꢁa.

năng tiết ra các chất kháng sinh như cerexin và

Wang (2007) và Nejad và ctv. (2006) đã chứng

zwittermicin, điều này giải thích cho hoạt tính

minh khi bổ sung một lượng vi khuꢂn Bacillus

kháng khuꢂn mạnh ở loài vi khuꢂn này. Luis-

vào thức ăn nuôi tôm thì hoạt tính các enzyme

Villasenor và ctv. (2011) nghiên cứu đặc tính

tiêu hꢁa lipase, cellulase, protease và amylase

của tôm đều tăng cꢁ khác biệt về mặt thống kê

so với nghiệm thức đối chứng. Các tác giả này

cũng cho rằng chính sự hiện diện của Bacillus

đã kích thích vật chủ sản xuất ra một lượng lớn

enzyme ngoại bào. Ngoài ra, nghiên cứu của

Ghosh và ctv. (2002) cho thấy Bacillus pumilus

cꢁ khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào bao

gꢀm amylase và cellulase, là nhꢄng enzyme

quan trọng trong hoạt động tiêu hꢁa của cá bột.

Với khả năng tiết ra các enzyme tiêu hꢁa ngoại

bào nꢁi trên, nhꢁm Bacillus spp. cꢁ thể được sử

dụng thông qua con đường bổ sung vào thức ăn

để đưa vào hệ tiêu hꢁa của vật chủ, tại đꢁ chúng

cꢁ thể thể hiện các đặc tính probiotic của mình,

cụ thể là hỗ trợ cho hệ tiêu hꢁa và nâng cao sức

tăng trưởng của vật chủ.

đối kháng với nhꢁm Vibrio gây bệnh bởi 4

chủng Bacillus sp. phân lập từ hệ tiêu hꢁa của

tôm chân trắng, bằng phương pháp đổ thạch

lớp kép và phương pháp thạch khuếch tán. Kết

quả của phương pháp thạch lớp kép cho thấy

chỉ cꢁ hai chủng (YC5-2 và YC2-a) ức chế sự

phát triển của V. campbellii và V. vulniﬁcus, với

khoảng cách vòng đối kháng từ 5-18 mm. Kết

quả của phương pháp thạch khuếch tán cho thấy

cꢁ 4 chủng (YC5-2, YC2-a, YC3-b và C2-2) ức

chế sự tăng trưởng của V. parahaemolyticus và

V. harveyi, với khoảng cách vòng đối kháng từ

11-17,5 mm. Cả 4 chủng khảo sát đều không

thể hiện sự ức chế đối với V.alginolyticus. Mới

đây, Jayaseelan và ctv. (2013) khảo sát hoạt

tính đối kháng với nhꢁm Vibrio của 7 chủng

probiotic B. licheniformis được phân lập từ ao

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

79

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

iniae and as water additives. Aquaculture 402-

V. KẾT LUẬN

403, 50-57.

1. Từ 52 mẫu thu thập từ hệ tiêu hꢁa cá

tra, nước và bꢃn ao nuôi cá tra tại tỉnh Đꢀng

Tháp trong năm 2013, chúng tôi chọn lọc ban

đầu được 76 chủng với nhꢄng đặc điểm hình

thái tiêu biểu cho nhꢁm Bacillus: Gram dương,

hình que, sinh nội bào tử và phản ứng catalase

dương tính.

Daniels,C.L.,Merriﬁeld,D.L.,Boothroyd,D.P.,Davies,

S.J., Factor, J.R., Arnold, K.E., 2010. Effect of

dietary Bacillus spp. and mannan oligosaccharides

(MOS) on European lobster (Homarus gammarus

L.) larvae growth performance, gut morphology

and gut microbiota. Aquaculture 304, 49-57.

2. Kết quả phân lập dựa vào khả năng sinh

enzyme ngoại bào cho thấy cꢁ 46 chủng cꢁ khả

Dias, D.R., Vilela, D.M., Silvestre, M.P.C., Schwan,

R.F., 2008. Alkaline protease from Bacillus sp.

isolated from coffee bean grown on cheese whey.

World J. Microbiol. Biotechnol. 24, 2027-2034.

năng sinh từ 3 loại enzyme trở lên. Trong đꢁ cꢁ

23 chủng sinh 4 enzyme, chiếm 50% trên tổng

số chủng vi khuꢂn khảo sát.

Duc, L.H., Hong, H.A., Barbosa, T.M., Henriques,

A.O., Cutting, S.M., 2004. Characterization of

Bacillus probiotics available for human use. Appl.

Environ. Microbiol. 70, 2161-2171.

