Tiềm năng và hạn chế của vaccine sống nhược độc kháng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

TIỀM NĂNG VÀ HẠN CHẾ CỦA VACCINE SỐNG NHƯỢC ĐỘC KHÁNG

BỆNH DO Edwardsiella ictaluri GÂY RA TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus)

Trần Hạnh Triết¹*, Nguyễn Trọng Bình¹, Lê Văn Hậu¹,

Trần Kim Hoàng², Nguyễn Quốc Bình¹

TÓM TẮT

Việc sử dụng vaccine ngừa bệnh cho cá tra đang là vấn đề cấp thiết, nhất là bệnh do vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra. Tuy nhiên, việc sử dụng loại vaccine và phương thức

sử dụng vào giai đoạn phát triển nào của cá đang là vấn đề cần được nghiên cứu. Chúng

tôi giới thiệu ở đây một số kết quả nghiên cứu liên quan đến các loại vaccine cho cá tra

đang được nghiên cứu tại Trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM. Bốn trên năm chủng

vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được tạo ra bằng phương pháp knock-out gen hay chọn

lọc trên môi trường chứa kháng sinh Rifampicin nồng độ 320 µg/ml đều cho kết quả khả

quan trong việc bảo hộ cá tra kháng lại bệnh gan thận mủ, bệnh do vi khuẩn E. ictaluri

trên gây nên. Trong đó, chủng E. ictaluri đột biến gen wzz cho kết quả tốt nhất và có

tiềm năng sử dụng là vaccine cho cá tra giống. Ngược lại, chủng đột biến gen mã hóa

cho enzyme chondroitinase không hề giảm độc lực và hoàn toàn không có khả năng sử

dụng làm vaccine. Thời điểm xử lý vaccine được cho là cần thiết trong giai đoạn cá bột.

Vaccine cần được xử lý lặp lại để có được kết quả bảo vệ tốt ở giai đoạn cá lớn. Mặt khác,

việc tiêm vaccine vào cá mẹ cũng cho thấy có hiệu quả bảo vệ truyền từ cá mẹ sang cá bột.

Từ khoá: Edwardsiella ictaluri, hiệu quả bảo vệ, nhược độc, tỷ lệ chết.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành nuôi trồng Thủy sản là một ngành

sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi như hiện

nay sẽ gây nhiều tác hại như dư lượng kháng

sinh trong sản phẩm, vi khuẩn kháng thuốc và

nhiều tác hại với môi trường. Vì vậy, cùng với

sự lớn mạnh của ngành nuôi trồng thủy sản

của nước ta, sử dụng vaccine để hạn chế dịch

bệnh là vấn đề hết sức cấp thiết.

kinh tế mũi nhọn của Việt Nam, trong đó nghề

nuôi cá Tra đóng góp rất lớn cho kim ngạch

xuất khẩu của cả nước. Năm 2012, kim ngạch

xuất khẩu đạt 1,74 tỷ USD (VASEP) và ước

đạt 1,75 tỷ USD (2014). Tuy nhiên, nghề nuôi

cá Tra hiện nay đang gặp khó khăn do chưa

Các nghiên cứu cho thấy E. ictaluri là tác

kiểm soát được dịch bệnh. Một trong những nhân gây bệnh sơ cấp, vi khuẩn có thể xâm

bệnh gây thiệt hại lớn cho người nuôi phải nhập vào cá theo hai con đường: cơ quan khứu

kể đến bệnh gan thận mủ, bệnh nhiễm trùng giác (Miyazaki và Plumb 1985, Shotts et al.,

huyết (bệnh đốm đỏ), khi bùng phát có thể 1986) và đường tiêu hóa (Shotts et al., 1986).

gây chết từ 60 - 80% cá (Crumlish và ctv., Đa số các nghiên cứu khác đã xác nhận vi

2002). Để đối phó với bệnh, người nông dân khuẩn Edwardsiella ictaluri là nguyên nhân

sử dụng nhiều loại kháng sinh, tuy nhiên việc gây bệnh gan thận mủ (Hawke và ctv., 1981;

¹Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. HCM.

*Email: [email protected], [email protected]

²Đại học An Giang

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

65

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

Kei Yuasa, 2003; Từ Thanh Dung và ctv., Cá bột mua từ các trại sản xuất cá Tra

2004; Đồng Thanh Hà, 2008; Đặng Thị Hoàng giống được nuôi trong bể composite tại phòng

Oanh, 2009). Cá có biểu hiện bệnh sau 3 – 4 thí nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh học

ngày nhiễm bệnh với tốc độ lây lan nhanh TP. HCM. Ở giai đoạn cá bột, cá được cho

chóng.

