Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đạm tiêu hóa trong thức ăn tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus Vannamei)
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐẠM TIÊU HꢀA
TRONG THỨC ĂN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Litopenaeus Vannamei)
Nguyễn Thị Lan Chi1, Nguyễn Văn Nguyện1, Lê Thị Lâm1, Vũ Mai Hoa2
TÓM TẮT
Độ tiêu hꢀa protein là một chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng nguyên liệu sản xuất thức
ăn thủy sản. Đã cꢀ rất nhiều nghiên cứu nhằm phát triển các phương pháp in vitro xác định nhanh
protein tiêu hꢀa, thay thế phương pháp nuôi thử nghiệm in vivo. Các phương pháp pH stat, pH
drop, pepsin tiêu hꢀa sử dụng đơn/đa enzyme, một giai đoạn/nhiều giai đoạn đã được nghiên cứu
từ nhꢁng năm 1970 trên động vật hꢁu nhũ, cho kết quả tương quan đáng kể so với phương pháp in
vivo. Tuy nhiên, cho đến nay việc áp dụng các phương pháp này cho động vật thủy sản vẫn chưa cꢀ
nhiều nghiên cứu. Hiện nay, Viện Nghiên cứu Nuôi trꢂng Thủy sản 2 đang thực hiện nghiên cứu về
quy trình xác định nhanh protein tiêu hꢀa trong thức ăn tôm thẻ chân trắng. Mục tiêu của đề tài là
tìm ra một công cụ hỗ trợ cho công tác quản lý của các nhà chức năng khi kiểm tra, đánh giá chất
lượng thức ăn trên thị trường. Đề tài đã tiến hành khảo sát 5 phương pháp: pH drop 3 hay 4 enzyme,
pH stat 3 hay 4 enzyme và phương pháp pepsin tiêu hꢀa. Kết quả cho thấy chỉ cꢀ phương pháp
pH stat 3 enzyme là cꢀ mối tương quan đáng kể so với phương pháp in vivo (R2 = 0,6664), nhꢁng
phương pháp còn lại cꢀ hệ số tương quan khá thấp (R2 < 0,13). Tuy nhiên, hệ số tương quan của
phương pháp pH stat 3 enzyme vẫn chưa cao để áp dụng, do đꢀ đề tài sẽ tiếp tục khảo sát thêm để
cꢀ thể nâng cao hệ số tương quan cũng như độ chính xác của phương pháp.
Từ khꢀa: đạm tiêu hóa, độ tiêu hóa protein, phương pháp in vitro, phương pháp in vivo, pH drop,
pH stat, pepsin tiêu hóa, thức ăn tôm thẻ chân trắng.
I. MỞ ĐẦU
biểu kiến của vật nuôi. Các phương pháp in
vitro dꢄng để đánh giá protein tiêu hꢀa là rất
cần thiết. Bởi vì chúng thường nhanh và ít tốn
kém hơn so với các phương pháp in vivo. Theo
Dimes & Haard (1994), ban đầu, các phương
pháp in vitro dựa trên khả năng thủy phân của
các enzyme như pepsin (Sheffner et al., 1956),
protease từ Streptomyces griseus (Ford & Salter,
Nhꢁng nghiên cứu về dinh dưꢃng của vật
nuôi thủy sản rất cần thiết trong ngành nuôi
trꢂng thủy sản vì ảnh hưởng trực tiếp đến lợi
nhuận. Hiệu quả cho ăn phụ thuộc vào kiến
thức về cách vật nuôi tiêu hꢀa thức ăn. Trong
nuôi trꢂng thủy sản, các thử nghiệm nuôi in
vivo thường xác định giá trị dinh dưꢃng của
thức ăn khi đánh giá tốc độ tăng trưởng. Tuy 1966), papain (Buchanan, 1969) hay trypsin
nhiên, nhꢁng phương pháp này chi phí rất cao,
tốn nhiều thời gian và kết quả bị ảnh hưởng bởi
các yếu tố môi trường.
(Maga et al., 1973). Sau đꢀ, kỹ thuật đa enzyme
tiêu hꢀa 1 giai đoạn như phương pháp 3 enzyme
(trypsin, chymotrypsin, aminopeptidase của Hsu
Ngày nay, các nhà khoa học rất quan tâm et al., 1977), phương pháp 4 enzyme (trypsin,
đến việc phát triển nhꢁng phương pháp nhanh, chymotrypsin, aminopeptidase và protease từ
nhưng cho kết quả tương đꢂng với độ tiêu hꢀa Streptomyces griseus của Satterlee et al., 1979).
1 Trung tâm Công nghệ sau Thu hoạch, Viện Nghiên cứu Nuôi trꢂng Thủy sản 2
E-mail: lanchiria2@yahoo.com.vn
2 Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp. HCM
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
127
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Kỹ thuật 4 enzyme cho tương quan tốt với hiệu phương pháp in vivo. Tuy nhiên thí nghiệm sử
quả sử dụng protein (PER) cho cả protein thực dụng hỗn hợp 3 enzyme và 4 enzyme đã không
vật và protein động vật. Tiêu hꢀa 2 giai đoạn sử cho thấy sự khác biệt về chất lượng giꢁa các
dụng pepsin và một hay nhiều protease và/hoặc loại bột cá.
peptidase cũng đã được nghiên cứu (Thresher et
al. 1989). Các phương pháp này tuy cho kết quả
ổn định trên động vật máu nꢀng, nhưng để áp
dụng cho động vật thủy sản vẫn còn là một vấn
đề cần quan tâm.
Một nghiên cứu khác trên tôm thẻ chân
trắng cũng đã được thực hiện bởi Lemos et al.
