Khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus NT₇ phân lập từ tôm thẻ bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) của chủng Bacillus polyfermenticus F₂₇ phân lập từ giun quế
14 Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23
KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC Vibrio parahaemolyticus NT
PHÂN LẬP TỪ TÔM THẺ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPND)
7
CỦA CHỦNG Bacillus polyfermenticus F27 PHÂN LẬP TỪ GIUN QUẾ
NGUYỄN VĂN MINH1,*, LÊ ANH TUẤN1, PHAN QUANG LỢI1, DƯƠNG NHẬT LINH1,
TRẦN KIẾN ĐỨC2, VÕ NGỌC YẾN NHI2, TRẦN THỊ Á NI3 và NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH4
1Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh
3Công ty TNHH MIDOLI
4Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2
*Email: minh.nv@ou.edu.vn
(Ngày nhận: 13/08/2019; Ngày nhận lại: 09/09/2019; Ngày duyệt đăng: 17/09/2019)
TÓM TẮT
Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm được phát hiện đầu tiên ở Trung Quốc năm 2009 và gây hại cho
nghề nuôi tôm ở nhiều nước kể cả Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sàng lọc khả năng
kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy của một số chủng Bacillus. Chủng V.
parahaemolyticus NT7 sử dụng trong nghiên cứu này được phân lập từ mẫu tôm thẻ chân trắng
bệnh hoại tử gan tụy tại Ninh Thuận và đã được định danh bằng phương pháp sinh hóa. Bằng
phương pháp vạch vuông góc và giếng khuếch tán, chúng tôi sàng lọc được chủng Bacillus
polyfermenticus F27 đối kháng V. parahaemolyticus NT7 với đường kính lớn nhất là 18,50 mm. B.
polyfermenticus F27 có khả năng ức chế V. parahaemolyticus NT7 khi tiến hành đồng nuôi cấy,
không gây tiêu huyết và an toàn đối với tôm thẻ giống với tỷ lệ sống 100% của nghiệm thức thử
nghiệm. Kết quả khảo sát LD50 khi gây nhiễm V. parahaemolyticus NT7 lên tôm thẻ giống là 1,12.
105 CFU/ml. Tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ của chủng B. polyfermenticus
F27, chúng tôi nhận thấy chủng có khả năng bảo vệ tôm thẻ giống từ chủng V. parahaemolyticus
NT7 gây bệnh. Những kết quả trên cho thấy rằng chủng Bacillus polyfermenticus F27 có tiềm năng
để sản xuất chế phẩm sinh học kiểm soát và phòng bệnh EMS/AHPNS trên tôm.
Từ khóa: Bacillus polyfermenticus F27; Bệnh hoại tử gan tụy; Kiểm soát sinh học; Tôm thẻ
chân trắng; Vibrio parahaemolyticus NT7
Biocontrol activity of Vibrio parahaemolyticus nt7 isolated from the shrimp acute
hepatopancreatic necrosis syndrome (Ahpns) by Bacillus polyfermenticus f27 isolated
from perionyx excavatus
ABSTRACT
Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome – AHPNS of cultured shrimp was first detected
in China in 2009 and caused huge damage to shrimp farming in many countries including Vietnam.
This study investigates the ability to inhibit Vibrio parahaemolyticus which causes
hepatopancreatic necrosis of some Bacillus strains. V. parahaemolyticus NT7 of this research was
isolated from white leg shrimp sample with hepatopancreatic necrosis in Ninh Thuan province and
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 15
identified by biochemical methods. By the cross-steak and well-diffusion methods, the selected
strain Bacillus polyfermenticus F27 show the largest diameter of 18.50 mm resistance to V.
parahaemolyticus NT7. B. polyfermenticus F27 strain has ability to inhibit V. parahaemolyticus
NT7. Besides, B. polyfermenticus F27 inhibits V. parahaemolyticus NT7 with co-cultured
experiment and does not cause hemolysis. It is also safe for white leg shrimp seed with 100%
survival rate of the experimental treatments. The result of LD50 examination when infecting V.
parahaemolyticus NT7 to white leg shrimp seed is 105 CFU/ml. Through the host protection
capability assessment of B. polyfermenticus F27, we found that it able to protect white leg shrimp
seed from V. parahaemolyticus. The findings show that strains of B. polyfermenticus F27 have the
potential to produce probiotics for control and prevention of EMS/AHPNS of shrimps.
Keywords: AHPNS; Bacillus polyfermenticus F27; Biocontrol; Vibrio parahaemolyticus
NT7; White leg shrimp
2009 (NACA-FAO, 2011), Malaysia năm 2011
(Lightner và cs., 2012, Mooney và cs., 2012);
Thái Lan năm 2012 (Tran và cs., 2013) và lây
lan sang Tây bán cầu là Mexico năm 2013
(Schryver và cs., 2014).