ăn moina, artemia. Giai đoạn 16 – 20 ngày

tuổi, cá sử dụng thức ăn là trùn chỉ. Đến giai

đoạn 21 – 45 ngày tuổi cho cá ăn thức ăn

công nghiệp 30 độ đạm xay nhỏ cho vừa cỡ

miệng cá. Thường xuyên xi phông bể nhằm

loại trừ thức ăn thừa tránh tình trạng ô nhiễm

môi trường nước. Trong quá trình nuôi định

kì 1 – 2 ngày thay nước một lần (mỗi lần thay

từ 30 – 40% bể) và thay đồng loạt cho tất cả

các bể. Các bể nuôi được bố trí hệ thống sục

khí hoạt động 24/24 giờ. Cá được dùng trong

thí nghiệm khi đạt trọng lượng 10 ± 3 g/con.

Trước khi thử nghiệm, cá được kiểm tra ngẫu

nhiên bằng cách mổ quan sát bệnh tích và cấy

mẫu máu, gan, tụy trên môi trường BHI.

Dựa trên các patent và các bài báo khoa

học ngoài nước, Trung tâm Công nghệ Sinh

học Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành các nghiên

cứu và tạo thành công các chủng E. ictaluri

đột biến nhược độc kháng bệnh gan thận mủ

từ năm 2008. Báo cáo này trình bày các thử

nghiệm của các chủng đột biến trên cá giống

ở quy mô phòng thí nghiệm và khảo sát sơ bộ

ở quy mô đồng ruộng. Kết quả đã phát hiện

chủng E. ictaluri đột biến gen wzz (O- antigen

chain length determinant gene) nhược độc an

toàn cho cá và có hiệu quả bảo vệ cao (trên

60%) cho cá Tra giống. Khảo sát sơ bộ trên

cá bột ở quy mô đồng ruộng bằng cách tiêm

vaccine vào cá mẹ cũng cho thấy có hiệu quả 2.2. Chuẩn bị chủng vi khuẩn E. ictaluri

bảo vệ truyền từ cá mẹ sang cá bột. Chủng hoang dại và đột biến

vaccine cũng cho thấy sự an toàn cho cá và

không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của

cá bột lên cá hương. Đây là chủng E. ictaluri

nhược độc tiềm năng làm vaccine. Vì vậy,

cần phải tiếp tục tiến hành thử nghiệm chủng

vi khuẩn E. ictaluri đột biến gen wzz ở quy

mô đồng ruộng và thiết lập quy trình sử dụng

chủng này làm vaccine phù hợp với quy trình

nuôi cá Tra thương mại. Trong ao nuôi, cá

được phát hiện nhiễm bệnh gan thận mủ chủ

yếu từ giai đoạn cá hương (3 tuần tuổi) đến cá

giống với tỷ lệ chết rất cao và rải rác đến cá

thịt. Vì vậy, để giảm thiệt hại do tỷ lệ chết cao,

cần phải xử lý vaccine sớm từ giai đoạn cá bột

và tập trung từ giai đoạn cá bột đến cá giống.

Những giai đoạn thích hợp để xử lý vaccine

trong quy trình nuôi cá Tra cần được nghiên

cứu thêm bao gồm: giai đoạn cá bố mẹ sinh

sản, giai đoạn thả cá bột, cá hương đạt khoảng

2.000 con/kg được tách ao nuôi lên cá giống.

Các chủng E. ictaluri được sử dụng trong

nghiên cứu bao gồm chủng E. ictaluri hoang

dại phân lập từ mẫu cá bệnh gan thận mủ tại

tỉnh An Giang (E. ictaluri AG) và Đồng Tháp

(E. ictaluri ĐT). Năm chủng E. ictaluri đột

biến gen bao gồm chủng đột biến knock-out

gen aroA (E. ictaluri AroM), genpurA (E.

ictaluri PAM), gen wzz (E. ictaluri WzM),

gen mã hóa enzyme chondroitinase và chủng

đột biến kháng kháng sinh Rifampicin ở nồng

độ 320 µg/ml (E. ictaluri R320) lần lượt được

tạo ra từ chủng E. ictaluri AG. Để chuẩn bị

dịch vi khuẩn trước khi thử nghiệm, 1 khuẩn

lạc được cấy vào 5 ml BHI lỏng, nuôi cấy qua

đêm ở điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 28^oC,

trong 16 giờ. Sau đó, 1 ml dịch nuôi cấy được

cấy chuyền vào 100 ml BHI lỏng và nuôi cấy

200 vòng/phút ở 28^oC, lắc qua đêm đối với E.

ictaluri đến khi đạt OD600 0,8 – 1,0 (~ 10⁹

CFU/ml). Sinh khối vi khuẩn được ly tâm

ở 2.200 xg/15 phút ở 4^oC, được huyền phù

và pha loãng trong NaCl 0,65% (Ronald L.