(2009). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm
đánh giá khả năng ước lượng đạm tiêu hꢀa trên
26 mẫu nguyên liệu bằng phương pháp pH stat,
Các nghiên cứu về đạm tiêu hꢀa trên động sử dụng enzyme tách chiết từ khối gan tụy tôm.
vật thủy sản chủ yếu được thực hiện nhằm Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhꢁng điều kiện
khảo sát nguyên liệu. Năm 1997, Ezquerra et khác nhau nhưng hệ số tương quan khá tương
al. dꢄng phương pháp pH-stat để dự đoán tiêu đꢂng nhau (r2 = 0,85 – 0,86). Mối tương quan
hꢀa protein ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus giꢁa DH% và APD là phương trình phi tuyến y
vannamei). Tác giả sử dụng phương pháp pH- = (a+bx)/(1+cx+dx2).
stat với 2 nguꢂn enzyme: enzyme tách chiết từ
gan tụy tôm và hỗn hợp 4 enzyme thương mại
để xác định mức độ thủy phân protein (DH),
ước tính chất lượng protein trong bột cá mòi
dầu, cá cơm, cá tuyết, bột phụ phꢅm cá ngừ,
bánh dầu đậu nành, bột tôm langostilla. Kết quả
cho thấy cꢀ sự tương quan đáng kể giꢁa mức
độ thủy phân protein DH và sự tiêu hꢀa protein
biểu kiến APD. Hệ số tương quan r2 = 0,77 đối
với enzyme tách chiết từ gan tụy tôm và r2=0,71
đối với enzyme thương mại.
Với mục tiêu tìm kiếm một công cụ hỗ trợ
cho công tác kiểm tra, đánh giá chất lượng đạm
tiêu hꢀa trong thức ăn thủy sản, đề tài thực hiện
khảo sát một số phương pháp in vitro (gꢂm:
phương pháp pH drop 3 và 4 enzyme, pH stat 3
và 4 enzyme, phương pháp pepsin tiêu hꢀa), sau
đꢀ so sánh mối tương quan với phương pháp in
vivo nhằm tìm ra phương pháp cꢀ tương quan
gần nhất.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Tương tự, năm 1998, Lazo et al. đã sử dụng
phương pháp pH drop 1 enzyme (trypsin theo
Lazo, 1994), 3 enzyme (trypsin, α-chymotrypsin
và peptidase theo Hsu et al., 1977) và 4 enzyme
(trypsin, α-chymotrypsin, peptidase và pronase
E theo Satterlee et al., 1979) để ước tính
protein tiêu hꢀa ở tôm thẻ chân trắng (Penaeus
vannamei) trên các nguyên liệu như casein,
gelatin, cám gạo, bột tôm, bánh dầu đậu nành,
bột mì và một số loại bột cá. Kết quả cho thấy
phương pháp 1 enzyme và 3 enzyme ít nhạy
hơn so với phương pháp 4 enzyme khi phân
biệt sự khác nhau về protein tiêu hꢀa giꢁa các
thành phần nguyên liệu. Phương pháp 4 enzyme
cho kết quả xếp loại nguyên liệu theo protein
tiêu hꢀa tương tự như khi xác định APD bằng
2.1. Vật liệu
Thức ăn thủy sản dꢄng trong nghiên cứu
là các loại thức ăn dꢄng cho nuôi tôm thẻ chân
trắng, khá phổ biến trên thị trường do các công
ty tại Việt Nam sản xuất như Uni-president,
Tongwei, CJ-Vina và CP. Mỗi công ty thu từ 1 -
4 mẫu thức ăn cꢀ thành phần protein khác nhau.
Đối tượng nghiên cứu trong nuôi thử
nghiệm in vivo là tôm nuôi thương phꢅm (trọng
lượng tôm từ 8–10g/con) được thu tại Trung
tâm Quốc gia giống thủy hải sản Nam Bộ, Bà
Rịa Vũng Tàu (Viện Nghiên cứu Nuôi trꢂng
Thủy sản II) sau khi kiểm tra không cꢀ mầm
bệnh nguy hiểm.
Các enzyme trong khảo sát in vitro là các
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
128
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
dịch azocasein 1% vào tất cả các ống, ủ ở 25oC
enzyme tinh khiết hoặc hỗn hợp enzyme được
chiết tách từ vi sinh vật của các hãng Himedia
(Ấn Độ), Sigma-Aldrich (Mỹ) và Novozyme
(Đan Mạch): Pepsin tinh khiết, hoạt độ 1:10000
(RM1251, Himedia); Trypsin từ tụy heo, loại
IX-S, hoạt độ: 13.000 - 20.000 (T0303, Sigma-
Aldrich); α-chymotrypsin từ tụy bò, loại II,
hoạt độ: ≥ 40.000 (C4129, Sigma-Aldrich);
Protease từ Streptomyces griseus, loại XIV, hoạt
độ ≥ 3,5 (P5147, Sigma-Aldrich); Protamex®,
Flavourzyme® 500mg và Neutrase® 0,8L
(Novozyme).
trong 10 phút, ngừng phản ứng trong ống đo
mẫu bằng cách thêm 0,5ml TCA 20%. Ly tâm
các ống ở 16.500g trong 5 phút. Đo độ hấp
thu ở bước sꢀng 366nm (Navarrete del Toro &
García-Carreño, 2002). Kết quả hoạt độ được
tính theo công thức:
A366
Hoạt độ hỗn hợp enzyme =
(U/ml)
10 * 0,007
Trong đꢀ: 10: thời gian phản ứng (phút);
0,007: thể tích hỗn hợp enzyme (ml).