1. Mở đầu
Việt Nam có tiềm năng lớn về nuôi trồng
thủy sản, trong đó nghề nuôi tôm chiếm vị trí
quan trọng. Theo Tổng cục Thống kê, ước tính
giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 đạt gần
188 nghìn tỷ đồng. Trong đó, giá trị nuôi trồng
thủy sản ước đạt hơn 115 nghìn tỷ đồng (Tổng
cục thủy sản 2014b).
Tuy nhiên, hiện nay tình trạng dịch bệnh
ở tôm đang hoành hành trên nhiều vùng
nuôi tôm ở nước ta. Đặc biệt là hội chứng tôm
chết sớm Early Mortality Syndrome (EMS)
hay còn gọi là hội chứng hoại tử gan tụy
Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome
(AHPNS) (Flegel và cs., 2012).
Ở Việt Nam, căn bệnh này đã được quan
sát thấy từ năm 2010 nhưng sự tàn phá trên
diện rộng do EMS chỉ được báo cáo kể từ tháng
3 năm 2011 ở đồng bằng sông Cửu Long. Nó
ảnh hưởng đến khu vực sản xuất tôm chính của
tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc
Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau với tổng diện tích
ao nuôi tôm khoảng 98.000 ha (Mooney,
2012). Theo báo cáo của Cục Thú y, trong 11
tháng đầu năm 2014 ở nước ta dịch bệnh hoại
tử gan tụy đã xảy ra tại 22 tỉnh/ thành phố với
diện tích nuôi tôm bị bệnh là 5591 ha gây thiệt
hại hàng nghìn tỷ đồng cho người dân và ngân
sách Nhà nước (Tổng cục thủy sản, 2014a).
Bệnh này cũng đã gây ra nhiều gây ra
những thiệt hại nghiêm trọng cho các nước
nuôi tôm trên thế giới, như ở Trung Quốc năm
Vào đầu năm 2013, nhóm nghiên cứu của
Lightner (phòng nghiên cứu Bệnh học thủy sản
Đại học Arizona) đã phân lập và xác định tác
nhân gây bệnh hoại tử gan tụy (AHPND -
Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease)
trong môi trường nhân tạo là do dòng đặc biệt
của vi khuẩn V. parahaemolyticus có độc lực
cao thông qua kiểm tra mô học, sử dụng bộ kit
API Rapid NE và giải trình tự 16S rRNA gene.
(Tran và cs., 2013). V. parahaemolyticus xâm
chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố
gây phá hủy mô, làm rối loạn chức năng của
gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm (Lightner và
cs., 2012; FAO, 2013). Năm 2014, Kondo và
cộng sự khi phân tích trình tự bộ gen của các
chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử
gan tụy ở Thái Lan cũng phát hiện gen độc tố
PirA và PirB đồng thời lại không phát hiện
trong chủng V. parahaemolyticus không gây
bệnh. Điều này chứng tỏ gen độc tố PirA và
PirB là tác nhân gây bệnh AHPND. (Kondo và
cs., 2014)
Và nó được biết đến với tốc độ lây lan và
gây tử vong cao ở các trang trại nuôi tôm
(Zorriehzahra và cs., 2015). Chính vì vậy khi có
dấu hiệu bệnh hoại tử gan tụy ở tôm thì hầu hết
các hộ nuôi tôm thường sử dụng sản phẩm hóa
16 Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23
học và thuốc kháng sinh nhằm giảm thiểu
thiệt hại về bệnh. Theo báo cáo của Han và
cộng sự (2015) đã xác định 7 chủng Vibrio
parahaemolyticus phân lập từ mẫu tôm bệnh
hoại tử gan tụy ở Việt Nam kháng kháng sinh
và đó là bằng chứng cho thấy loài vi khuẩn này
có khả năng đề kháng kháng sinh rất nhanh,
nguy cơ dẫn đến thất bại trong việc điều trị bệnh
hoại tử gan tụy là rất cao. Bên cạnh đó, việc
điều trị bằng kháng sinh và hóa chất quá nhiều
trong ao nuôi tôm sẽ tiêu diệt các vi khuẩn gây
bệnh lẫn các vi khuẩn có lợi (Gatesoupe, 1999).
Vì vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học giúp
các sản phẩm thủy sản được an toàn không
gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người
đang được quan tâm (Moriarty và cs., 1997;
Verschuere và cs., 2000).
Vi khuẩn thường được ứng dụng làm chế
phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản phần
lớn thuộc chi Bacillus. Do khả năng tạo ra được
các enzym ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, sinh
kháng sinh hay những chất ức chế có những
đặc tính đối kháng với các chủng vi sinh
vật gây bệnh mà được ghi nhận nhiều nhất
là khả năng đối kháng với Vibrio spp.