Thune, 1999).

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Chuẩn bị cá thí nghiệm

66

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

2.3. Thử nghiệm độc lực của các chủng

E. ictaluri đột biến gen bằng phương pháp

tiêm, ngâm trên cá Tra giống

dịch vi khuẩn ở nồng độ cần pha loãng (Bảng

1), ngâm trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.

Riêng cá ở nghiệm thức ĐC(-) được ngâm

trong nước. Sau khi ngâm, cá được chuyển

vào bể 100 lít nuôi theo dõi.

Các thử nghiệm tiêm và ngâm cá được

bố trí theo 9 nhóm. Mỗi nhóm được tiến hành

theo một phương pháp tiêm hoặc ngâm với

một chủng vi khuẩn ở nhiều nồng độ khác

nhau (Bảng 1).

Cá sau khi xử lý tiêm và ngâm được nuôi

ở nhiệt độ nước 28 ± 2^oC. Hằng ngày theo dõi

dấu hiệu bệnh lý và tỷ lệ chết tích lũy ở các

nhóm cá thí nghiệm. Chất lượng nước trong bể

được kiểm tra hằng ngày các chỉ số DO, pH,

NH₃và nhiệt độ. Thời gian theo dõi kéo dài

14 ngày. Mẫu cá chết trong thử nghiệm với E.

ictaluri được giải phẫu và dịch gan tuỵ được

trải trên môi trường BHI, ủ ở 28^oC/48 giờ.

Các khuẩn lạc mọc được kiểm tra bằng PCR

với cặp mồi đặc hiệu F2serC/R2serC cho kích

thước 191 bp.

Ở phương pháp tiêm, trước khi tiêm,

cá được bắt ra ngâm trong nước 20^oC để làm

giảm hoạt động của cá. Sau đó, bắt đầu tiêm

vào xoang bụng 0,1 ml/cá dịch vi khuẩn đã

pha loãng ở các nồng độ định sẵn (Bảng 1).

Cá được chuyển sang bể 100 lít nuôi theo dõi.

Ở nghiệm thức đối chứng ĐC(-), cá được tiêm

0,1 ml/cá NaCl 0,65%. Đối với phương pháp

ngâm, cá được vớt ra xô đã chuẩn bị sẵn 2 lít

Bảng 1. Thí nghiệm tiêm/ngâm cá khảo sát độc lực chủng E. ictaluri hoang dại, đột biến

STT Số lượng cá/ bể Tác nhân gây bệnh Phương pháp lây nhiễm Liều lây nhiễm

1

2

3

4

30

10

E. ictaluri ĐT

E. ictaluri PAM

E. ictaluri R320

E. ictaluri AG

Tiêm

10⁵CFU/ml

10⁴, 10⁵, 10⁶

CFU/ml

5

6

7

8

9

10

20

E. ictaluri WzM

E. ictaluri AG

Tiêm

Ngâm

10⁵, 10⁶, 10⁷

CFU/ml

10⁵, 10⁶, 10⁷

CFU/ml

10⁵, 10⁶, 10⁷

CFU/ml

10⁵, 10⁶, 10⁷

CFU/ml

E. ictaluri WzM

E. ictaluri AroM

E. ictaluri ChM

10⁵, 10⁶, 10⁷

CFU/ml

2.4. Thử nghiệm hiệu quả bảo vệ của các

chủng E. ictaluri đột biến gen bằng phương

pháp ngâm trên cá Tra giống

thử khảo sát hiệu quả bảo vệ. Ban đầu, tương tự

như thử nghiệm độc lực, cá được ngâm trong 2

lít nước có chứa một chủng E. ictaluri đột biến

ở các nồng độ khác nhau (Bảng 1), trong 30

phút, ở nhiệt độ phòng. Sau khi ngâm, cá được

Sau thử nghiệm độc lực, các chủng E.

ictaluri đột biến có độc lực thấp được tiếp tục

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

67

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

vớt ra bể 100 lít nuôi theo dõi trong 14 ngày. Trứng được thụ tinh và được ấp để nở ra cá