Các thí nghiệm khảo sát in vitro được thực
hiện từ tháng 05 đến tháng 11 năm 2012, chủ
yếu tại phòng thí nghiệm Hꢀa sinh, Vi sinh và
phòng thí nghiệm dinh dưꢃng động vật nuôi
thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ sau thu
2.2.3. Phương pháp pH drop 3 enzyme
Theo Hsu et al. (1977) và Lazo et al. (1998),
phương pháp pH drop 3 enzyme được thực hiện
hoạch (Viện Nghiên cứu nuôi trꢂng thủy sản II). như sau: cân mẫu thức ăn và casein sao cho mẫu
chứa 6,25mg protein. Thêm 10ml nước cất vào
các cốc, lắc đều trong 1 giờ, ở nhiệt độ phòng.
Điều chỉnh pH dung dịch về pH 8,0 bằng NaOH
0,1N. Thêm 1,0ml hỗn hợp enzyme (1,6mg/ml
trypsin + 3,1mg/ml chymotrypsin + 1,6mg/ml
Flavourzyme® 500MG), lắc đều, đo lại pH sau
10 phút. Kết quả xác định độ tiêu hꢀa tương đối
như sau:
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chuẩn bị mẫu
Thức ăn thương mại thu được được xay mịn
và sàng qua rây 0,5mm. Sau đꢀ, trộn với 1%
Cr2O3. Thêm khoảng 50 - 55% nước cất vào thức
ăn, nhào và trộn đều cho đến khi thức ăn thành
một hỗn hợp đặc, sệt, khi bꢀp nén lại thành cục.
Sử dụng máy xay thịt Meat mincing machine
TJ12-B để ép lại viên thức ăn, mặt sàng 2mm,
ép nhiều lần nhằm tăng độ nén và độ bền của
viên thức ăn. Sau đꢀ, sấy khô ở 60oC trong 24
giờ, thỉnh thoảng mở cửa tủ sấy nhằm tạo sự
thông thoáng và để không khí ꢅm cꢀ thể thoát
ra ngoài. Trong quá trình sấy, kiểm tra nhanh
độ ꢅm của viên thức ăn, nếu độ ꢅm < 10% là
đạt. Sau đꢀ, thức ăn được cắt nhỏ thành viên
cꢀ kích thước 5mm. Trước khi tiến hành nuôi
thử nghiệm, thức ăn được đem phân tích độ ꢅm,
thành phần protein thô và hàm lượng Cr2O3.
(-∆pH mẫu)
Độ tiêu hꢀa protein tương đối
(RPD, %)
=
* 100
(-∆pH casein)
2.2.4. Phương pháp pH drop 4 enzyme:
(Satterlee et al., 1979; Lazo et al., 1998)
Chuꢅn bị mẫu tương tự pH drop 3 enzyme.
Sau đꢀ, thêm 1,0ml dung dịch A (1,6mg/ml
trypsin + 3,1mg/ml chymotrypsin + 1,6mg/ml
Flavourzyme® 500MG), lắc đều trong 10 phút.
Thêm 1,0ml dung dịch B (7,95mg/ml protease
từ Streptomyces griseus), lắc đều và chuyển vào
bể ủ nhiệt, ủ ở 55oC trong 9 phút. Lấy cốc ra để
ở nhiệt độ phòng và ghi nhận giá trị pH sau 1
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ hỗn
hợp enzyme
Hút 7μl hỗn hợp enzyme và 0,5ml dung
dịch đệm Tris HCl 50 mM (pH = 7,5) cho vào
ống mẫu và mẫu trắng. Thêm 0,5ml TCA 20% phút. Độ tiêu hꢀa tương đối được tính tương tự
vào ống mẫu trắng. Sau đꢀ, thêm 0,5ml dung pH drop 3 enzyme.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
129
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
2.2.5. Phương pháp pH stat 3 enzyme: ml trypsin + 3,1mg/ml chymotrypsin + 1,6mg/
ml Flavourzyme® 500MG), lắc đều và duy trì
pH của dung dịch ở pH 8,0 bằng cách thêm
NaOH 0,1N từ máy chuꢅn độ điện thế tự động
Radiometer TritraLab 865, trong 3 giờ. Sau đꢀ,
ghi nhận lại thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng.
(Pedersen & Eggum, 1983)
Cân mẫu thức ăn sao cho mẫu chứa
18,75mg protein. Thêm 30ml nước cất vào các
cốc, lắc đều trong 1 giờ, ở nhiệt độ phòng. Điều
chỉnh pH dung dịch về pH 8,0 bằng NaOH
0,1N. Thêm 3,0ml hỗn hợp 3 enzyme (1,6mg/
Độ thủy phân (DH, %) = B*NB*1/α*1/MP*1/htot*100
Trong đꢀ: B: thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng (ml); NB:
Nꢂng độ đương lượng của NaOH (N); 1/α: Hệ số thuỷ
phân của nhꢀm a -amin phụ thuộc pK amin ở điều kiện
nhiệt độ và pH thực nghiệm; MP: lượng protein trong
phản ứng (%); 1/htot: tổng số liên kết peptide của các mẫu
protein khác nhau (meq/g).
Hình 1.
Máy chuꢅn độ điện thế tự động
2.2.6. Phương pháp pH stat 4 enzyme: motrypsin + 1,6mg/ml Flavourzyme® 500MG
(Ezquerra et al., 1997)
+ 7,95mg/ml protease từ Streptomyces griseus),
thời gian phản ứng là 2 giờ. Kết quả xác định độ
thủy phân (DH) được tính theo công thức như
trong phương pháp pH stat 3 enzyme.
Thực hiện tương tự phương pháp pH stat 3
enzyme, tuy nhiên enzyme sử dụng là hỗn hợp
4 enzyme (1,6mg/ml trypsin + 3,1mg/ml chy-
2.2.7. Phương pháp pepsin tiêu hóa:
(Siccardi III, 2006; AOAC, 971.09)
Ban đầu mẫu được khử béo bằng cách chiết
mẫu với ether dầu bằng Soxhlet.