3. Kết quả phân lập dựa vào khả năng đối

kháng với vi khuꢂn gây bệnh bằng phương

pháp thạch khuếch tán và phương pháp vạch

thẳng vuông gꢁc, chúng tôi sàng lọc được 11

chủng cꢁ khả năng đối kháng với ít nhất 1

trong 4 chủng vi khuꢂn gây bệnh (Edwardsiella

ictaluri, Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus,

V. alginolyticus). 11 chủng Bacillus spp. được

tuyển chọn cꢁ tiềm năng được sử dụng làm

probiotic trong nuôi trꢀng thủy sản.

Gatesoupe, F.J., 1999. The use of probiotics in

aquaculture. Aquaculture 180, 147-165.

Ghosh, K., Sen, S.K., Ray,A.K., 2002. Characterization

of Bacilli isolated from gut of rohu, Labeo rohita,

ﬁngerlings and its signiﬁcance in digestion. J.

Appl. Aquaculture 12(3), 33-42.

Giri, S.S., Sukumaran, V., Sen, S.S., Vinumonia,

J., Banu, B.N., Jena, P.K., 2011. Antagonistic

activity of cellular components of potential

probiotic bacteria, isolated from the gut of Labeo

rohita, against Aeromonas hydrophila. Probiotics

& Antimicro. Prot. 3, 214-222.

LỜI CÁM ƠN

Tác giả chân thành cảm ơn các bạn cộng

tác viên của đề tài và các bạn đꢀng nghiệp của

Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên

cứu Nuôi trꢀng Thủy sản 2 đã hỗ trợ cho

nghiên cứu thành công.

Haddar,A., Hmidet, N., Ghorbel-Bellaaj, O., Fakhfakh-

Zouari, N., Sellami-Kamoun, A., Nasri, M.,

2011. Alkaline proteases produced by Bacillus

licheniformis RP1 grown on shrimp wastes:

Application in chitin extraction, chicken feather-

degradation and as a dehairing agent. Biotechnol.

Bioprocess Engineer. 16, 669-678.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Avella, M.A., Gioacchini, G., Decamp, O., Makridis,

P., Bracciatelli, C., Carnevali, O., 2010.

Application of multi-species of Bacillus in sea

bream larviculture. Aquaculture 305, 12-19.

Hong, H.A., Duc, L.H., Cutting, S.M., 2005. The use

of bacterial spore formers as probiotics. FEMS

Microbiol. Rev. 29, 813-835.

Cha, J.-H., Rahimnejad, S., Yang, S.-Y., Kim, K.-W.,

Lee, K.-J., 2013. Evaluations of Bacillus spp. as

dietary additives on growth performance, innate

immunity and disease resistance of olive ﬂounder

(Paralichthys olivaceus) against Streptococcus

Jayaseelan, B.D., Vaseeharan, B., Maharajan, A.,

Shanthi, S., Vinoj, G., 2013. Vibriostatic effects

of probiotic Bacillus licheniformis Dahb1 and its

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

80

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus.

molecular phylogeny resolved through RAPD

Aquaculture 252, 516-524.

markers. Ann. Microbiol., DOI 10.1007/s13213-

013-0623-z.

Nimrat, S., Suksawat, S., Boonthai, T., Vuthiphandchai,

V., 2012. Potential Bacillus probiotics enhance

bacterialnumbers, waterqualityandgrowthduring

early development of white shrimp (Litopenaeus

vannamei). Vet. Microbiol. 159, 443-450.

Lee, K.H., Jun, K.D., Kim, W.S., Paik, H.D., 2001.

Partial characterization of polyfermenticin

SCD, a newly identiﬁed bacteriocin of Bacillus

polyfermenticus. Lett. Appl. Microbiol. 32, 146-

151.

Sharmila, R., Jawahar Abraham, T., Sundararaj, V.,

1996. Bacterial ﬂora of semi-intensive pond

reared Penaeus indicus and the environment. J.

Aquaculture Tropics 11, 193-203.

Liu, K.-F., Chiu, C.-H., Shiu, Y.-L., Cheng, W., Liu,

C.-H., 2010. Effects of the probiotic, Bacillus

subtilis E20, on the survival, development, stress

tolerance, and immune status of white shrimp,

Litopenaeus vannamei larvae. Fish & Shellﬁsh

Immunol. 28, 837-844.

Sun, Y.-Z., Yang, H.-L., Huang, K.-P., Ye, J.-D.,

Zhang, C.-X., 2013. Application of autochthonous

Bacillus bioencapsulated in copepod to grouper

Epinephelus coioides larvae. Aquaculture 392-

395, 44-50.