Vào ngày thứ 15 cá được vớt ra và công độc bột, cá bột sau đó được nuôi trong ao đất để

bằng cách ngâm với chủng E. ictaluri hoang đánh giá hiệu quả của chủng nhược độc. Các

dại có độc lực cao (chủng E. ictaluri AG). chỉ tiêu theo dõi bao gồm: sinh lý cá mẹ sau

Nồng độ ngâm được xác định là 10⁶CFU/ml khi tiêm chủng nhược độc, tỷ lệ sống của cá

vi khuẩn E. ictaluri AG, đây là nồng độ có bột lên hương nuôi trong ao đất, tỷ lệ nhiễm

khả năng gây chết khoảng 50 - 60% cá đối bệnh trên cá hương, khả năng tăng trưởng của

chứng. Cá được ngâm trong 30 phút, ở nhiệt cá hương nuôi trong ao đất.

độ phòng. Sau khi ngâm, cá được vớt ra bể

và theo dõi tiếp tục trong 14 ngày. Ghi nhận

tỷ lệ chết và các biểu hiện triệu chứng và tính

hiệu số bảo vệ thông qua chỉ số RPS (Relative

percentage survival) của chủng thử nghiệm

bằng công thức sau:

III. KẾT QUẢ

3.1. Thử nghiệm độc lực chủng E. ictaluri

hoang dại, đột biến gen bằng phương pháp

tiêm và ngâm trên cá Tra giống

Trong thử nghiệm tiêm với chủng E.

ictaluri WzM và E. ictaluri AG, cá được tiêm

E. ictaluri AG các nồng độ 10⁴, 10⁵, 10⁶CFU/

cá có tỷ lệ chết lần lượt là 26,67%, 43,33% và

63,33% (Hình 1A). Các khuẩn lạc phân lập từ

mẫu cá chết được PCR và điện di kiểm tra cho

RPS (%) = 100 – [Tỷ lệ cá chết do chủng thử

nghiệm /Tỷ lệ cá chết do ĐC (+)]

2.5. Khảo sát sơ bộ hiệu quả bảo vệ của

chủng E. ictaluri đột biến gen ở cá Tra bột

Chủng E. ictaluri đột biến có độc lực thấy đều có kích thước 191 bp, phù hợp với

thấp được sử dụng trong khảo sát. Cá mẹ kích thước đặc trưng của E. ictaluri (Hình 2).

trọng lượng trung bình từ 3 – 6 kg được đưa Trong khi các lô tiêm chủng E. ictaluri WzM ở

vào băng ca và được tiêm vào xoang bụng với các nồng độ 10⁵, 10⁶, 10⁷CFU/cá có tỷ lệ chết

chủng nhược độc ở thể tích 1 ml với nồng độ thấp lần lượt là 6,67%, 3,33% và 3,33% (Hình

tiêm 10⁷CFU/cá. Cá được đánh dấu và thả 1A). Mẫu cá chết ở các lô này không biểu hiện

xuống ao để theo dõi. Sau 3 tuần theo dõi, cá bệnh và không phân lập được khuẩn lạc đặc

được tiêm kích dục tố để kích thích đẻ trứng. trưng của E. ictaluri.

Hình 1. Tỷ lệ cá chết tích lũy theo ngày của thử nghiệm đánh giá độc lực chủng E. ictaluri

hoang dại và đột biến trên cá bằng phương pháp tiêm

Trong thử nghiệm tiêm các chủng E. chết là 92,22% và 53,33% (Hình 1B). Lô tiêm

ictaluri R320, E. ictaluri PAM và E. ictaluri ĐT chủng E. ictaluri PAM không có cá chết (Hình

ở cùng một nồng độ 10⁵CFU/cá, cá tiêm E. 1B).

ictaluri ĐT và E. ictaluri R320 lần lượt có tỷ lệ

68

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc phân lập từ cá chết. Giếng 1 – 7: mẫu cá

chết sau khi tiêm E. ictaluri hoang dại nồng độ 10⁴CFU/cá, 8: Chứng (+), 9: Chứng (-), M:

Thang DNA 100 bp

Trong thử nghiệm ngâm, các lô ngâm có tỷ lệ chết rất thấp lần lượt là 1,7 -3,3% và

chủng E. ictaluri AG các nồng độ 10⁵, 10⁶, 10⁷0 – 8,33% (Hình 3A và 3B). Khuẩn lạc phân