Cân 0,5g mẫu đã khử béo, cho vào ống máy
xoay cꢄng với 150ml dung dịch pepsin 0,0002%
(trong HCl 0,075N). Ủ ở 45oC, tốc độ xoay: 15
vòng/phút, trong 16 giờ.
Sau khi ủ, để lắng, lọc bằng giấy lọc đã cân
trọng lượng qua phễu buchner. Rửa lại 2 lần với
acetone, mỗi lần 15 mL acetone.
Xác định protein thô trên cặn thu được (Protein
thô của cặn không tiêu hꢀa).
Hình 2. Máy xoay ủ mẫu trong xác định
pepsin tiêu hꢀa
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
130
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Protein thô cặn thu được x 100
}
Protein tiêu hꢀa (%) = 100 -
{
Protein thô của mẫu
Nếu xem xét hàm lượng Nitơ phi protein:
Protein thô cặn thu được x 100
}
Protein tiêu hꢀa (%) = 100 -
{
Protein thô của mẫu – (Nitơ phi protein x 6,25)
2.2.8. Quy trình nuôi thử nghiệm in vivo
kiểm tra lại lượng thức ăn đã cho ăn. Sau đꢀ,
tiến hành siphon nhꢁng cặn không phải là phân
trong bể để chuꢅn bị thu phân, ngày thu phân 2
lần, thu phân bằng cách siphon. Tôm được nuôi
tới khi thu đủ phân thí nghiệm.
Chọn tôm thí nghiệm cꢀ kích cꢃ đꢂng đều
(8 – 10g), khỏe mạnh, còn đầy đủ râu, bơi lội
nhanh nhẹn. Tôm được bố trí vào 30 bể kính
cꢀ đánh số, mật độ 10 con/bể, thể tích bể 120
lít, thể tích chứa nước 70 lít, nước nuôi tôm cꢀ
độ mặn 18‰. Thử nghiệm bao gꢂm 10 nghiệm
thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Trước
khi thí nghiệm tôm được nuôi dưꢃng trong vòng
một tháng để thích nghi với môi trường, cho
ăn cꢄng một loại thức ăn thương mại. Sau đꢀ
tập cho tôm ăn thức ăn thí nghiệm trong vòng 3
ngày rꢂi mới tiến hành thu phân.
Hệ thống sục khí hoạt động liên tục suốt ngày
đêm. Hệ thống lọc nước chỉ được sử dụng vào ban
đêm. Định kỳ một tuần thay nước một lần, thay
khoảng 50% thể tích nước của bể.
Trong thời gian thí nghiệm các chỉ tiêu
môi trường như: pH, to, DO, N-NH3, N-NO2
-
được theo dõi thường xuyên: pH, nhiệt độ đo
-
mỗi ngày 1 lần; DO, N-NH3, N-NO2 đo mỗi
tuần 1 lần.
Khi tiến hành thử nghiệm cho tôm ăn 03
lần/ngày, cho ăn 4 - 6% trọng lượng thân, lượng
thức ăn được điều chỉnh sao cho tôm ăn hết tránh
để thức ăn còn dư trong bể. Sau 45 phút cho ăn
Phân thu được được bảo quản ở -20oC
cho đến khi tiến hành sấy đông khô. Sau khi
sấy đông khô, phân được đem xác định độ ꢅm,
protein thô và hàm lượng Cr2O3.
% Cr2O3thức ăn
% Cr2O3phân
% protein phân
Độ tiêu hꢀa protein = 100 -
khả kiến APD (%)
{
x
x 100
}
% protein thức ăn
2.2.9. Phương pháp phân tích
Hàm lượng Nitơ phi protein xác định theo
TCVN 8801:2011.
Hàm lượng protein thô được xác định theo
TCVN 4328-1:2007.
Hàm lượng Cr2O3 được xác định theo
phương pháp của Furukawa & Tsukahara, 1966.
Hàm lượng N-NO2- xác định theo phương
pháp APHA 2005.4500.NO2-B.
Hàm lượng lipid thô được xác định theo
TCVN 4331:2001.
Hàm lượng tro được xác định theo TCVN
4327:2007.
Hàm lượng N-NH3 xác định theo phương
pháp APHA 2005.4500.NH3 F.
Độ ꢅm được xác định theo TCVN
4326:2001.
Hoạt độ peptidase được xác định theo
phương pháp của Sigma-Aldrich.
Hàm lượng carbonhydrate được xác định
bằng phương pháp ngoại suy khi trừ 100 cho
phần trăm độ ꢅm cộng với protein thô, lipid
và tro.
Hoạt độ của hỗn hợp 3 hay 4 enzyme trên
được xác định theo phương pháp azocasein của
Ezquerra et al. (1997).
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
131
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
3.1.2. Kết quả xác định hoạt độ hỗn hợp 3
III. KẾT QUẢ
enzyme và 4 enzyme
3.1. Kết quả khảo sát hoạt độ enzyme
- Hỗn hợp 3 enzyme gꢂm: 1,6mg/ml
trypsin (T0303, Sigma-Aldrich) + 3,1mg/
ml chymotrypsin (C4129, Sigma-Aldrich) +
1,6mg/ml Flavourzyme® 500mg (Novozyme).
3.1.1. Khảo sát enzyme thay thế peptidase
từ màng nhầy ruột heo P7500 (Sigma-Aldrich,
40 units/g)
Tiến hành khảo sát hoạt độ các enzyme
thay thế petidase từ màng nhầy ruột heo P7500
(Sigma-Aldrich, 40 units/g), gꢂm các chế phꢅm
enzyme như: Protamex®, Flavourzyme® 500mg
và Neutrase® 0,8L (Novozyme).
- Hỗn hợp 4 enzyme gꢂm: 1,6mg/ml
trypsin (T0303, Sigma-Aldrich) + 3,1mg/
ml chymotrypsin (C4129, Sigma-Aldrich) +
1,6mg/ml Flavourzyme® 500mg (Novozyme)
+ 7,95mg/ml protease từ Streptomyces griseus
(P5147, Sigma-Aldrich).