Luis-Villasenor, I.E., Macías-Rodríguez, M.E., Gꢁmez-

Gil, B, Ascencio-Valle, F., Campa-Cꢁrdova, A.I.,

2011. Beneﬁcial effects of four Bacillus strains on

the larval cultivation of Litopenaeus vannamei.

Aquaculture 321, 136-144.

Urdaci, M.C., Pinchuk, I., 2004. Antimicrobial activity

of Bacillus probiotics. In: Bacterial spore formers:

probiotics and emerging applications (Ricca, E.,

Henriques, A.O. and Cutting, S.M., Eds.), pp.

171-182. Horizon Bioscience.

Nagal, S., Okimura, K., Kaizawa, N., Ohki, K.,

Kanatomo, S., 1996. Study on surfactin, a cyclic

depsipeptide. II. Synthesis of surfactin B2

produced by Bacillus natto KMD 2311. Chem.

Phar. Bull. Tokyo 44, 5-10.

Vaseeharan, B., Ramasamy, P., 2003. Control of

pathogenic Vibrio sp. by Bacillus subtilis BT23, a

possible probiotic treatment for black tiger shrimp

Penaeus monodon. Lett. Appl. Microbiol. 36, 83-87.

Nair, A.G.H., Donio, M.T.B.S., Viji, V.R.T.,

Michaelbabu, M., Citarasu, T., 2011. Isolation

from coconut retting efﬂuent of Bacillus cereus

TC-2 antagonistic to pathogenic Vibrios. Ann.

Microbiol. 61, 631-637.

Wang, Y.B., 2007. Effect of probiotics on growth

performance and digestive enzyme activity of the

shrimp Penaeus vannamei. Aquaculture 269, 259-

264.

Nair, A.V., Vijayan, K.K., Chakraborty, K., Antony,

M.L., 2012. Diversity and characterization of

antagonistic bacteria from tropical estuarine

habitats of Cochin, India for ﬁsh health

management. World J. Microbiol. Biotechnol. 28,

2581-2592.

Yilmaz, M., Soran, H., Beyatli, Y., 2006. Antimicrobial

activities of some Bacillus sp. strains isolated

from the soil. Microbiol. Res. 161, 127-131.

Zokaeifar, H., Balcázar, J.L., Saad, C.R., Kamarudin,

M.S., Sijam, K., Arshad, A., Nejat, N., 2012.

Effects of Bacillus subtilis on the growth

performance, digestive enzymes, immune gene

expression and disease resistance of white shrimp,

Litopenaeus vannamei. Fish & Shellﬁsh Immunol.

33, 683-689.

Nejad, S.Z., Rezaei, M.H., Takami, G.A., Lovett, D.L.,

Mirvagheﬁ, A.R., Shakouri, M., 2006. The effect

of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on

digestive enzyme activity, survival and growth in

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

81

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

ISOLATION AND EVALUATION OF PROBIOTIC PROPERTIES OF Bacillus

spp. FROM STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) POND

ENVIRONMENT IN DONG THAP PROVINCE

Nguyen Thi Ngoc Tinh¹, Van Thi Thuy¹, Nguyen Van Chac²

ABSTRACT

This study was conducted since June to August 2013, at the Department of Experimental Biology, Research

Institute for Aquaculture No2. The material for isolation (40 samples from striped catﬁsh’s gut, 6 water

samples and 6 sediment sample from the nursing and grow-out striped catﬁsh’s ponds) was collected from

Thanh Binh district and Hong Ngu district, Dong Thap province. The screening process for probiotic Bacillus

bacteria was undertaken in 3 steps. Step 1 which was based on morphological screening (Gram-positive, rod

shape and the presence of endospores) combined with catalase reaction, resulted in 76 isolates. Step 2 which

was based on the ability to excrete exogenous enzymes (protease, amylase, lipase, cellulase), resulted in 46

isolates excreting at least 3 enzymes. Step 3 was based on the antagonistic ability toward the aquatic patho-

gens (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus) and resulted in 11 isolates

which antagonized at least one pathogenic strain. These 11 isolates are being preserved in the culture collec-

tion of the Department of Experimental Biology and have potential to be used as probiotics in aquaculture.

Keywords: antagonistic ability; Bacillus; exogenous enzymes; probiotic; striped catﬁsh.

Người phản biện: TS. Đặng Tố Vân Cầm

Ngày nhận bài: 12/9/2013

Ngày thông qua phản biện: 20/9/2013

Ngày duyệt đăng: 15/10/2013

¹Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2.

Email: [email protected]

²Nong Lam University, Ho Chi Minh City

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013

82