(Domrongpokkaphan và cs., 2006; Ravi và cs.,
2007). Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy khả
năng kiểm soát sinh học của các chủng Bacilus
đối với Vibrio như Purivirojkul và Areechon
(2007), Balcazar và Tyrone (2007), Nguyễn
Văn Minh và cộng sự, (2011). Trong nghiên
cứu này, chúng tôi khảo sát khả năng đối kháng
V. parahaemolyticus phân lập từ mẫu tôm bệnh
hoại tử gan tụy của một số chủng Bacillus,
đồng thời thử nghiệm hiệu quả bảo vệ vật chủ
của chúng trên quy mô thực nghiệm.
16S rDNA cho kết quả tương ứng là Bacillus
polyfermenticus F27 (Nguyễn Văn Minh và cs.,
2010), Bacillus subtilis Q16 và Bacillus subtilis
Q111 (Nguyễn Văn Minh và cs., 2013)
Tôm thẻ chân trắng giống khỏe mạnh và
không mang các mầm bệnh được cung cấp từ
trại tôm giống Hoàng Thanh Lịch, Vũng Tàu.
Phương pháp nghiên cứu
Phân lập Vibrio parahaemolyticus từ
mẫu tôm bệnh hoại tử gan tụy
Bốn mẫu tôm thẻ có biểu hiện bệnh hoại
tử gan tụy còn sống được thu tại thôn Từ Thiện,
xã Phước Vinh, tỉnh Ninh Thuận. Cố định mẫu
trong nước ở 4oC và vận chuyển về PTN Công
nghệ vi sinh để tiến hành phân lập. Mẫu được
khử trùng bề mặt bằng cồn 70o, tách bỏ phần
giáp đầu ngực. Gan tụy tôm được tăng sinh
trong dung dịch peptone kiềm, ủ ở 37oC. Sau
24 giờ, mẫu đã tăng sinh được cấy ria lên đĩa
thạch môi trường Thiosunfate Citrate Bile Salt
Agar (TCBS), ủ 24 giờ ở 37oC. Chọn khuẩn lạc
điển hình tiến hành nhuộm Gram và định danh
sơ bộ bằng các thử nghiệm sinh hóa theo
khóa phân loại Bergey (Holt và cs., 1994,
MacFaddin 2000).
Thử đối kháng với V. parahaemolyticus
Phương pháp vạch vuông góc: vi khuẩn
gây bệnh được cấy thẳng vạch lên đĩa môi
trường Nutrient agar (NA). Vi khuẩn thử
nghiệm được cấy thẳng vạch vuông góc với
vạch đầu tiên, ủ ở 30oC, quan sát sau 24 giờ.
(Purivirojkul, Areechon 2007)
Phương pháp giếng khuếch tán: trải dịch V.
parahaemolyticus gây bệnh (mật độ 106
CFU/ml) lên đĩa môi trường NA bổ sung 1,5%
NaCl. Dịch nuôi cấy các chủng khuẩn thử
nghiệm sau 24 giờ trong môi trường NB được li
tâm ở 6000 rpm trong 15 phút. 70 µl dịch nổi sau
ly tâm được bổ sung vào giếng có đường kính 6
mm trên đĩa thạch đã trải vi khuẩn gây bệnh. Đo
đường kính vòng kháng khuẩn tạo thành sau 24
giờ ủ ở 30oC. Thí nghiệm được thực hiện với 3
lần lặp lại. (Chythanya và cs., 2002)
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
25 chủng Bacillus (F0, F2, F5, F6, F11, F12,
F13, F14, F21, F26, F27, F33, F34, F35, F36, Q16,
Q111, Q270, BP76, BD68, BD33, T1, T3, T4, X122)
được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ
vi sinh – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ
Chí Minh. Trong đó chủng Bacillus sp. F27
phân lập từ giun quế, Bacillus sp. Q16 và Q111
phân lập từ ao nuôi cá tra đã được định danh
bằng kỹ thuật sinh hóa kết hợp với giải trình
Thử nghiệm đồng nuôi cấy: chủng vi
khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên NA, vi
khuẩn gây bệnh được tăng sinh trên pepton
kiềm ở 30oC/24 giờ. Tạo huyền dịch vi khuẩn
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 17
trong môi trường LB sao cho mật độ vi khuẩn
gây bệnh đạt 103 CFU/mlvà vi khuẩn thử
nghiệm đạt hoặc 105 hoặc 106 hoặc 107
CFU/ml. Đối chứng chỉ bổ sung vi khuẩn gây
bệnh. Đồng nuôi cấy huyền dịch trên ở 30oC
trong 5 ngày. Kiểm tra mật độ sau mỗi 24 giờ
bằng phương pháp trải đĩa trên môi trường
TCBS. Thử nghiệm được tiến hành với 3 lần
lặp lại. (Vaseeharan, Ramasamy, 2003)
Đánh giá tính an toàn của chủng Bacillus
thử nghiệm
nhận số tôm chết hằng ngày cho đến khi tôm
ngưng chết liên tục trong 3 ngày hoặc chết
hoàn toàn.