Bảng 1. Kết quả xác định hoạt độ peptidase của
một số enzyme thay thế
Bảng 2. Kết quả xác định hoạt độ hỗn hợp
enzyme
Enzyme
Hoạt độ (units/g enzyme)
Hỗn hợp enzyme
Hoạt độ (U/ml)
3 enzyme
4,7 ± 0,2
4 enzyme
10,9 ± 0,4
Protamex®
0,003
31,9 ± 1,6
0
Flavourzyme® 500mg
Neutrase® 0,8L
Khi so sánh hoạt độ của hai hỗn hợp này,
cꢀ thể thấy hoạt độ của hỗn hợp 4 enzyme cao
hơn hẳn so với hỗn hợp 3 enzyme. Tuy nhiên,
ý nghĩa của việc xác định hoạt độ của hỗn hợp
enzyme là nhằm đảm bảo tính ổn định của hỗn
hợp enzyme sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Từ bảng trên cꢀ thể thấy trong ba
enzyme được chọn khảo sát, chỉ cꢀ sản phꢅm
Flavourzyme® 500mg cꢀ hoạt độ peptidase (31,9
± 1,6 units/g enzyme), hai sản phꢅm còn lại gần
như không phát hiện. Theo Hsu et al. (1977) và
Navarrete del Toro & García-Carreño (2002),
peptidase từ màng nhầy ruột heo dꢄng trong
phương pháp pH drop hay pH stat cꢀ hoạt độ
khoảng 40 units/g enzyme. Như vậy, sản phꢅm
Flavourzyme® 500mg cꢀ hoạt độ tương đương
và cꢀ thể dꢄng làm enzyme thay thế peptidase
P7500 (Sigma-Aldrich) trong các phương pháp
3.2. Kết quả phân tích thành phần dinh
dưỡng trong các mẫu thức ăn được khảo sát
Trong 10 thức ăn tôm thẻ chân trắng được
khảo sát, tất cả các mẫu đều cꢀ protein thô >
44% (từ 44, 22 – 47,47%). Hàm lượng lipid thô
từ 6,73 – 8,21%. Tro thô từ 10,93 – 13,80%.
Hàm lượng xơ thô từ 1,61 – 3,46%. Khi xét hàm
lượng Nitơ phi protein, hàm lượng dao động từ
pH drop hay pH stat khi xác định độ tiêu hꢀa và 8,13 – 9,49%, thay đổi không phụ thuộc hàm
lượng protein thô.
độ thủy phân protein.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
132
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 3. Thành phần dinh dưꢃng của thức ăn tôm thẻ chân trắng được khảo sát
Protein
Lipid
Tro
Xơ
NPP
Thức ăn
Ẩm (%)
(%, VCK)
(%, VCK)
(%, VCK)
(%, VCK)
(%, VCK)
TT A0 (40%)
TT A4 (40%)
TT A5 (38%)
TT B1 (40%)
TT B3 (40%)
TT B4 (38%)
TT C3 (40%)
TT C4 (38%)
TT C4Plus (40%)
TT D3 (40%)
8,81 ± 0,04
8,12 ± 0,03
8,50 ± 0,04
8,89 ± 0,03
9,88 ± 0,06
9,67 ± 0,02
7,71 ± 0,05
8,62 ± 0,02
7,48 ± 0,05
8,92 ± 0,01
46,09 ± 0,43
46,51 ± 0,26
46,10 ± 0,35
47,47 ± 0,08
46,76 ± 0,25
46,51 ± 0,17
45,40 ± 0,16
44,52 ± 0,04
46,10 ± 0,51
44,22 ± 0,06
7,24 ± 0,04
7,15 ± 0,25
7,41 ± 0,20
8,21 ± 0,03
8,09 ± 0,10
7,47 ± 0,04
7,87 ± 0,06
8,01 ± 0,13
7,03 ± 0,12
6,73 ± 0,36
13,49 ± 0,05
11,54 ± 0,11
10,93 ± 0,02
13,74 ± 0,02
13,80 ± 0,07
13,36 ± 0,01
11,32 ± 0,03
11,12 ± 0,03
11,33 ± 0,04
13,74 ± 0,03
2,65 ± 0,03
1,61 ± 0,02
2,67 ± 0,04
2,49 ± 0,03
2,34 ± 0,03
3,16 ± 0,01
3,19 ± 0,04
2,06 ± 0,05
2,66 ± 0,04
3,46 ± 0,06
9,18 ± 0,02
8,74 ± 0,02
8,31 ± 0,04
8,62 ± 0,02
9,37 ± 0,01
8,30 ± 0,02
8,65 ± 0,02
8,13 ± 0,01
9,49 ± 0,01
8,43 ± 0,03
3.3. Đánh giá phương pháp in vitro xác
định độ tiêu hóa protein trong thức ăn tôm
thẻ chân trắng bằng thử nghiệm in vivo
sꢀc quản lý tốt, sử dụng hệ thống sục khí liên
tục, kết hợp với sử dụng hệ thống lọc nước vào
ban đêm, đꢂng thời do thí nghiệm tiến hành thu
phân nên trong bể nuôi tôm hầu như không cꢀ
nhiều các chất cặn như thức ăn dư hay vỏ tôm
lột xác.
Trong thời gian nuôi thử nghiệm các yếu
tố môi trường đều nằm trong khoảng rất thuận
lợi cho sự sinh trưởng của tôm, trong đꢀ nhiệt
độ từ 26,2 – 28,5oC; pH: 7,2 – 8,3; DO: 6,3 –
7,3 mg/l; NH3: 0,002 – 0,18 mg/l; NO2: 0,003
– 0,019 mg/l. Nguyên nhân là do quá trình chăm
Mối tương quan giꢁa phương pháp in vitro và
phương pháp in vivo được thể hiện trong bảng 4.