CFU/ml có tỷ lệ chết cao lần lượt là 37,7%, lập từ các mẫu cá chết không phải là khuẩn lại

53,3% và 73,3% (Hình 3). Kết quả điện di đặc trưng của E. ictaluri. Tuy nhiên, lô ngâm

sản phẩm PCR khuẩn lạc phân lập từ mẫu cá chủng E. ictaluri ChM các nồng độ 10⁵, 10⁶,

chết đều có kích thước 191 bp, phù hợp với 10⁷CFU/ml có tỷ lệ cá chết cao lần lượt là

kích thước đặc trưng của E. ictaluri (Hình 4). 28,3%, 73,3% và 85%, tương đương chủng

Ngược lại, các lô ngâm chủng E. ictaluri WzM hoang dại ở cùng nồng độ ngâm.

và AroM ở các nồng độ 10⁵, 10⁶, 10⁷CFU/ml

Hình 3. Tỷ lệ cá chết tích lũy

theo ngày của thử nghiệm đánh

giá độc lực chủng E. ictaluri

hoang dại và đột biến trên cá

bằng phương pháp ngâm

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

69

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc phân lập từ cá chết. Giếng 1 – 6: mẫu cá

chết sau khi ngâm E. ictaluri hoang dại nồng độ 10⁶CFU/cá, 7: Chứng (+), 8: Chứng (-) M:

Thang DNA 100 bp

ở liều LD₅₀, cá ngâm chủng WzM nồng độ 10⁶

và 10⁷CFU/ml có tỷ lệ sống sót lần lượt là

69,40% và 81,60%, cao hơn tỷ lệ sống của ĐC

(+) là 48,30% (Hình 5A). Đồng thời, hiệu quả

bảo vệ thông qua chỉ số RPS của chủng WzM

lần lượt được tính là 40,8% (10⁶CFU/ml) và

64,3% (10⁷CFU/ml) (Bảng 2).

3.2. Thử nghiệm hiệu quả bảo vệ của các

chủng E. ictaluri đột biến gen bằng phương

pháp ngâm trên cá Tra giống

Từ kết quả của thử nghiệm độc lực, chủng

E. ictaluri WzM và E. ictaluri AroM được

đánh giá có độc lực thấp và tiếp tục được đánh

giá khả năng bảo vệ trên cá Tra giống. Sau khi

công độc với chủng hoang dại E. ictaluri AG

Hình 5. Tỷ lệ cá sống sót sau khi công độc của thử nghiệm đánh giá đánh giá hiệu quả bảo vệ

của chủng E. ictaluri đột biến trên cá bằng phương pháp ngâm

Đối với cá ngâm chủng E. ictaluri AroM, 52,6% và 42%, tương đương và thấp hơn ĐC

sau khi công độc lô ngâm AroM ở nồng độ (+). Đồng thời hiệu quả bảo vệ dựa trên chỉ

10⁶CFU/ml có tỷ lệ sống sót 68,90% cao hơn số RPS của chủng E. ictaluri AroM chỉ đạt

48,30% của lô ĐC (+) (Hình 5B). Trong khi 39,8% (10⁶CFU/ml) và 8,3% (10⁷CFU/ml)

nồng độ ngâm 10⁷và 10⁵CFU/ml chủng E. thấp hơn so với chủng E. ictaluri WzM ở nồng

ictaluri AroM có tỷ lệ sống sót lần lượt là độ ngâm tương tự (Bảng 2).

70

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

Bảng 2. Tỷ lệ cá sống sót và hiệu quả bảo vệ trong thử nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ của

các chủng E. ictaluri đột biến WzM và AroM trên cá 10 g/con

Nghiệm thức

Tỷ lệ sống (%)

27,10%

69,40%

81,60%

42%

RPS (%)

E. ictaluri WzM 10⁵CFU/ml

E. ictaluri WzM 10⁶CFU/ml

E. ictaluri WzM 10⁷CFU/ml

E. ictaluri AroM 10⁵CFU/ml

E. ictaluri AroM 10⁶CFU/ml

E. ictaluri AroM 10⁷CFU/ml

ĐC (+)

-

40,80%

64,30%

-

68,90%

52,60%

48,30%

100%

39,80%

8,30%

-

ĐC (-)

3.3. Khảo sát sơ bộ hiệu quả bảo vệ của

chủng E. ictaluri đột biến gen ở cá Tra bột

cá hương từ cá mẹ tiêm chủng nhược độc có

khối lượng và kích thước nhỏ hơn so với cá

hương từ cá mẹ không tiêm nhưng khác biệt

trên không đáng kể.