Lethal Dose 50 (LD50) được tính dựa vào
công thức của Reed và Muech (1938): LD50 =
10(luỹ thừa của nồng độ gây chết nhỏ nhất nhưng trên 50% - PD)
.
Trong đó, Proportionate Distance (PD) = [(tỉ lệ
tôm chết thấp nhất nhưng trên 50% - 50%). (tỉ
lệ tôm chết thấp nhất nhưng trên 50% - tỉ lệ tôm
chết cao nhất nhưng dưới 50%)-1].
Tôm chết được kiểm tra dấu hiệu bệnh lý
và phân lập, định danh vi khuẩn trong gan tụy
của tôm bằng các thử nghiệm sinh hóa theo
khóa phân loại Bergey’s (Holt và cs., 1994;
MacFaddin, 2000).
Thử nghiệm khả năng gây dung huyết
Vi khuẩn thử nghiệm được cấy lên môi
trường thạch máu Blood Agar (bổ sung 5%
máu cừu). Tiến hành với vi khuẩn đối chứng
không tiêu huyết. Đọc kết quả sau khi ủ ở 30oC
trong 24 giờ (Gerhardt và cs., 1981).
Thử nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ tôm
trong điều kiện cảm nhiễm V. parahaemolyticus
của chủng Bacillus thử nghiệm
Thử nghiệm đánh giá tính an toàn của
Bacillus thử nghiệm trên tôm thẻ
Chủng Bacillus thử nghiệm đượctăng sinh
trên môi trường NB ở 30oC/24 giờ. Mật độ thử
nghiệm 106 CFU/ml. V. parahaemolyticus
được tăng sinh trong môi trường canh peptone
kiềm (bổ sung 3% NaCl), ủ 24 giờ ở 37oC, mật
độ thử nghiệm dựa vào kết quả khảo sát LD50,
mật độ sử dụng là 2.LD50 (Vaseeharan và cs.,
2003). Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức với 3
lần lặp lại.
Thí nghiệm được bố trí với các nghiệm
thức bổ sung hoặc không bổ sung chủng
Bacillus thử nghiệm (mật độ 106 CFU/ml). Mật
độ vi khuẩn Bacillus thử nghiệm được xác định
thông qua đường tương quan giữa giá trị OD610
và mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus thử nghiệm
(Trần Linh Thước, 2010). Các nghiệm thức
được bố trí 5l/thùng, với 10 con tôm khoảng 1
g, sạch bệnh và được lặp lại 3 lần. Theo dõi tỷ
lệ sống chết của tôm trong 7 – 14 ngày
(Vaseeharan và cs., 2003).
● NT1: gây cảm nhiễm
V. parahaemolyticus 2 x LD50
● NT2: không gây cảm nhiễm
V. parahaemolyticus và không dùng
chế phẩm vi sinh.
● NT3: gây cảm nhiễm
Thử nghiệm khảo sát khả năng gây chết
trung bình - LD50 của V. parahaemolyticus
lên tôm thẻ
Vi khuẩn V. parahaemolyticus được tăng
sinh trong môi trường canh peptone kiềm (bổ
sung 3% NaCl), ủ 24 giờ ở 37oC. Các nghiệm
thức được bố trí 2,5 l/thùng, với 10 con tôm
khoảng 1g, sạch bệnh và được lặp lại 3 lần.
Tôm được ngâm với V. parahaemolyticus ở các
mật độ: 103, 104, 105, 106 CFU/ml, đối chứng
không bổ sung vi khuẩn. Mật độ vi khuẩn V.
parahaemolyticus thử nghiệm được xác định
thông qua đường tương quan giữa giá trị OD610
và mật độ tế bào vi khuẩn V. parahaemolyticus
thử nghiệm (Trần Linh Thước, 2010). Tôm
nhịn đói trong 12 giờ sau khi cảm nhiễm. Ghi
V. parahaemolyticus 2 x LD50 và bổ
sung vi khuẩn thử nghiệm mật độ 106
CFU/ml.
● NT4: gây cảm nhiễm
V. parahaemolyticus 2 x LD50 và bổ
sung vi khuẩn thử nghiệm mật độ 107
CFU/ml.
Khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với V.
parahaemolyticus của vi khuẩn thử nghiệm
được đánh giá theo ba mức độ: RPS > 50%: cao,
30% < RPS ≤ 50%: trung bình, RPS ≤ 30%:
không có khả năng bảo vệ. Trong đó, thông số
tỉ lệ sống tương đối RPS (Relative Percentage
18 Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23
of Survival) = (1- số ấu trùng tôm chết ở nghiệm
thức bổ sung vi khuẩn khảo sát. số ấu trùng tôm
chết ở nghiệm thức đối chứng âm-1).100%
(Amend, 1981). Đồng thời, kiểm tra mật độ V.
parahaemolyticus trong dịch thử nghiệm.