Bảng 4. Bảng so sánh kết quả xác định độ tiêu hꢀa protein bằng phương pháp in vitro và in vivo
pH drop (RPD, %)
pH stat (DH, %)
Hệ 3
enzyme
Pepsin tiêu hóa (%)
Không tính
NPP
Độ tiêu hóa
biểu kiến
APD (%)
Thức
ăn
Hệ 3 enzyme
Hệ 4 enzyme
Hệ 4 enzyme
Tính NPP
TT A0
TT A4
TT A5
TT B1
TT B3
58,03 ± 0,59
60,77 ± 1,18
60,11 ± 0,00
58,54 ± 1,18
62,42 ± 3,08
75,21 ± 1,89
77,69 ± 0,60
78,01 ± 2,12
80,83 ± 1,09
80,37 ± 1,32
19,83 ± 0,53 23,90 ± 1,15 87,61 ± 0,61 84,53 ± 0,76 76,99 ± 0,51
20,92 ± 1,35 24,74 ± 0,46 89,41 ± 0,75 86,96 ± 0,92 78,64 ± 0,64
21,25 ± 1,78 22,92 ± 0,18 89,29 ± 0,75 86,94 ± 0,92 80,47 ± 1,01
20,78 ± 0,62 22,60 ± 1,39 88,57 ± 1,06 85,96 ± 1,30 78,13 ± 1,96
19,38 ± 2,11 22,49 ± 2,38 90,47 ± 0,96 88,07 ± 1,20 77,79 ± 0,72
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
133
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
TT B4
TT C3
TT C4
61,81 ± 3,63
77,86 ± 2,36
78,85 ± 1,05
78,11 ± 1,84
82,05 ± 1,05
78,94 ± 0,80
19,95 ± 0,56 24,77 ± 1,52 93,53 ± 0,39 92,17 ± 0,47 76,72 ± 1,60
60,80 ± 2,10
62,92 ± 3,00
61,25 ± 0,00
62,67 ± 1,77
18,11 ± 0,14 22,60 ± 0,14 93,07 ± 2,69 91,44 ± 3,33 75,20 ± 0,58
19,17 ± 2,32 21,90 ± 0,84 85,27 ± 1,31 81,98 ± 1,61 74,57 ± 0,55
18,63 ± 1,17 21,14 ± 1,15 87,03 ± 1,14 83,66 ± 1,44 76,02 ± 0,34
19,61 ± 1,72 23,12 ± 0,69 87,29 ± 0,72 84,29 ± 0,89 78,54 ± 3,49
TT
C4Plus
TT D3
Hệ số
tương
quan
(R2)
0,0719
0,0047
0,6664
0,1245
0,0015
0,0023
Phương
trình
y = -0,2853x
+ 94,693
y = -0,063x +
82,275
y = 1,4353x
+ 48,944
y = 0,5362x
+ 64,967
y = 0,0264x y = 0,0259x
+ 74,956 + 75,067
hồi quy
Khi so sánh giꢁa phương pháp pH drop 3
Kết quả đánh giá các phương pháp in vitro
enzyme và phương pháp pH drop 4 enzyme, cho dựa trên mối tương quan giꢁa phương pháp in
thấy cꢀ sự khác biệt đáng kể. Kết quả độ tiêu vitro và phương pháp in vivo cho thấy hệ số tương
hꢀa protein tương đối thu được từ phương pháp quan của 5 phương pháp (pH drop 3 enzyme, pH
pH drop 4 enzyme luôn cao hơn so với phương drop 4 enzyme, pH stat 4 enzyme, pepsin tiêu
pháp pH drop 3 enzyme.
hꢀa và pepsin tiêu hꢀa cꢀ tính NPP) đều thấp R2
< 0,13. Chỉ cꢀ phương pháp pH stat 3 enzyme
cho hệ số tương quan tương đối (R2 = 0,6664).
So sánh giꢁa phương pháp pH stat 3
enzyme và phương pháp pH stat 4 enzyme, cho
thấy cꢀ sự khác biệt đáng kể. Kết quả độ tiêu
Riêng đối với phương pháp pepsin tiêu hꢀa,
hꢀa protein tương đối thu được từ phương pháp cꢀ thể nhận thấy khi độ tiêu hꢀa in vitro < 90%
pH stat 4 enzyme luôn cao hơn so với phương thì các mẫu khá tuyến tính (R2 = 0,7741). Tuy
pháp pH stat 3 enzyme.
nhiên, khi protein tiêu hꢀa in vitro > 90% thì
APD lại bắt đầu giảm chứ không tăng theo. Như
vậy, cꢀ thể phương pháp pepsin tiêu hꢀa chỉ
thích hợp xác định độ tiêu hꢀa protein đối với
nhꢁng mẫu cꢀ protein tiêu hꢀa in vitro < 90%.
Cần thiết xác định trên nhiều mẫu hơn nꢁa để cꢀ
thể khẳng định điều này.
Kết quả giꢁa phương pháp pepsin tiêu hꢀa
cꢀ và không cꢀ tính hàm lượng nitơ phi protein
cho thấy không khác biệt đáng kể. Nếu tính đến
hàm lượng nitơ phi protein thì kết quả protein
tiêu hꢀa luôn thấp hơn so với khi không tính
hàm lượng nitơ phi protein.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
134
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 3. Mối tương quan giꢁa phương pháp pepsin tiêu hꢀa (< 90%) và phương pháp in vivo
IV. THẢO LUẬN
được xem là phương pháp chuꢅn để đánh giá độ
tiêu hꢀa protein trong thức ăn thủy sản. Đã cꢀ
Hiện nay, trên Thế giới vẫn chưa cꢀ phương
pháp chuꢅn xác định độ tiêu hꢀa protein trong rất nhiều nghiên cứu phát triển phương pháp in
thức ăn thủy sản, chỉ cꢀ phương pháp pepsin
tiêu hꢀa AOAC 971.09 là phương pháp xác định
đạm tiêu hꢀa trong các loại nguyên liệu cꢀ nguꢂn
gốc động vật, mà chủ yếu là bột cá. Sở dĩ như
vậy vì thức ăn hoàn toàn khác với nguyên liệu.