Chủng E. ictaluri đột biến WzM có độc

lực thấp và hiệu quả bảo vệ cao trên cá giống.

Vì vậy, chủng nhược độc này được tiếp tục sử

dụng trong khảo sát hiệu quả bảo vệ trên cá

Tra bột. Năm mươi cá mẹ được tiêm chủng

nhược độc E. ictaluri WzM. Sau 3 tuần theo

dõi cá mẹ không có dấu hiệu bất thường nào

và tất cả cá tiêm đều khỏe mạnh. Tỷ lệ thành

thục của cá 12% và cá được tiêm kích dục tố

để kích thích đẻ trứng. Cá bột được ương ở

ao đất với mật độ thả: 2 triệu con/5.000 m²

(cá tiêm chủng nhược độc E. ictaluri WzM), 4

triệu/5.000 m²(cá không tiêm). Tỷ lệ sống của

cá bột phát triển lên cá hương ở lô tiêm chủng

nhược độc là 30%, trong khi lô đối chứng

không tiêm là 10%. Cá hương được lấy mẫu

và kiểm tra dấu hiệu bệnh lý và không thấy

dấu hiệu bất thường khi quan sát bên ngoài và

không nhiễm E. ictaluri.

IV. THẢO LUẬN

4.1. Thử nghiệm độc lực chủng E. ictaluri

hoang dại, đột biến gen bằng phương pháp

tiêm và ngâm trên cá Tra giống

Kết quả trình bày ở Hình 1B cho thấy độc

lực của chủng E. ictaluri R320 giảm khoảng

1,7 lần so với chủng hoang dại E. ictaluri ĐT

trong khi độc lực của E. ictaluri PAM giảm

hoàn toàn so với chủng hoang dại. Ở Hình 1A,

kết quả cho thấy độc lực của chủng E. ictaluri

WzM giảm nhiều so với chủng hoang dại E.

ictaluriAG. Thử nghiệm ngâm thể hiện ở Hình

3 cho thấy độc lực chủng E. ictaluri WzM và

AroM giảm đáng kể so với chủng hoang dại E.

ictaluri AG, trong khi chủng E. ictaluri ChM

không mất độc lực. Kết quả độc lực giảm của

chủng AroM tương đồng với kết quả nghiên

cứu của Thune et al. (1999) khi ngâm cá với

chủng E. ictaluri đột biến gen aroA ở nồng độ

10⁷CFU/ml. Tuy nhiên, chủng E. ictaluri ChM

vẫn còn độc lực cao tương tự chủng hoang dại

E. ictaluri AG. Kết quả này trái ngược hoàn

toàn với báo cáo của Cooper et al., (1996) về

sự mất độc lực của chủng E. ictaluri đột biến

gen mã hóa enzyme chondroitinase.

Khả năng tăng trưởng của cá hương 21

ngày tuổi từ cá mẹ không tiêm chủng nhược

độc được thể hiện qua khối lượng trung bình

2,6 g dao động từ 0,99-4,79 g; chiều dài trung

bình 6,5 cm dao động từ 5,1-7,9 cm. Trong

khi, cá hương từ cá mẹ tiêm chủng nhược độc

có khối lượng trung bình 2,1 g dao động từ

0,73-3,46 g và chiều dài trung bình 6,1 cm

dao động từ 4,1- 7,7 cm. Kết quả trên cho thấy

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

71

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

Khi so sánh kết quả tiêm và ngâm trên cá nhưng có hiệu quả bảo vệ tương đối thấp,

chủng E. ictaluri WzM và E. ictaluri AG, tỷ RPS vào khoảng 39,8% (nồng độ ngâm 106

lệ cá chết ở 2 phương pháp được nhận thấy CFU/ml trên cá 10 g/con).

là tương đương nhau. Vì vậy, có thể kết luận

khả năng lây nhiễm của chủng E. ictaluri qua

hai phương pháp tiêm và ngâm không có sự

khác biệt. Chủng E. ictaluri WzM gây chết

cá tỷ lệ thấp: <3,3% (ngâm các nồng độ 10⁵

– 10⁷CFU/ml) và <6,7% (tiêm các nồng độ

10⁵– 10⁷CFU/cá), trong khi chủng hoang dại

E. ictaluri AG gây chết cao hơn. Do đó có thể

suy luận chủng E. ictaluri đột biến gen wzz

gây chết thấp vì độc lực thấp không phải do

khả năng xâm nhiễm yếu. Kết quả điện di sản

phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu F2serC/

R2serC trên các khuẩn lạc phân lập từ cá chết

ở hình 4 cho thấy sản phẩm PCR có kích thước

tương ứng với chứng (+) của E. ictaluri. Kết

quả này khẳng định sự hiện diện của E. ictaluri

trong những nghiệm thức ngâm E. ictaluri

hoang dại ở nồng độ 10⁶CFU/cá.