3. Kết quả
Dựa vào kết quả quan sát đại thể và vi thể
các chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành
định danh theo khoá phân loại Bergey (Holt và
cs., 1994). Kết quả cho thấy chủng NT7 tương
đồng với V. parahaemolyticus (hình 1). Chủng
V. parahaemolyticus NT7 được sử dụng cho
các thí nghiệm tiếp theo.
Phân lập Vibrio parahaemolyticus
B
A
Hình 1. Khảo sát đại thể trên môi trường TCBS (A) và vi thể (B) chủng V. parahaemolyticus NT7
Chủng có đường kính vòng kháng nhỏ nhất là
Bacillus sp. Q270 (10,33mm). Chúng tôi lựa
chọn chủng B. polyfermenticus F27 để thực hiện
các thí nghiệm tiếp theo.
Bằng phương pháp đồng nuôi cấy, ở
nghiệm thức 4 (NT4) mật độ Vibrio thấp hơn
so với đối chứng (NT1) chứng tỏ rằng chủng B.
polyfermenticus F27 có thể ức chế lại V.
parahaemolyticus NT7 khi ở cùng trong một
điều kiện nuôi cấy (hình 4). Trong thử nghiệm
này ta thấy rằng Vibrio bị ức chế mạnh nhất ở
mật độ là 107 CFU/ml.
Khả năng kháng V. parahaemolyticus
NT7 của các chủng Bacillus thử nghiệm
Bằng phương pháp cấy vạch vuông góc,
nhận thấy có 9/25 chủng Bacillus (Q16, F2, F27,
F5, F26, F33, BD68, Q270, Q111) kháng với V.
parahaemolyticus NT7 ở 24 giờ.
Bằng phương pháp giếng khuếch tán,
đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng
thử nghiệm có giá trị từ 10,33 – 18,50mm (hình
2). Trong đó, chủng Bacillus polyfermenticus
F27 có đường kính lớn nhất và có ý nghĩa thống
kê so với các chủng còn lại (18,50mm) (hình 3),
tiếp theo là chủng B. subtilis Q16 (16,25mm).
Hình 2. Khả năng kháng khuẩn của các chủng Bacillus thử nghiệm
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 19
Hình 3. Đường kính vòng kháng khuẩn của một số chủng thử nghiệm
Bacillus thử nghiệm trên tôm thẻ
Tính an toàn của B. polyfermenticus F27
Thử nghiệm khả năng gây dung huyết
Chủng B. polyfermenticus F27 không có
khả năng dung huyết, an toàn đối với tôm (kết
quả không trình bày).
Tính an toàn của chủng B. polyfermenticus
F27 lên tôm trưởng thành được thể hiện qua tỷ
lệ sống không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê
so với đối chứng (không bổ sung vi khuẩn)
được ghi nhận ở Bảng 1.
Thử nghiệm đánh giá tính an toàn của
Bảng 1
Kết quả thử nghiệm tính an toàn của chủng B. polyfermenticus F27 trên tôm
Nghiệm thức Liều thử nghiệm (CFU/ mL) Tổng con sống (con) Tỷ lệ Sống (%)
Đối chứng (ĐC)
0
106
27,83
21,67
46,39 ± 5,88 ns
36,11 ± 6,77
B. polyfermenticus F27
Chú thích: ns: không có sự khác biệt ở mức P =0,05
Khả năng gây chết trung bình - LD50 của V. parahaemolyticus NT7 lên tôm thẻ
Chúng tôi khảo sát khả năng gây chết trung bình của V. parahaemolyticus NT7 lên tôm thẻ 1g
(Bảng 2).
Bảng 2
Kết quả khả năng gây chết LD50
Nghiệm
thức
Liều gây độc Tổng chết
Tổng
Tổng chết Tổng sống Tỷ lệ chết
(CFU.ml-1)
(con)
sống (con) dồn (con)
dồn (con)
dồn (%)
NT1
NT2
NT3
NT4
NT5
0
2
3
28
27
23
22
0
2
110
82
55
22
0
1.79
1.103
1.104
1.105
1.106
5
5.75
7
12
20
50
17.91
47.62
100.0
8
30
PD
LD50
0,95
1,12.105
20 Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23
Kết quả Bảng 2 cho thấy nghiệm thức NT1
(đối chứng âm) không thấy biểu hiện tôm chết.
Điều này chứng tỏ rằng tôm chết là do độc lực
từ vi khuẩn gây ra. Dựa vào công thức tính
LD50, nhận thấy rằng tỷ lệ chết 50% của tôm
sau khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus NT7
là 1,12.105 CFU/ml.