Thức ăn là một hỗn hợp, bao gꢂm cả nguyên
liệu cꢀ nguꢂn gốc động vật, thực vật, một số
nhà máy còn bổ sung đạm thủy phân với mục
đích tăng tính hấp dẫn. Thành phần thức ăn thì
vitro xác định nhanh protein tiêu hꢀa nhằm thay
thế phương pháp nuôi thử nghiệm in vivo. Tuy
nhiên, mối tương quan cao nhất giꢁa các kết quả
thu được từ phương pháp in vivo và in vitro chỉ
cꢀ được khi so sánh riêng biệt nguꢂn gốc của
nguꢂn đạm là đạm động vật hay đạm thực vật.
Trong nhꢁng mẫu bao gꢂm luôn cả đạm động
vật và đạm thực vật thì nhꢁng phương pháp in
vitro sử dụng enzyme cho kết quả chỉ cꢀ tính
tương đối (Pedersen & Eggum, 1983).
vô cꢄng đa dạng, các nhà máy sử dụng rất nhiều
các loại nguyên liệu khác nhau, mỗi loại nguyên
liệu lại cꢀ nhiều nguꢂn gốc khác nhau (ví dụ
như bột cá Peru cꢀ chất lượng hoàn toàn khác
Khi khảo sát, đánh giá các phương pháp in
vitro trên thức ăn tôm thẻ chân trắng, kết quả thu
được chỉ cꢀ phương pháp pH stat 3 enzyme cho
mối tương quan đáng kể (R2 = 0,6664), nhꢁng
phương pháp còn lại cho hệ số tương quan thấp
(R2 < 0,13). Kết quả này tương tự với kết quả
nghiên cứu của Pedersen & Eggum (1983) khi
2 tác giả này xem xét mối tương quan giꢁa các
phương pháp in vitro và in vivo trên mẫu thực
phꢅm. Kết quả nghiên cứu của Pedersen &
với bột cá sản xuất trong nước). Công thức phối
trộn thức ăn cũng khác nhau ở từng nhà máy,
từng thời điểm. Chính vì sự phối trộn đa dạng
của thức ăn làm cho nền mẫu thức ăn vô cꢄng
phức tạp. Ngoài ra, khả năng tiêu hꢀa của vật
nuôi còn phụ thuộc rất nhiều vào môi trường,
độ tuổi và sức khỏe. Chính vì nhꢁng điều đꢀ
mà hiện nay vẫn chưa cꢀ một phương pháp nào
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
135
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Eggum cho thấy phương pháp pH stat 3 enzyme số tương quan thấp (R2 < 0,13). Tuy nhiên, để áp
cꢀ mối tương quan với phương pháp in vivo
cao hơn so với phương pháp pH drop 3 và 4
enzyme và phương pháp pH stat 4 enzyme (R2
= 0,94). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của đề
tài cho thấy hệ số tương quan của phương pháp
pH stat 3 enzyme vẫn còn khá thấp, cần thực
hiện nhiều thử nghiệm hơn nꢁa. Theo ý kiến
của một số nhà nghiên cứu dinh dưꢃng trên thế
giới, các phương pháp in vitro dꢄng trong xác
định protein tiêu hꢀa của thức ăn thủy sản chỉ
cꢀ tính tương đối, không thể đưa ra một giá trị
chính xác mà giá trị này cꢀ thể phân biệt được
chất lượng giꢁa các mẫu thức ăn cꢀ chất lượng
tốt. Tuy nhiên, các phương pháp này cꢀ thể sử
dụng xác định đâu là mẫu thức ăn cꢀ chất lượng
rất xấu so với các mẫu thức ăn cꢀ chất lượng
tốt. Đây cũng là một cách tiếp cận cần xem xét
thực hiện.
dụng trong thực tế nhằm kiểm soát chất lượng thức
ăn, hệ số tương quan của phương pháp pH stat 3
enzyme còn tương đối thấp, cần tăng số lượng
mẫu khảo sát nhằm tăng mức độ tương quan, độ
chính xác và độ tin cậy của phương pháp.
- Đối với phương pháp pepsin tiêu hꢀa, khi
xét nhꢁng mẫu cꢀ độ tiêu hꢀa in vitro < 90%,
mối tương quan giꢁa in vitro và in vivo khá
tuyến tính (R2 = 0,7741). Đây cũng là trường
hợp cần xem xét khi tăng số lượng mẫu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
AOAC, 1999. Official methods of analysis of AOAC
international (16th ed.). Washington, DC:
Association of Official Analytical Chemists.
Buchanan R. A., 1969. In vivo and in vitro methods
of measuring nutritional value of leaf protein
preparations. Br. J. Nutr. 23, 533-544.
Dimes, L. E. & Haard, N. F., 1994. Estimation of
protein digestibility – I. Development of an in
vitro method for estimating protein digestibility
in salmonids (Salmo gairdneri). Comparative
Biochemistry and Physiology. 108A, 349 – 362.
V. KẾT LUẬN
Qua các kết quả nghiên cứu thu được, hiện
đề tài cꢀ thể đi đến một số kết luận sau:
- Kết quả xác định độ tiêu hꢀa protein và
độ thủy phân bằng các phương pháp pH drop 3
và 4 enzyme, pH stat 3 và 4 enzyme trên thức
ăn tôm thẻ chân trắng cho thấy cꢀ sự khác biệt
đáng kể giꢁa các phương pháp. Tuy nhiên, đối
với phương pháp pepsin tiêu hꢀa, việc tính hay
không tính đến hàm lượng Nitơ phi protein lại
không khác biệt đáng kể.