4.3. Khảo sát sơ bộ hiệu quả bảo vệ của

chủng E. ictaluri đột biến gen ở cá Tra bột

Tuy kết quả tỷ lệ sống của cá bột phát

triển lên cá hương ở lô tiêm chủng nhược độc

E. ictaluri WzM cao hơn lô không tiêm nhưng

mật độ thả cá bột ra ao đất không đồng đều và

thiếu các thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên

cá mẹ và cá bột nên chưa đánh giá được tác

động của việc tiêm chủng nhược độc vào cá

mẹ lên hiệu quả bảo vệ trên cá con.

Kết quả trọng lượng và chiều dài của cá

hương cho thấy chủng nhược độc E. ictaluri

WzM không ảnh hưởng đến khả năng tăng

trưởng của cá được nuôi trong ao đất. Tuy

nhiên, cần nghiên cứu đánh giá thêm đáp ứng

miễn dịch của cá mẹ, ảnh hưởng của chủng

nhược độc lên sinh lý cá mẹ, tốc độ trứng chín,

khả năng miễn dịch của noãn hoàng.

4.2. Thử nghiệm hiệu quả bảo vệ của các

chủng E. ictaluri đột biến gen bằng phương

pháp ngâm trên cá Tra giống

V. KẾT LUẬN

Vi khuẩn E. ictaluri AG có khả năng xâm

nhiễm tốt và độc lực cao. Các chủng đột biến

nhược độc E. ictaluri WzM và AroM xâm

nhiễm tốt vào cá Tra giống bằng con đường

ngâm nhưng không gây độc. Chủng E. ictaluri

PAM mất độc lực và chủng E. ictaluri R320

có độc lực giảm khi được tiêm vào cá. Riêng

độc lực và khả năng xâm nhiễm của chủng E.

ictaluri ChM vẫn tương đương chủng hoang

dại. Hiệu quả bảo vệ của E. ictaluri WzM khá

cao, đạt 64,3% khi ngâm cá giống ở nồng độ

10⁷CFU/ml. Chủng đột biến nhược độc này

cũng cho kết quả bước đầu khả quan ở quy mô

đồng ruộng khi tỷ lệ cá bột phát triển lên cá

hương đạt 30% khi tiêm vào cá mẹ 1 ml dịch

vi khuẩn E. ictaluri WzM 10⁷CFU/cá, cao

hơn so với tỷ lệ 10% ở lô không tiêm. So sánh

khối lượng, chiều dài và dấu hiệu bệnh lý giữa

cá hương ở lô cá mẹ tiêm và không tiêm E.

ictaluri WzM cho thấy không có sự khác biệt

đáng kể chứng tỏ chủng đột biến nhược độc

Tỷ lệ sống sót của cá ngâm chủng E.

ictaluri WzM quan sát được ở hình 5A cho

thấy sự khác biệt đáng kể giữa 2 nồng độ ngâm

10⁵CFU/ml (27,1%) và 10⁷CFU/ml (81,6%)

trong khi không có sự khác biệt đáng kể giữa

3 nồng độ ngâm 10⁵CFU/ml (42%), 10⁶CFU/

ml (68,9%) và 10⁷CFU/ml (52,6%) với chủng

E. ictaluri AroM ở hình 5B. Hiệu quả bảo vệ

của chủng E. ictaluri WzM trên cá thể hiện rõ

hơn chủng E. ictaluri AroM, nhất là ở nồng độ

ngâm cao nhất 10⁷CFU/ml. Ở nồng độ ngâm

10⁷CFU/ml, chủng E. ictaluri WzM cho tỷ

lệ cá sống sót cao gấp 2 lần (81,60%) so với

đối chứng (+) (48,30%) và E. ictaluri AroM

(52,60%). Căn cứ vào kết quả thử nghiệm có

thể đánh giá sơ bộ chủng E. ictaluri WzM có

độc lực thấp, an toàn cho cá và có hiệu quả

bảo vệ tương đối cao 64,3% (khi ngâm nồng

độ 10⁷CFU/ml trên cá 10 g/con). Chủng E.

ictaluri AroM tuy có độc lực thấp, an toàn cho

72

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

enteric septicemia of catﬁsh. International

Journal of Systematic bacteriology, Oct

1981, p 396-400. Vol 31, No 4.

không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cá

bột. Tuy nhiên, cần nghiên cứu đánh giá thêm

ảnh hưởng của chủng nhược độc lên sinh lý

cá mẹ, tốc độ trứng chín, khả năng miễn dịch

của noãn hoàng và từ kết quả này xây dựng

quy trình xử lý vaccine cho cá Tra nuôi thương

mại.