Khả năng bảo vệ tôm thẻ trong điều
kiện cảm nhiễm V. parahaemolyticus NT7
Với kết quả xác định liều gây độc (LD50) là
1,12.105, chúng tôi thử nghiệm đánh giá hiệu quả
kiểm soát sinh học của chủng B. polyfermenticus
F27. Kết quả bảng 3 cho thấy nghiệm thức NT3,
NT4 được bổ sung chủng B. polyfermenticus F27
với các mật độ 106 và 107 CFU/mL trong điều
kiện gây nhiễm vi khuẩn gây bệnh V.
parahaemolyticus NT7 thì có tỷ lệ tôm sống cao
hẳn hơn so với nghiệm thức NT1 chỉ bổ sung V.
parahaemolyticus NT7 và có sự khác biệt có ý
nghĩa (P < 0,05). RPS (%) của các nghiệm thức
NT3, NT4 lần lượt là 66,7% và 76,19% cho thấy
chủng vi khuẩn khảo sát có khả năng bảo vệ tôm
gây nhiễm với V. parahaemolyticus NT7 khá
cao ở mật độ 106 và 107 CFU/ mL. Từ kết quả
trên, chủng B. polyfermenticus F27 đạt mật độ
106 CFU/ml đã có khả năng bảo vệ tôm chống
lại V. parahaemolyticus NT7 và đạt hiệu quả tốt
hơn ở mật độ 107 CFU/ml..
Bảng 3
Kết quả tỷ lệ sống (%) và RPS (%) khi gây nhiễm V. parahaemolyticus NT7
Nghiệm thức
NT1
Tỉ lệ sống (%)
30,00
RPS (%)
NT2
93,33
NT3
73,33
66,7
NT4
83,33
76,19
Trong cùng một cột, các trị số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ớ mức ý nghĩa P=0,05 qua
phép thử Duncan.
Đồng thời, trong thời gian thử nghiệm,
chúng tôi kiểm tra mật độ V. parahaemolyticus
ở các nghiệm thức. Nghiệm thức NT1 mật độ
Vibrio luôn cao hơn so với NT3 và NT4. Điều
này cho thấy chủng B. polyfermenticus F27 có
khả năng ức chế vi khuẩn V. parahaemolyticus
trên quy mô thực nghiệm (hình 4), giúp khẳng
định lại khả năng ức chế của chủng B.
polyfermenticus F27 ở mật độ 106 CFU/ml và
ức chế cao ở mật độ 107 CFU/ml.
Hình 4. Kết quả kiểm tra mật độ V. parahaemolyticus ở các nghiệm thức
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 21
4. Thảo luận
và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ngày càng
gia tăng, làm tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh lẫn
các vi khuẩn có lợi, gây ra tình trạng kháng
thuốc và dư lượng kháng sinh và hóa chất còn
gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức
khỏe người sử dụng. Do đó kết quả của nghiên
cứu này giúp mở ra một hướng phát triển mới
cho ngành chế phẩm thủy sản - chế phẩm an
toàn cho con người và không ảnh hưởng đến
môi trường sinh thái.
Nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus
spp. đã cho thấy rằng chúng có thể làm giảm
mật độ vi khuẩn gây bệnh trong nuôi trồng thủy
sản. Như báo cáo của Vaseeharan, Ramasamy
(2003) đã sử dụng Bacillus subtilis BT23 để
kiểm soát V. harveyi. Nghiên cứu của Balcazar
và Tyrone (2007) cũng cho thấy Bacillus
subtilis UTM 126 có khả năng kiểm soát sinh
học chủng V. parahaemolyticus (Balcazar và
Tyrone, 2007). Nguyễn Văn Minh và cộng sự
(2011) đã sử dụng 3 chủng vi khuẩn Bacillus
spp. (F11, F33, F10) có khả năng kiểm soát sự
tăng trưởng của 3 chủng vi khuẩn gây bệnh là
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V.
harveyi ở mật độ Bacillus spp. tốt nhất là 109
CFU/ml (Nguyễn Văn Minh và cs., 2011). Ở
nghiên cứu này, chúng tôi chọn lọc được chủng
B. polyfermenticus F27 có khả năng kháng V.
parahaemolyticus NT7 cao nhất (18,50 mm).
Ở thử nghiệm tính an toàn của chủng B.
polyfermenticus F27 được đánh giá dựa trên 2
thử nghiệm là khả năng huyết giải và tính an
toàn đối với tôm. Thử nghiệm khả năng dung
huyết là bước sàng lọc tính gây bệnh của các
chủng để đảm bảo an toàn đối với động vật
thủy sản và cho động vật có vú nói chung nhằm
đảm bảo tính an toàn khi thực phẩm thủy sản
bị nhiễm cho con người qua chuỗi thức ăn
(Shafiqur, 2009). Trong nghiên cứu của
Shafiqur (2009) về Bacillus spp. phân lập được
từ ao tôm tỉ lệ dương tính hemolysin là 48,64%.