Ezquerra, J. M., Garcia-Carreno, F. L., Civera, R., Haard,
N. F., 1997. pH-stat method to predict protein
digestibility in white shrimp (Penaeus vannamei).
Aquaculture 157, 251 – 262.
Ford J. E. and Slater D. N., 1966. Analysis of
enzymatically digested food proteins by
Sephadexgel filtration. Br. J. Nutr. 20, 843-860.
Hsu, H. W., Vavak, D. L., Satterlee, L. D., Miller, G.
A., 1977. A multienzyme technique for estimating
protein digestibility. Journal of Food Science.
42(5), 1269 – 1271.
- Khi xem xét mối tương quan giꢁa phương
pháp in vitro và phương pháp in vivo trên thức
ăn tôm thẻ chân trắng, chỉ cꢀ phương pháp pH
stat 3 enzyme cho mối tương quan đáng kể (R2
= 0,6664), nhꢁng phương pháp còn lại cho hệ
Lazo, J. P., Romaire, R. P., Reigh, R. C., 1998.
Evaluation of three in vitro enzyme assays for
estimating protein digestibility in the Pacific
white shrimp Penaeus vannamei. Journal of the
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
136
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Satterlee, L. D., Marshall, H. F., Tennyson, J. M.,
World Aquaculture Society. 29 (4), 441 – 450.
1979. Measuring protein quality. Journal of the
American Oil Chemists’ Society 56 (3), 103-109.
Lemos, D., Lawrence, A.L., Siccardi III, A.J., 2009.
Prediction of apparent protein digestibility of
ingredients and diets by in vitro pH-stat degree of
protein hydrolysis with species-specific enzymes
for juvenile Pacific white shrimp Litopenaeus
vannamei. Aquaculture 295, 89 – 98.
Sheffner A. L., Eckfelt G. A. & Spector H., 1956. The
pepsin-digestive residue (PDR) amino acid index
of protein utilization. J. Nutr. 60, 105-120.
Siccardi III, A. J., 2006. Daily digestible protein and
energy requirements for growth and maintenance
of sub-adult Pacific white shrimp (Litopenaeus
Maga J. H., Lorenz K. & Onayemi O., 1973. Digestive
acceptability of proteins as measured by the initial
rate of in vitro proteolysis. J. Food Sci. 38, 173-
174.
vannamei).
A Dissertation for Doctor of
Philosophy (Major subject: Nutrition). Texas A &
M University.
Navarrete del Toro, M. A. & García-Carreño, F. L.,
2002. Evaluation of the progress of protein
hydrolysis. Current Protocols in Food Analytical
Chemistry. B2.2.1-B2.2.14
Sigma-Aldrich, 1993. Enzymatic assay of peptidase.
Thresher W. C., Swaisgood H. E. & Catignani G. L.,
1989. Digestibilities of the protein in various
foods as determined in vitro by an immobilized
digestive enzyme assay (IDEA). Plant Fooak for
Human Nutrition 39, 59-65.
Pedersen, B. & Eggum, B. O., 1983. Prediction of
protein digestibility by an in vitro enzymatic pH-
stat procedure. Zeitschrift für Tierphysiologie
Tierernährung und Futtermittelkunde. 49 (1-5),
265 – 277.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
137
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
STUDY ON METHODS EVALUATING PROTEIN DIGESTIBILITY OF FEEDS
FOR WHITE LEG SHRIMP (Litopenaeus Vannamei)
Nguyen Thi Lan Chi1, Nguyen Van Nguyen1, Le Thi Lam1, Vu Mai Hoa2
ABSTRACT
Protein digestibility is an important indicator in quality assessment for aquafeed ingredients. Many in vitro
assays have been developed for quick estimation of protein digestibility and replacement of feeding trials.
pH stat, pH drop and pepsin digestibility with single/multi enzyme, one/two step digestion have been studied
for mammals from 1970s. These methods have been found to correlate well with in vivo protein digestibil-
ity. However, to date, the application of in vitro assays for shrimp and fish is still not populated. Currently,
Research Institute for Aquaculture No. 2 has performed a research on quick procedures evaluating protein
digestibility of feeds for white leg shrimp. The objective of this research is to find a diagnosis tool to support
authority departments in quality control of commercial aquafeeds. In the study, five in vitro methods (includ-
ing pH drop with 3 or 4 enzyme, pH stat with 3 or 4 enzyme and pepsin digestibility) were investigated. The
results showed that only the three-enzyme pH stat method was well correlated with in vivo technique (R2 =
0,6664). The other methods had a low regression coefficient between in vitro and in vivo protein digestibility
(R2 < 0,13). However, the regression coefficient of the three-enzyme pH stat system is still not high for utiliza-
tion. Therefore, it is necessary to conduct more experiments in order to increase the correlation and accuracy.
Keywords: protein digestibility, in vitro, in vivo, pH drop, pH stat, pepsin digestibility, white leg
shrimp feeds.
Người phản biện: TS. Vũ Anh Tuấn
Ngày nhận bài: 12/9/2013
Ngày thông qua phản biện: 25/9/2013
Ngày duyệt đăng: 15/10/2013
1 Centre for Fishery Post-harvest Technology, Research Institute for Aquaculture No. 2
Email: lanchiria2@yahoo.com.vn
2 University of Science Ho Chi Minh City.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
138
12 trang
9720
Free
Bạn đang xem tài liệu "Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đạm tiêu hóa trong thức ăn tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus Vannamei)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- nghien_cuu_xay_dung_quy_trinh_phan_tich_dam_tieu_hoa_trong_t.pdf