Crumlish, Dung, M., Turnbull, T.T.J.F., Ngoc,

N.T.N., and Ferguson, H.W., 2002.

Identiﬁcation of Edwardsiella ictaluri from

diseased freshwater catﬁsh, Pangasius

hypophthalmus (Sauvage), cultured in the

Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish

Diseases 25: 733 - 736

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Miyazaki,T.,andPlumb,J.A.,1985.Histopathology

of Edwardsiella ictaluri in channel catﬁsh,

Ictalurus punctatus (Raﬁnesque). Journal of

Fish Diseases 8: 389 – 392

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương,

2009. Độc lực của vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri phân lập từ cá tra (Pangasianodon

hypopthalmus) bệnh mủ gan. Tạp chí Nông Cooper II, R.K., Shott, E.B., and Nolan, L.K.,

nghiệp và phát triển nông thôn. 12: 64-69

1996. Use of a mini – transposon to study

Chondroitinase activity associated with

Edwardsiella ictaluri. Journal of Aquatic

Animal Health 8: 319 – 324

Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như

Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy

Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây

bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius Thune, R.L., Fernandez, D.H., and Battista, J.R.,

hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học

Cần Thơ, 2004: 137-142.

1999. An aroA mutant of Edwardsiella

ictaluri is safe and efﬁcacious as a live,

attenuated vaccine. J Aquatic Animal Health

11(4): 358-372.

Tài liệu tiếng Anh

Kei, Y., Edy, B.K., Novita, P., and Kishio, H.,

2003. First isolation of Edwardsiella ictaluri

from cultured striped catﬁsh Pangasius

hypophthalmus in Indonesia. Fish pathology,

38 (4), 181-183, 2003.12

Shotts, E.B., Blazer, V.S., and Waltman, W.D.,

1986. Pathogenesis of experimental

Edwardsiella ictaluri infections in channel

catﬁsh (Ictalurus punctatus). Can. J. Fish.

Aquat. Sci. 43:36-42.

Hawke, J.P., Mc Whorter, A.C., Steigerwalt,

A.G., and Brenner, D.J., 1981. Edwardsiella

ictaluri sp. nov., the causative agent of

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015

73

VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2

LIVE VACCINE AGAINST Edwardsiella ictaluri FOR CATFISH

Pangasianodon hypophthalmus, POTENTIAL AND LIMIT

Tran Hanh Triet¹*, Nguyen Trong Binh¹, Nguyen Van Hau¹,

Tran Kim Hoang², Nguyen Quoc Binh¹

ABSTRACT

Application of vaccination for catﬁsh against disease caused by Edwardsiella ictaluri is

urgent for Vietnam aquaculture industry. However, the type of the vaccine as well as the

mode of vaccination, stage of ﬁsh development to vaccinate is the problems to resolve. We

present here the research results of vaccine created by Biotechnology Center of Ho Chi

Minh City for catﬁsh. Four from ﬁve strains of Edwardsiella ictaluri mutated by knock-out

gen or by selection on Rifampicin at concentration 320 µg/ml have given good results on

ﬁsh protection against Edwardsiella ictaluri which causes Enteric septicaemia in catﬁsh.

Among these strains, wzz mutant showed the best potential for vaccine application. In

contrast, the mutant knock-out gene encoding chondroitinase showed an intact toxicity

on catﬁsh. Appropriate vaccination time is suggested at ﬁsh hatching period. Repetition

of vaccination should be made to have protection on older ﬁsh. The protection against

Edwardsiella ictaluri can be transferred from vaccinated parents to fry ﬁsh.

Keywords: Attenuated, Edwardsiella ictaluri, mortality percentage, protective efﬁcacy.

Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Hảo

Ngày nhận bài: 29/5/2015

Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015

Ngày duyệt đăng: 07/8/2015

¹Biotechnology Center of Ho Chi Cinh City.

*Email: [email protected], [email protected]

²An Giang University

74

TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015