Chủng B. polyfermenticus F27 được đánh giá an
toàn đối với tôm nên được lựa chọn để tiến
hành thử nghiệm tiếp theo.
Chúng tôi đã phân lập được chủng V.
parahaemolyticus NT7 từ mẫu tôm thẻ bệnh
hoại tử gan tụy. Thử nghiệm khả năng đối
kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc
cho thấy có 9 trong số 25 chủng Bacillus kháng
V. parahaemolyticus NT7. Trong đó, chủng B.
polyfermenticus F27 phân lập từ giun quế có
đường kính lớn nhất là 18,50 mm, khác biệt
thống kê so với các chủng còn lại, có khả năng
ức chế V. parahaemolyticus NT7 khi tiến hành
đồng nuôi cấy, an toàn đối với tôm giống được
lựa chọn cho những thử nghiệm tiếp theo.
Đồng thời chứng minh được chủng B.
polyfermenticus F27 có khả năng bảo vệ tôm thẻ
chống lại V. parahaemolyticus gây bệnh trên mô
hình gây nhiễm nhân tạo. Sau thời gian thử
nghiệm, 93,33% tôm ở nghiệm thức đối chứng
không bổ sung vi khuẩn (NT2) vẫn sống và hoạt
động bình thường chứng tỏ các yếu tố môi trường
không ảnh hưởng đến tôm. Bên cạnh đó, tôm
chết ở các nghiệm thức đều có dấu hiệu của bệnh
hoại tử gan tụy và phân lập được V.
parahaemolyticus từ những mẫu này. Điều này
chứng tỏ tôm ở các nghiệm thức chết là do V.
parahaemolyticus. Số lượng tôm sống ở các
nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa (P <
0,05). Trong đó, các nghiệm thức NT3, NT4 bổ
sung B. polyfermenticus F27 với mật độ 106 và
107 CFU/ml có tỷ lệ sống cao hơn gấp 2,44 và
2,78 lần so với nghiệm thức đối chứng NT1. RPS
(%) của các nghiệm thức NT3, NT4 đều lớn hơn
50% cho thấy khả năng bảo vệ tôm khá cao của
chủng khảo sát. Kết quả của nghiên cứu này cho
thấy chủng Bacillus polyfermenticus F27 có tiềm
năng ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học kiểm
soát và phòng bệnh EMS/AHPNS trên tôm.
Nguyễn Văn Minh và cộng sự (2011) đã
phân lập được 2 chủng Bacillus sp. F10 và F11
từ giun quế có khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú
chống lại V. parahaemolyticus (Nguyễn Văn
Minh và cs., 2011). “Kết quả của nghiên cứu thí
nghiệm khả năng bảo vệ tôm giống trong điều
kiện cảm nhiễm V. parahaemolyticus NT7 cho
thấy B. polyfermenticus F27 có khả năng bảo vệ
tôm giống”.
5. Kết luận
Hiện nay, tình trạng lạm dụng kháng sinh
22 Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23
Tài liệu tham khảo
Balcazar, J. L. & Rojas-Luna, T. (2007). Inhibitory activity of probiotic Bacillus subtilis UTM 126
against Vibrio species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp (Litopenaeus
vannamei). Curr Microbiol, 55(5), 409-412.
Chythanya, R., Karunasagar, I. & Karunasagar, I. (2002). Inhibition of shrimp pathogenic vibrios
by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture, 208, 1-10.
Domorongpokkaphan, V. & Wanchaitanawong, P. (2006). In vitro Antimicrobial Activity of
Bacillus spp. Against Pathogenic Vibrio spp. in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon).
Kasetsart J., 40, 949-957.
FAO (2013). Report of the FAO/MARD technical workshop on early mortality syndrome (EMS)
or acute hepatopancreatic necrosis syndrome (AHPNS) of cultured shrimp (under
TCP/VIE/3304) Hanoi, Vietnam, on 25–27 June 2013. FAO Fisheries and Aquaculture
Report No. 1053.
Flegel, T.W. (2012). Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia.
Journal of Invertebrate Pathology, 110, 166-173.
Gatesoupe, F. J. (1999). The use of probiotics in aquaculture. Aquaculture 180, 147-165.
Smibert, R.M. and Krieg, N.R. (1981) General Characterization. In: Gerdhardt, P., Murray,
R.G.E., Costilow, R.N., Nester, E.W., Wood, W.A., Krieg, N.R. and Phillips, G.B., Eds.,
Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for Microbiology,
Washington, DC, 409-443.
