Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinis)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ
MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS)
Ngành:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Hoàng Quân
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Hằng
MSSV: 1311100026
Lớp: 13DSH01
TP. Hồ Chí Minh, năm 2017
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
̀
LƠI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nôi
sư cua tôi dươi sư hương dân
tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM. Đê
̣ ̀ ́ ̣
dung trong đô an tôt nghiêp la công trinh nghiên cưu
́ ̀ ́
̀
thưc
̣
̣
̣
̃ cua ThS. Nguyễn Hoàng Quân – cán bộ kỹ thuật
̉
̉
́
́
̀
tai đươc
̣
tiê
Cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh Hoc
t qua co trong nghiên cưu la hoan toan trung thưc
́
n hanh nghiên cưu thưc
̣
̀
̀
́
nghiêm
̣
tai
̣
phong Thực nghiêm
̣
̣
Tp.
̀
HCM. Cac sô
́
liêu
̣ ̀
trach nhiêm vê lơi cam đoan nay.
̀ ̀
̣
va kê
́
̣
.Tôi xin
̉
́
̀
́
́
̀
̀
̀
hoan toan chiu
̣
̀
̀
́
Tp. HCM, ngay 20 thang 07 năm 2017
̀
́
̣ ̣
Sinh viên thưc hiên
Nguyễn Thị Thanh Hằng
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
̀
LƠI CẢM ƠN
Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến
Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ trang
thiết bị giúp em hoàn thành đề tài.
Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công
Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy cô khoa
Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như
dạy bảo và truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích giúp em hoàn thành khóa học cùa mình.
Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Hà Thị Loan – Phó Giám đốc Trung
tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM và ThS. Nguyễn Hoàng Quân đã tận tình hướng
dẫn và chỉ bảo kiến thức cho em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn toàn thể anh chị đang làm việc tại Trung tâm và các bạn sinh
viên cùng làm đề tài tại Trung tâm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài.
Con xin cám ơn ba mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng con khôn lớn.
Cám ơn anh chị em và người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp
đỡ và luôn cổ vũ tinh thần cho em.
Em xin chân thành cảm ơn.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2017
Sinh viện thực hiện
Nguyễn Thị Thanh Hằng
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG................................................................................................. ii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ........................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài......................................................................................1
2. Ý nghĩa của đề tài ...............................................................................................1
3. Đôi tương va pham vi nghiên cưu ......................................................................2
4. Mục đích nghiên cứu ..........................................................................................2
5. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................2
6. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................3
7. Kết quả đạt được.................................................................................................3
8. Bố cục đồ án .......................................................................................................3
1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật......................................................4
1.2. Giới thiệu về chi Stachys ...............................................................................17
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
1.3.4. Thành phần hóa học .............................................................................21
1.3.5. Giá trị dinh dưỡng................................................................................22
1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys .................................................................23
1.4.1. Kháng viêm và giảm đau......................................................................24
1.4.2. Chống oxy hóa .....................................................................................24
1.4.3. Chống lo âu ..........................................................................................25
1.4.4. Kháng khuẩn .......................................................................................26
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................29
2.2. Vật liệu và phương pháp................................................................................29
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ..............................................................................29
2.2.3. Môi trường nghiên cứu.........................................................................30
2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy ....................................................................30
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................30
2.3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................30
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................31
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo.......................................................................32
cây sùng thảo.............................................................................................................33
cây sùng thảo ngoài vườn ươm .................................................................................35
sùng thảo. ..................................................................................................................37
ươm ...........................................................................................................................47
4.1. Kết luận..........................................................................................................52
4.2. Kiến nghị........................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................53
1. Tài liệu Tiếng Việt............................................................................................53
2. Tài liệu Tiếng Anh............................................................................................53
PHỤ LỤC...................................................................................................................1
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây sùng thảo............................................................................................19
Hình 1.2. Củ sùng thảo..............................................................................................20
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy.............................................................................39
cấy. ............................................................................................................................46
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................51
i
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
DANH MỤC BẢNG
đoạn vườn ươm .........................................................................................................35
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy.............................................................................38
tuần nuôi cấy. ............................................................................................................43
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................48
ii
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
nuôi cấy .....................................................................................................................39
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy.............................................................................39
nuôi cấy .....................................................................................................................44
ươm sau 4 tuần trồng.................................................................................................48
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................49
iii
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D
2,4,5-T
ABA
BA
2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid
Trichlorophenoxyacetic acid
Abscisic acid
Benzyl Adenine
CNSH
ĐC
Công Nghệ Sinh Học
Đối chứng
GA
Gibberellin
IAA
3-Indole acetic acid
3-Indole butyric acid
Murashige – Skoog
Napthalene Acetic Acid
Phenylpropanoid Glycosides
Thành phố Hồ Chí Minh
IBA
MS
NAA
PhG
TP.HCM
iv
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam có một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu, trong số hơn 12.000
loài thực vật tại Việt Nam thì có gần 4.000 loài có công dụng làm thuốc với vùng phân
bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý hiếm trên thế giới
như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng,
Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú,… Theo kết quả điều
tra và đánh giá tại một số vùng, trồng cây dược liệu đem lại giá trị kinh tế to lớn hơn bất
kỳ loại cây lương thực, thực phẩm nào (có thể thu nhập trên 100 triệu đồng/ha).