Han, J. E. et al. (2015). Plasmid mediated tetracycline resistance of Vibrio parahaemolyticus
associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimps. Aquaculture,
2, 17-21.
Holt, J. G. et al. (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th edition, Chapper V,
816 pages.
Kondo, H. et al. (2014). Draft genome sequences of six strains of Vibrio parahaemolyticus Isolated
from Early Mortality Syndrome/Acute Hepato- pancreatic Necrosis Disease shrimp in
Thailand. Genome Announc, 2(2), (e00221-14).
Lightner, D.V. et al. (2013). Determination of the infectious nature of the agent of acute
hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic
Organisms, 105, 45-55.
Lightner, D.V. et al. (2012). Early mortality syndrome affects shrimp in Asia. Global Aquaculture
Advocate, January/February, 40.
MacFaddin, J.F. (2000). Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3rd Edition,
Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
Mooney, A. (2012). An emerging shrimp disease in Vietnam, microsporidiosis or liver disease?
Moriarty, D. J. W. (1997). The role of microorganisms in aquaculture ponds. Aquaculture, 151,
333-349.
NACA-FAO (Network of Aquaculture Centers in Asia-Pacific-Food and Agriculture Organization
of the United Nations) (2011). Quarterly Aquatic Animal Disease Report (Asia and Pacific
Nguyễn Văn Minh và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(4), 14-23 23
Region), 2011/2, April–June 2011. NACA, Bangkok.
Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Hoàng Tuấn Duy, Đỗ Phương Quỳnh, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật
Linh, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Lê Hồng Phước (2013). Khả năng kiểm soát sinh học
Edwardsiella ictaluri gây bệnh của một số chủng Bacillus spp. phân lập từ ao nuôi cá tra.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 51(5C), 508-512.
Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Đan Duy Pháp, Lai Phong Mỹ Lệ, Lại Thị Minh Lê, Nguyễn
Thị Hồng Phương, …, Phạm Hùng Vân (2010). Phân lập và sàng lọc một số vi khuẩn tiềm
năng làm probiotic trong nuôi trồng thủy sản từ trùn quế (Perionyx excavatus). Hội nghị
CNSH thủy sản toàn quốc, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn.
Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Đỗ Bảo Ngọc, Trần Thị Khánh Linh, Hà Thị Bảo Yến,
Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh (2011). Nghiên cứu khả năng kiểm soát Vibrio
spp. gây bệnh trên tôm sú của một số chủng Bacillus spp. phân lập từ trùn quế. Tạp chí NN
& PTNN, 137 -143.
Purivirojkul, W. & Areechon, N. (2007). Application of Bacillus spp. isolated from the intestine
of blacktiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius) from natural habitat for control
pathogenic bacteria in aquaculture. Kasetsart J. (Nat. Sci.) 41, 125-132.
Shafiqur, R.et al. (2009) Application of probiotic bacteria: A novel approach towards ensuring food
safety in shrimp aquaculture. Journal of Bangladesh Academy of Sciences, 33(1), 139-144.
Schryver, P., Defoirdt, T. & Sorgeloos, P. (2014). Early Mortality Syndrome Outbreaks: A
Microbial Management Issue in Shrimp Farming?. Pathogens magazines, Ghent University,
Gent, Belgium.
Ravi, A .V. et al. (2007). Screening and evaluation of probiotics as a biocontrol agent against
Reed, J. L. & Muench, H. (1938). A simple method of estimating fifty percent Endpoints. The
American journal of hygiene, 27, 493-497.
Tran, L. et al. (2013). Determination of the infectious nature of the agent of acute hepato-pancreatic
necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 105, 45–55.
Tổng cục Thủy sản (2014a). Hội thảo Khoa học bệnh Đốm trắng và bệnh Hoại tử gan tụy cấp trên
Trần Linh Thước (2010). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm.
NXB Giáo Dục Việt Nam, 70 trang.
Vaseeharan, B., Lin, J. & Ramsamy, P. (2003). Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus
subtilis BT23, a Possible Probiotic Treatment for Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon).
Lett Appl Microbiol, 36(2), 83-87.
Verschuere, L., Rombaut, P. & Verstraete, W. (2000). Probiotic bacteria as biological control
agents in aquaculture. Microbiology Molecular Biology Reviews, 64(4), 655-671.
Zorriehzahra, M.J. & Banaederakhshan, R. (2015). Early mortality syndrome (EMS) as new
emerging threat in shrimp industry. Adv. Anim. Vet. Sci., 3, 64-72.
10 trang
16520
Free
Bạn đang xem tài liệu "Khả năng kiểm soát sinh học Vibrio parahaemolyticus NT₇ phân lập từ tôm thẻ bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) của chủng Bacillus polyfermenticus F₂₇ phân lập từ giun quế", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- kha_nang_kiem_soat_sinh_hoc_vibrio_parahaemolyticus_nt_phan.pdf