Tuy nhiên theo báo cáo tháng 9/2016 của Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền (Bộ Y
tế) cho biết hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các
loại, nhưng Việt Nam mới chỉ tự cung cấp được khoảng 20% nguyên liệu để phục vụ
việc sản xuất thuốc trong nước, còn khoảng 80 - 85% vẫn phải nhập khẩu từ nước ngoài
(chủ yếu nhập từ Trung Quốc) và mới chỉ có 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn
gốc rõ ràng, rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay.
Cây sùng thảo là một loại cây đã được trồng làm thực phẩm ở nhiều nơi trên thế
giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp…. Củ sùng thảo giàu dinh dưỡng và chứa nhiều
hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe. Các bộ phận của cây và các chiết xuất từ cây sùng
thảo đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh,
bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi ở Trung Quốc. Các nghiên cứu về các loài cùng chi và
nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Stachys affinnis đã chứng minh chúng chứa
nhiều hoạt chất thứ cấp có nhiều công dụng như kháng viêm, chống oxy hóa, ngừa loãng
xương, điều trị ung thư, bệnh tiểu đường,….
Nắm bắt những cơ sở khoa học thực tiễn và nhu cầu của thị trường, nhóm nghiên
cứu đã tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo
(Stachys affinnis).
2. Ý nghĩa của đề tài
1
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
• Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học.
- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung thông
tin về cây sùng thảo, kỹ thuật nhân giống in vitro cây sùng thảo.
- Kết quả nghiên cứu có thể là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu
tiếp theo của cùng đối tượng hoặc một số giống cây có giá trị khác.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân
tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học.
• Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng quy trình nhân giống cây sùng thảo, tạo ra cây giống có chất lượng
cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.
́
3. Đôi tươn
Đôi tươn
cung câp tư phong nuôi câ
tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM.
Pham vi nghiên cưu trong đê
̣
g va pham vi nghiên cưu
̣
̀
́
́
̣
g nghiên cưu đươc
̣
sư dun
̣
g trong đê
̀
tai nay la cây sùng thảo vitro
̉
́
̀
̀
̀
đươc
̣
́
́
y mô tai
̣
phong Thực nghiêm
̣
cây trồng thuộc Trung
̀
̀
̀
̣
̀
tai nay la tâp
̣
trung khao sat anh hương cua chất
̉
̉
́
̉
̉
́
̀
̀
̀
điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA lên quá trình nhân chồi, tạo rễ của cây sùng thảo
và khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể: mụn xơ dừa, tro trấu,… đến sự sinh trưởng
của cây sùng thảo.
4. Mục đích nghiên cứu
- Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi
và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi
nhân giống in vitro.
- Đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở giai
đoạn vườn ươm.
5. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn
thân cây sùng thảo.
2
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
- Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo.
- Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai
đoạn vườn ươm.
6. Phương pháp nghiên cứu
̉
Cac thi nghiêm
̣
đươc
m 3 – 5 nghiêm
thu thâp đươc xư ly thô
̣
bô
́
tri theo kiêu hoan toan ngâu
̃
nhiên, đơn yê
thưc thi nghiêm đươc lăp lai
m SAS 9.4 va chương trinh
́
u tô
́
. Mô
̃
i
́
̀
̀
́
́
thi nghiêm
̣
gô
̀
̣
thưc, cac nghiêm
̣
̣
̣
̣
̣
ba lâ
̀
n.
́
́
́
́
́
Cac sô
́
liêu
̣
̣
̣
́
ng kê bă
̀
ng phâ
̀
n mê
̀
̉
́
́
̀
̀
MicroSoft Excel 2016®.
7. Kết quả đạt được
- Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho quá trình nhân
chồi từ đoạn thân cây sùng thảo.
- Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ cây sùng thảo.
- Xác định được loại giá thể thích hợp để trồng cây sùng thảo khi trồng cây
con in vitro ngoài vườn ươm.
8. Bố cục đồ án
Kết cấu của đồ án gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
3
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào đã trả qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh
dấu bằng những sự kiện chính sau:
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa
ra khái niệm tế bào.
Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế
bào.
Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ
quan sinh dục.
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm
nhưng không thành công.
Năm 1904, Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài
họ Cải Crucifers.
Năm 1922, Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1924, Blumenthal và cộng sự tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy hình
thành callus tử rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic.
Năm 1925, Knudson L, Bot. Gaz làm hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1929, Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà
hợp khi lai ở Linum spp.
Năm 1934, Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một
phytohormone thực vật đầu tiên thuộc có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân
chia tế bào.
Năm 1936, LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau.
Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành
công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.
4
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non
ở cà rốt.
Năm 1942, Gautheret lần đầu theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy mô sẹo thực vật.
Năm 1944, Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy
mô thuốc lá in vitro.
Năm 1950, Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước
dừa.
Năm 1951, Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và
phát sinh cơ quan.
Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai
tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công.
Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của
kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở
mô nuôi cấy.
Năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất
auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).
Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế bào
thực vật – môi trường MS.
Năm 1964 – 1998, hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gen để lai tạo
giống mới, thương mại hóa sản phẩm nuôi cây mô (Dương Tấn Nhựt, 2011).
1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Dương Công Kiên (2003), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật như:
1.1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên).
5
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Từ một đỉnh
sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều
chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây
hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân
giống thông thường khác.
1.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình
thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu
trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân
giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành
chồi.
Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô
sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy
nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo.
1.1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt tên máy lắc có
tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất
hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi
cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống
như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế
bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid,…).
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách
ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô
sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường
có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia
phóng xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng.
6
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
1.1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần
Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và
duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận
của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu và enzyme) trong điều kiện nuôi cấy
thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh
thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền). Khi mất thành tế bào, hai tế bào trần
có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây
trồng. quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài
hoặc khác loài (khoai tây, cà chua).
Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc, tế bào trần dễ dàng hấp thu các
AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh,
năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần
đang được nghiên cứu và hoàn thiện .
1.1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử hoặc
hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo
cây đơn bội. Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội. Nuôi cấy
bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống
thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới. Nuôi cấy
bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa
nước, thuốc lá, ngô,…
1.1.2.6. Nuôi cấy protoplast
Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách
từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong
môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều
triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới
ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều
đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào
trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội.
7
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm
cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng
trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như
trong công tác giống cây trồng .
1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro
Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng
cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige (1974) đã chia quy trình
nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và một giai đoạn tiếp sau in vitro:
1.1.3.1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro
Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã được khử trùng
và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới. Giảm tỷ lệ mẫu
nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này. Theo Yildiz
(2012), mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng thành. Giai
đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần.
1.1.3.2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro
Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất.
Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm
cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò
của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin).
1.1.3.3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con
Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi
trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong
giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm
kích thích sự hình thành rễ.
Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ
thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định.
1.1.3.4. Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên (Hazarika, 2003). Sự biến
8
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong
việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên.
Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò
quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in vitro vào
thực tiễn. Tuy nhiên, đối với cây hoa chuông do toàn thân được phủ một lớp lông tơ
dày, thân lá chứa nhiều nước nên giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu gặp nhiều khó khăn
(số lượng mẫu nhiễm và chết rất cao). Vì vậy, để tăng hiệu quả của giai đoạn này
cần lựa chọn được hóa chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan sinh dưỡng
đưa vào nuôi cấy.
1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật
1.1.4.1. Sự lựa chọn mẫu cấy
Theo Mantell và cộng sự (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải
có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng. Mô non như
đỉnh chồi nách, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một
cây (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Thời vụ và giai đoạn sinh trưởng của cây mẹ có
ảnh hưởng hoàn toàn khác nhau tới khả năng tái sinh, phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy (Mamaril và Lopez, 1997).
1.1.4.2. Khử trùng mô thực vật
Các mô cấy hầu hết là các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, lá,
rễ, thân, củ,… tùy theo sự tiếp xúc của môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa
ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào
môi trường nuôi cấy in vitro, các mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để
loại bỏ hết các nguồn tạp nhiễm (Bhojwani và Razdan, 1996)
Khử trùng mẫu cấy là một việc làm khó vì mẫu sống không thể khử trùng bằng
nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải
được khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là
hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, oxy già,… Các mẫu cấy sau khi chọn
phải rửa phải ngâm rửa mẫu bằng xà phòng dưới dòng chảy rồi mới cho vào ngâm
trong dung dịch khử trùng. Hiệu quả xử lý các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ
9
̀ ́ ̣
Đô an tôt nghiêp
́
và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề mặt
các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử trùng
trước tiên người ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70o trong 30 giây, sau
đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.
Việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử
lý trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm phần lớn là bụi tóc, tay, quần áo vì
vậy trong khi cấy phải rửa tay bằng xà phòng, lau cồn 70o tới khuỷa tay,…
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng
Chất khử trùng
Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút)
Hiệu quả
Hypochorite calcium
Hypochorite sodium
Hydro peroxide
Nước bromie
9 – 10
0,5 - 5
5 – 30
5 – 50
5 – 15
2 – 10
2 – 10
30 – 60
Rất tốt
Rất tốt
10 – 12
1 – 2
Tốt
Rất tốt
HgCl2
0,1 – 1
Trung bình
Khá tốt
Chất kháng sinh
4 – 50 mg/l
1.1.4.3. Carbon và nguồn năng lượng
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng, vì vậy cần phải bổ sung nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy để cung cấp
năng lượng (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Hai loại đường thường được sử dụng là
sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Nồng độ
sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn
sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Laneri; Franconi; Altavista, 1990).
10
Tải về để xem bản đầy đủ
88 trang
18300
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (Stachys affinis)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- do_an_xay_dung_quy_trinh_nhan_giong_in_vitro_cay_sung_thao_s.pdf
